ここでは、好中球系統細胞の高次元質量細胞法(Time-Of-Flight、CyTOFによるサイトメトリー)分析のために、マウスまたはヒトから単離された新鮮な骨髄(BM)を処理するプロトコルを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
本稿では、BM CyTOF分析全体のために新しいBMで好中球系統細胞を保存するように最適化されたプロトコルを紹介する。このプロトコルを用いて、好中球系統細胞に焦点を当てた血統系を評価するために、骨髄バイアス39抗体CyTOFパネルを用いた。CyTOFの結果は、オープンリソースの次元低減アルゴリズムviSNEで分析され、データがこのプロトコルの結果を実証するために提示された。我々は、このプロトコルに基づいて新しい好中球系統細胞集団を発見した。新鮮な全BM調製のこのプロトコルは、1)、CyTOF分析を用いて、BM全体から未確認の細胞集団を発見し、2、白血病などの血液疾患を有する患者に対する全BM欠陥を調査し、3)の最適化を支援する。新鮮な全体BMを利用する蛍光活性化フローサイトメトリープロトコル。
概要
過去数十年の間に、サイトメトリー法はBMの人工システムを調査するための強力なツールとなっています。これらの方法には、蛍光活性化フローサイトメトリーおよび重金属標識抗体を用いたCyTOFの新しい方法が含まれる。彼らは、独自の表面マーカー発現プロファイルを同定することにより、異種生物標本における多くの細胞型の発見につながった。より多くのチャネルに関連するスペクトルの重複が増加すると、蛍光活性化フローサイトメトリーアプリケーションのデータ不正確性が高くなります。したがって、蛍光活性化フローサイトメトリー分析のために目的の細胞集団を濃縮するために、不要な細胞を日常的に除去する。例えば、Ly6G(またはGr-1)およびCD11bは成熟した骨髄細胞マーカーと見なされ、Ly6G+(またはGr-1+)およびCD11b+細胞は、フローサイトメトリー分析の前に磁気濃縮キットを使用してBMサンプルから定期的に除去される。造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)または1つのダンプカクテルチャネル1、2、3でこれらのマーカーを組み合わせることによって。もう一つの例は、好中球がヒト血液試料から日常的に除去され、免疫学的研究のために末梢血単核細胞(PBMC)を濃縮することである。しかし、マウスまたはヒトから分離され....
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プロトコル
すべての実験は、アレルギーと免疫学動物のケアと使用委員会のためのラホヤ研究所の承認されたガイドラインに従って、げっ歯類の使用のための承認は、アレルギーと免疫学のためのラホヤ研究所から記載された基準に従って得られました国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド。
1. 収穫マウス骨髄(BM)
- 商用ベンダーから C57BL/6J マウスを購入します。病原体のない施設で、標準的なげっ歯類のチョウダイエットと家をミクロイソレーターケージで養います。
- 実験目的で、生後6~10週の雄マウスを使用する。CO2吸入によって安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を起ます。
- マウスを腹部側を上にして無菌手術パッドの上に置きます。70%エタノールを噴霧することにより、腹部および後肢領域の皮膚を殺菌する。解剖外科はさみを使用して腹腔を開きます。
- 後肢を露出させるために皮膚を取り除きます。鈍い先端のドレッシング鉗子のペアを使用して、足首のすぐ下にマウス脛痛を保持します。別の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、鈍い先端のドレッシング鉗子の下の脛間を安定させます。脛骨を壊し、鈍い先端のドレッシング鉗子で筋肉を引き裂くことによって骨を露出させる。
注:脛科は膝関節にゆるやかに取り付けられ、鈍い先端のドレッシング鉗子を使用して容易に選ぶことができる。
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結果
図1は、CyTOF実験の結果として示す。このtSNEプロットでは、複数のマウス組織にまたがる細胞を、33パラメータCyTOFパネルによって測定された表面マーカー発現プロファイルの類似性に基づいてサブセットにクラスタ化した。より類似した特性を有する細胞は、各細胞の33マーカーの発現に基づいて、好中球、マクロファージ、またはDCなどの細胞を自動的に集積させた。
図2は、本研究で提示したプロトコルを用いてマウスBM CyTOF実験の実施例として提示される。プロトコルはBM全体の完全性を維持し、好中球(Ly6G +、図2A)とHSPC(CD117+、図2B)シグネチャ表面マーカーを共発現する未知の細胞集団の発見につながる。同時。この細胞集団は、当社のCyTOFパネル(図.......
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ディスカッション
過去数十年にわたり、蛍光ベースのフローサイトメトリーは、細胞系統および不均一性1、2、3を研究する主な方法として使用された。フローサイトメトリーは多次元データを提供していますが、この方法はパラメータとスペクトルの重なりの選択によって制限されます。フローサイトメトリーの弱点を克服するために、蛍光体の代わりに重金属同位体を使用して、検出器チャネル間のクロストークや細胞の自己蛍光を排除する抗体を標識するCyTOFを利用し、多くの測定を行うことができます。単一細胞レベルで同時により多くのパラメータを生成し、細胞多様性12のより深い評価を生成します。枯渇またはゲーティングプロセス中に過去に省略された細胞集団、特に好中球系統細胞のような重要な免疫細胞は、長い間均質であると考えられていた13、14、CyTOF
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
LJIフローサイトメトリーコアに対して、質量サイトメトリー手順の支援を賜りますようお礼申し上げます。この作業は、NIH助成金R01HL134236、P01HL136275、およびR01CA202987(すべてC.C.H)およびADA7-12-MN-31(04)(C.C.H.およびY.P.Z)によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CyTOF抗体 (マウス) | |||
| 抗マウスCD45 (クローン 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402;RRID:AB_961070 | |
| 抗マウスCD115 (CSF-1R) (クローン AFS98)-精製 | バイオレジェンド | ネコ# 135502;RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101;RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919;RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (クローン 9E9) - 精製 | されたバイオレジェンド | ネコ # 149502;RRID:AB_2565302 | |
| 抗マウスCD162(クローン4RA10(RUO))-精製 | BDバイオサイエンス | Cat# 557787;RRID:AB_647340 | |
| 抗マウスCD169(Siglec-1)(クローン3D6.112)-精製 | バイオレジェンド | 猫#142402;RRID:AB_10916523 | |
| 抗マウスCD182(CXCR2)(クローンSA044G4)-精製 | バイオレジェンド | 猫#149302;RRID:AB_2565277 | |
| 抗マウスCD183(クローンCXCR3-173)-精製 | バイオレジェンド | 猫#126502;RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625;RRID:AB_2563744 | |
| 抗マウスCD34(クローンMEC14.7)-精製 | バイオレジェンド | 猫#119302;RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919;RRID:AB_2565433 | |
| アンチマウス CD43 (クローン S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| アンチマウス CD48 (クローン HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| アンチマウス CD62L (クローン MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82;RRID:AB_467481 | |
| 抗マウスCD71(クローンRI7217)-精製 | バイオレジェンド | 猫#113802;RRID:AB_313563 | |
| 抗マウスCD90(クローンG7)-精製 | バイオレジェンド | 猫#105202;RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα(クローンMAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321;RRID:AB_2563768 | |
| 抗マウスGM-CSF(MP1-22E9(RUO))-精製 | BDバイオサイエンス | Cat#554404;RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003;RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (SCA-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457;RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637;RRID:AB_2563784 | |
| 抗マウス NK1.1 (クローン PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| 抗マウス Siglec-F (クローン E50-2440 (RUO))-精製 | BD Biosciences | Cat# 552125;RRID:AB_394340 | |
| 抗マウスTCR&β;(クローンH57-597)-143Nd | Fluidigm | (クローンH57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells(クローンTER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241;RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / 転写因子染色バッファーセット | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone リン酸緩衝生理食塩水 | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-IR | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR 抗体ラベリングキット | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| アジ | 化ナトリウムシグマ・アルドリッチ | Cat# S2002 | |
| トリトン X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-CL | |
| 実験モデル: Organism/Stockins | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | ||
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten andヒントン, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
参考文献
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
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