このプロトコルの目的は、感染後にマウスの複数の器官からジカウイルスを分離および定量化することによってウイルス性疾患を調査するために使用される技術を実証することです。
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方法論記事
マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
提示されている方法は、ジカウイルス感染動物からの臓器の単離およびウイルス負荷の定量化のための実験室手順を示す。この手順の目的は、感染後の異なる時点または異なる実験条件下でマウスの末梢およびCNS領域におけるウイルス力を定量化し、ジカウイルス感染を調節するウイルス学的および免疫学的要因を同定することです。実証された臓器分離手順は、ウイルス力価の焦点形成アッセイ定量と定量的PCR評価の両方を可能にする。急速な器官の隔離の技術はウイルスの間数の維持のために設計されている。フォーカス形成アッセイによるウイルスチター定量は、ジカウイルスの迅速なスループット評価を可能にする。焦点形成アッセイの利点は、感染性ウイルスの評価であり、このアッセイの限界は、検出の限界を減少する器官毒性の可能性である。ウイルス価価評価は定量的PCRと組み合わせられ、臓器内の組換えRNAコピー制御ウイルスゲノムコピー数を使用して検出の限界を低く評価する。全体的にこれらの技術は、ジカウイルス感染動物の周辺およびCNSにおけるジカウイルス力挙子の分析のための正確な迅速な高スループット法を提供し、ほとんどの感染動物の器官におけるウイルス力中剤の評価に適用することができるデングウイルスを含む病原体。
概要
ジカウイルス(ZIKV)は、フラボリダ科に属するアルボウイルスであり、ポワッサンウイルス(POWV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、および西ナイルウイルス(WNV)1などの重要な神経侵襲性ヒト病原体を含む。その隔離と同定に続いて、アフリカとアジア2、3、4、5、および中南米内の流行のヒトZIKV感染の定期的な報告があった(参照6)しかし、ZIKVが重篤な疾患7を引き起こすと考えられていたのは最近になってからでした。現在、ZIKV感染に関連する神経疾患および出生時欠損の症例が数千例ある。ZIKVの急速な出現は、疾患の重症度の増加がある理由、ZIKV感染に対する免疫学的反応とは何か、神経学的増加に関連するウイルスおよび/または免疫媒介病理があるか、に関連する多くの疑問を引き起こしている。症状と出生時欠損。現在、ZIKVに関連する中枢神経系(CNS)関連疾患と、ZIKVに対する抗ウイルスおよびワクチンの有効性を迅速にテストする必要性を理解するラッシュがあります。このような背景から、ZIKV特異的フォーカス成形アッセイ(FFA)を用いた周辺および....
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プロトコル
本研究のすべての手順は、セントルイス大学動物ケア・使用委員会が定めたガイドラインに従っています。SLUは、ラボアニマルケアインターナショナル(AAALAC)の評価と認定協会によって完全に認定されています。
1. 臓器分離
注:ウイルスは室温(RT)で安定していないため、一度に採取した動物の数は、ウイルスの水位を維持するために慎重に計画する必要があります。
- 選択した用量および経路を使用してマウスに感染し、必要な表現型に基づく。このプロトコルでは、8-10週齢の男性および雌型Iインターフェロン受容体欠損(Ifnar1-/-)C57BL/6マウスに感染する。
- ケタミン(90mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)のカクテルでIfnar1-/-マウスを麻酔する。麻酔を確認するためにしっかりしたつま先のピンチによるテストペダル反射。フットパッドを介して50μL皮下(SC)でZIKVの1 x 105フォーカス形成ユニット(FFU)を投与する。
- 前日の収穫に必要なすべての材料を準備する:ツールの消毒のための50 mL円錐形で2ハサミ、鉗子と70%エタノール(EtOH)の20 mL。 ....
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結果
上記のIfnar1-/-マウスを用いてZIKV力電力を評価し、フットパッドへの皮下(SC)注射を介してZIKV(PRVABC59)に感染した。ここで、ZIKVの1 x 105 FFUを8〜12週齢のIfnar1-/-マウスSCに投与しても致死的ではないが、ウイルスは周辺およびCNSの両方で複製することができる。この用量および経路は、宿主病原体免疫応答および病原性を研究するために使用される。8-12週齢のIfnar1-/-マウス静脈内注射(IV)注射に対するZIKVの1 x 105 FFUの投与は80〜100%致死的であり、動物はウイルス注射後8〜14日の間に感染に屈する。この投与経路を日常的に使用して、抗ウイルス薬や治療薬の有効性、ならびに前臨床ワクチン候補試験の有効性を判断します。
10-.......
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ディスカッション
ZIKV感染は神経疾患を引き起こす可能性があるため、現在の動物モデルは、ワクチンおよび抗ウイルス剤の病因、免疫応答および保護有効性を研究するために、CNS内のウイルス制御に焦点を当てる必要がある。CNS疾患に焦点を当てる上での課題の一つは、多くの場合、末梢感染症の研究を犠牲にして来るということです。ここで提案される臓器分離方法は、CNS媒介性ZIKV関連疾患を評価し、抗ウイルス薬、治療および前臨床試験のためのモデルを確立するために、周辺およびCNSの両方でZIKV感染を迅速に評価する必要性に焦点を当てています。ワクチン。この技術の付加的な利点はまた、ZIKVに対する免疫学的応答の組み合わせ研究や感染の組織学的分析を含む、高い柔軟性を可能にすることです。この技術は、ZIKVだけに限定されるものではなく、デングウイルス21などのフラビウイルス、サルポックスおよびエトロメリアのようなオルソポックスウイルスを含む宿主病原体相互作用の範囲を研究するために普遍的に適用することができる。この収穫技術の考慮事項と欠点は、主に実験者の能力に焦点を当てる。ZIKVは室温で長期間安定していないため、灌流後の臓器.......
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開示事項
著者は開示するものが何もない
謝辞
ピント博士は、セントルイス大学医学部のシード助成金とセントルイス大学医学部のスタートアップ資金から資金を提供しています。ブライアン博士は、NIH NIAIDからK22AI104794早期調査者賞とセントルイス大学学校からの種子助成金によって資金提供されています。資金提供を受けたすべての個人に対して、資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に役割を持ちなかった。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1-ブロモ-3-クロロプロパン (BCP) | MRC 遺伝子 | BP151 | |
| 10 cc シリンジ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BD 309642 | |
| 18 G ニードル | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 22-557-145 | |
| 1 cc TB シリンジ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14-823-16H | |
| 20 cc シリンジ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 05-561-66 | |
| 24チューブビーズミル | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15 340 163 | |
| 3.2 mmステンレス鋼ビーズ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | NC9084634 | |
| 37 >C 組織培養インキュベーター | Nuair | 5800 | |
| 4G2 抗体 | |||
| 96ウェル平底プレート | Midsci | TP92696 | |
| 96ウェル丸底プレート | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL エッペンドルフチューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 02-682-002 | |
| 濃縮殺菌漂白剤 | ステープル | 30966CT | |
| CTL S6アナライザー | CTL | CTL S6 ユニバーサルアナライザー | |
| 湾曲カッティングハサミファイン | サイエンスツール | 14061-11 | |
| Dulbecco 'のモディファイドイーグル」s 中 - 高グルコース 4,500 mg/L グルコース | MilliporeSigma | D5671 | |
| エタノール (分子生物学グレード) | MilliporeSigma | e7023 | |
| ウシ胎児血清 | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11036-20 | |
| 氷酢酸 | MilliporeSigma | 537020 | |
| ヤギ抗マウスHRP標識抗体 | ミリポアシグマ | 8924 | |
| HEPES 1 M | ミリポアシグマ | H3537-100ML | |
| イソプロパノール(分子生物学グレード) | ミリポアシグマ | I9516 | |
| ケタミン/キシラジンカクテル | 比較医学 | ||
| L-グルタミン | ミリポアシグマ | g7513 | |
| マグマックス RNA精製キット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM1830 | |
| メチルセルロース | ミリポアシグマ | M0512 | |
| 微量遠心機 | エペンドルフ | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA チューブ | バイオワン | 450480 | |
| O リングチューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21-403-195 | |
| ワンステップ q RT-PCR ミックス | サーモフィッシャー科学 | 4392938 | |
| パラホルムアルデヒド | サーモフィッシャーサイエンティフィ | EMS- 15713-S | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | ミリポアシグマ | d8537-500ml | |
| プロリン マルチチャンネルピペット | ザルトリウス | 72230/72240 | |
| プロリン シングルチャンネルピペット | ザルトリウス | 728230 | |
| RNAse フリーウォーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC 遺伝子 | RB192 | |
| ロッキングプラットフォーム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | フィッシャー | MT10040CV | |
| サポニン | ミリポアシグマ | s7900 | |
| スプーン/スパチュラ | ファインサイエンスツール | 10090-17 | |
| ストレートカッティングハサミ | ファインサイエンスツール | 14060-11 | |
| トリトン X-100 | ミリポアシグマ | t8787 | |
| トゥルーブルー基板 | VWR | 95059-168 | |
| トリプシン | ミリポアシグマ | t3924-100ML |
参考文献
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tr....
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再版と許可
