方法論記事

ラパマイシン/mTOR相互作用を研究するための半定量薬物アフィニティ応答性標的安定性(DARTS)アッセイ

DOI：

10.3791/59656

⸱

2019年8月27日

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1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、タンパク質安定性の変化をモニタリングし、タンパク質リガンド相互作用の親和性を推定することにより、DARTS実験のデータ解析能力を強化した。相互作用は、プロテオティック曲線と線量依存曲線の 2 つの曲線にプロットできます。例示的なケースとしてmTOR-ラパマイシン相互作用を用いてきた。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

薬物アフィニティ応答性標的安定性(DARTS)は、新規の低分子タンパク質標的を検出するための堅牢な方法です。これは、既知の低分子タンパク質相互作用を検証し、天然物の潜在的なタンパク質ターゲットを見つけるために使用することができます。他の方法と比較して、DARTSは、ネイティブ、未修飾、低分子を使用し、シンプルで操作が簡単です。本研究では、タンパク質安定性の変化をモニタリングし、タンパク質リガンド相互作用の親和性を推定することにより、DARTS実験のデータ解析能力をさらに強化した。タンパク質-リガンド相互作用は、タンパク質溶解曲線と用量依存曲線の2つの曲線にプロットすることができる。我々は、プロトコルを確立するための模範的なケースとしてmTOR-ラパマイシン相互作用を使用している。プロテオ溶解曲線から、プロナスによるmTORのプロテオ溶解がラパマイシンの存在によって阻害されたことが分かった。用量依存性曲線により、ラパマイシンとmTORの結合親和性を推定することができました。この方法は、新規の標的タンパク質を正確に同定し、薬物標的エンゲージメントを最適化するための強力でシンプルな方法である可能性が高い。

概要

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低分子標的タンパク質の同定は、潜在的な治療薬1,2,3の機械的理解と開発に不可欠である。アフィニティクロマトグラフィーは、低分子の標的タンパク質を同定するための古典的な方法として、良好な結果4,5を得た。しかし、この方法には限界があり、その点では、小分子の化学的修飾は、結合特異性または親和性の低下または変化をもたらすことが多い。これらの限界を克服するために、最近、いくつかの新しい戦略が開発され、小分子の化学修飾なしで低分子標的を同定するために適用されています。標識のない低分子の標的同定のためのこれらの直接的な方法には、薬物親和性応答性標的安定性(DARTS)6、酸化速度からのタンパク質の安定性(SPROX)7、細胞熱シフトアッセイ(CETSA)8が含まれる。 、9、および熱プロテオームプロファイリング(TPP)10.これらの方法は、天然の未修飾の低分子を使用し、標的タンパク質11を見つけるために直接結合相互作用のみに依存しているため、非常に有利である。

これらの新しい方法の中で、DARTSは、ほとんどのラボ12、13で簡単に採用することができる比較的簡単な方法論です。DARTSは、リガンド結合タンパク質が非結合タンパク質に対する酵素分解に対する修飾感受性を示す概念に依存する。新しい標的タンパク質は、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)を介してSDS-PAGEゲル内の改変バンドを調べることによって検出することができる。このアプローチは、天然物および医薬品の未知の標的の同定に成功した 14,15,16,17,18,19.特定のタンパク質20、21への化合物の結合をスクリーニングまたは検証する手段としても強力である。本研究では,低分子によるタンパク質安定性の変化をモニタリングし,タンパク質リガンド結合親和性を同定することによって実験の改善を提示する.mTOR-ラパマイシン相互作用を例にして、我々のアプローチを実証する。

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プロトコル

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1. 細胞の収集とlyse

  1. 10%の胎児牛血清、2 mMグルタミンおよび1%の抗生物質とダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を使用して293T細胞を成長させます。培養物を5%CO2以下の37°Cでインキュベートする。
    注:細胞の増殖状態は、その後の実験の安定性に影響を与える可能性があります。
  2. 80\u201290% コンフルエンスに達するまで培養中の細胞を拡張します。
  3. 細胞分解試薬の345 μL(材料表参照)を20倍プロテアーゼ阻害剤カクテルの25μL、フッ化ナトリウムの25μL、100mMβ-グリセロリン酸の50μL、50μLの50μLのピロリン酸ナトリウム、および200mMMの5μLを混合する。氷の上でリシスバッファーを冷やしておいてください。
    注:様々な洗剤を含む他のリシスバッファー(例えば、トリトンX-100またはNP-40)は、それらが非脱型である限りDARTSと一緒に使用することができます。膜タンパク質または核タンパク質は、細胞リサートに0.4%のトリトンX-100または0.4%のNP-40を添加することによって抽出することができる。
  4. 冷たいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で細胞を2回洗います。
  5. 細胞スクレーパーを使用して、適切な量の細胞リシスバッファーで細胞を収集し、1.5 mLチューブにライシングセルを移します。
    注:各DARTS実験に必要な細胞の数は、様々な細胞株から抽出できるタンパク質の量によって異なります。一般に、使用されるリサートのタンパク質濃度は4\u20126 μg/μLの間である。85\u201290%合流で293T細胞の10cmプレートを1枚、300 μLのリシスバッファーでlysateをライスすると、通常、約5μg/μLのタンパク質濃度を有するリサートをもたらす。
  6. ライシスバッファー/ライシング細胞をよく混合し、10分間氷の上にチューブをインキュベートします。
  7. 4°Cで10分間18,000×gでチューブを遠心分離します。
  8. 上清を新しい1.5mLチューブに移し、氷の上で冷やしておきます。
  9. ライサテのタンパク質濃度を近似するためにBCAアッセイを行います。

2. タンパク質を低分子でリサテスインキュベートする

  1. ライサテスの99 μLを2本の1.5mLチューブに分割します。
  2. 10mMの小分子の開始ストック濃度を作ります。DARTSを行う場合、最適な結合を確保するために、より高い濃度の低分子(5\u201210x EC50値)から始まりてもよい。
    1. 小分子が溶解性である溶媒の1 μLまたはリサートの各アリコートに小分子ストック溶液の1 μLを添加します。30\u201260分の溶液で細胞を揺さぶり室温でインキュベートします。
  3. 氷上で、1x TNC(10x TNCバッファーの1mLの場合は、300μLの超純水を5ΜLの塩化ナトリウム、100μLの100μL)で解凍した新解凍したプロナス溶液のシリアル希釈(1:200、1:400、1:800、1:1600)を確立します。、および 1 M トリス-HCl、pH 8.0 の 500 μL)
  4. プロナセ:タンパク質比の広い幅を調べて(例えば、1:100から1:2000まで及ぶ)、ターゲットに対するプロナスのステップワイズ効果の観察可能性を保証します。
    注: プロナス濃度を計算する (例): 5 μg/μL タンパク質濃度 x 20 μL サンプル = 100 μg タンパク質.プロナス:タンパク質比1:100の場合は、0.5 μg/μL(100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL)のプロナス溶液が必要です。この実験は、適切な範囲のプロナス:タンパク質比を得るために数回繰り返す必要があるかもしれない。

3. プロテオシスの実行

注:プロテオシスの場合、特に断りのない限り、手順は室温で行われます。

  1. 小分子でインキュベーションした後、各アリコートを20 μLサンプルに分割します。
  2. 特定の間隔(30秒ごと)に各サンプルにプロナス溶液の範囲の2 μLを追加します。同じ体積の 1x TNC バッファーを使用して、未消化制御サンプルを確立します。
  3. 5\u201220分後、冷たい20倍プロテアーゼ阻害剤カクテルの2μLを加えて消化を停止し、30sごとによく混合し、10分間氷の上でインキュベートします。
  4. 5x SDS-PAGE負荷バッファの適切な容積でサンプルを希釈し、95°Cで5分間沸騰させます。
  5. 実験の次の部分を行うか、タンパク質サンプルを−80°Cで保存する。

4. 定量化と分析

  1. DARTSの後、以前に公開されたプロトコル22に従ってクーマッシーブルー染色を行う。
  2. 染色されたタンパク質バンドは、染色後に非常に明確でなければなりません。使用したデステイン溶液を注ぎ、ゲルをカバーするために新鮮な1%酢酸溶液を追加します。ゲルを光の下に置き、小分子(サンプル群)または(対照群)を有する群間に有意な差があるバンドを観察する。
  3. 無菌の器械とゲルから2つの対応するバンドを切り取り、すぐにLC-MS/MSを行う。
    注:LC-MS/MSは、ゲル内のタンパク質が継続的に分解されるため、できるだけ早く行う必要があります。
  4. バンドを消化し、ペプチドを抽出し、LC-MS/MS分析23を実行する。
    1. LC-MS/MSデータを解析するには、まず個々のバンド内のすべてのタンパク質を同定します。第二に、ペプチドスペクトルマッチ(PSM)を使用して、各タンパク質の豊富さを表す。
      注:PSMは、タンパク質について同定されたペプチド配列の総数を提供します。一般に、ペプチドが同定/配列決定される頻度は、サンプル中のタンパク質の量の大まかな推定として使用することができる。対照群上のサンプル群に濃縮されたタンパク質は、目的のタンパク質である。
  5. 選択したタンパク質の一次抗体を調達する。ウェスタンブロットを実行して、小分子が潜在的な標的タンパク質24に直接結合できることを確認する。
    1. 8%のSDS-PAGEゲルのウェルに同量のタンパク質を適切な分子量マーカーと共にロードします。ゲルを80Vで30分間実行し、電圧を120Vに調整し、1\u20122 hの実行を続けます。
  6. 画像処理および解析ソフトウェアを使用して、異なる標的タンパク質バンドを定量化します(材料の表を参照)。
  7. データを分析し、曲線を描画します。
    1. 標的タンパク質に対するタンパク質溶解曲線の決定
      1. プロナーゼ:タンパク質比は、タンパク質分白を行う際に変化する。未消化バンドに対応するバンド強度値を100%に帰属することにより、画像解析からのデータを正規化します。
      2. 統計解析と描画ソフトウェアの非線形回帰解析を使用して、相対バンド強度とプロナセ:タンパク質比の正規化データの曲線をプロットします。
      3. まず、ソフトウェアを開き、テーブルとグラフの種類を XY として選択し、並べてサブ列に 3 つのレプリケート値を許可します。次に、x と y の下のスペースに対応するデータを入力します。x の下に、数値 0、1、2、3、4、5 を入力します (プレースホルダーとして対応するプロナス:タンパク質比)。
      4. y 列に、相対バンド強度の正規化されたデータを入力します。「非線形回帰」を実行し、「ログ(アゴニスト)対応答-可変傾斜(4つのパラメータ)」方程式を使用して「線量応答刺激」を実装します。
      5. 曲線内の X 軸のアニテーションを対応する pronase:タンパク質比に変換します。
    2. 標的タンパク質に対する用量依存性曲線の決定
      注:用量依存性分析では、小分子のモルラ性はサンプル間で異なります。安定したプロナセ:タンパク質比は、タンパク質分析データの分析によって通知されるべきである。プロナーゼ:タンパク質化曲線中の標的タンパク質強度の最大差を示したタンパク質比は、用量依存性実験に使用されるべきである。
      1. 画像解析ソフトウェアを使用して、異なる標的タンパク質バンドを定量します。線量依存曲線の生成と同様に、最も消化されていないバンドに対応するバンド強度値を 100% に帰属して画像解析からのデータを正規化します。
      2. 統計解析および描画ソフトウェア内の非線形回帰分析を正規化されたデータに適用します。まず、ソフトウェアを開き、テーブルとグラフの種類を XY として選択し、3 つの反復値を並べてサブ列に入力します。
      3. 次に、x と y の下のスペースに対応するデータを入力します。'x' 変数の場合、小分子の異なる濃度を入力します。'y' には、相対帯強度に対応する正規化されたデータが含まれます。
      4. X = Log(X)を使用して x 値を変換します。最後に、非線形回帰を採用し、「ログ(アゴニスト)対応答-可変勾配(4つのパラメータ)」方程式を使用して線量応答刺激を実装します。

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結果

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実験のフローチャートを図1に概説します。クマシーブルー染色の結果を図2に示します。小分子とのインキュベーションは、プロテオシスに対する保護を与えます。車両制御上のラパマイシンによるインキュベーションによって保護されているように見える3つのバンドが見つかりました。プロテオティック曲線実験の期待される結果を図3に示す。原理の証明として、薬物ラパマイシン25の標的であるよく研究されたタンパク質mTORを調べた。ウェスタンブロッティングは、低プロナスにおけるmTORタンパク質の存在を示す:タンパク質比および増加率との減少および損失(図3A)。プロナーゼによるmTORのプロテオ溶解は、ラパマイシンの存在によって明らかに阻害され、ラパマイシンの添加は、プロテオティック曲線の明らかなシフトを生成する(

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ディスカッション

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DARTSは、分解に対するタンパク質結合の保護効果を利用することにより、低分子標的の同定を可能にします。DARTSは、小分子26の化学修飾または固定化を必要としない。これにより、小分子を使用してタンパク質標的を直接結合させることができます。古典的なDARTS法の標準評価基準には、ゲル染色、質量分析およびウェスタンブロッティング12、13が含まれる。古典的な方法論はまた、これらのデータを定量的に分析することができると言及していますが、そのような例は提供されていません。ここでは、細胞熱シフトアッセイ(CETSA)の原理を用いてデータを半定量的に分析し、DARTS分析8の有用性を高めるCESTA(TmおよびEC50)が提供するパラメータと同様のパラメータを取得する。リガンド-ターゲット相互作用は、タンパク質比に対してプロットすることができ、タンパク質溶解曲線の明らかなシフトを表示します。異なるプロナーゼを用いてタンパク質分解を行う:...

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、NIH研究助成金R01NS103931、R01AR062207、R01AR061484、およびDOD研究助成金W81XWH-16-1-0482によって部分的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100X プロテアーゼ阻害剤カクテルSigma-AldrichP8340超純水で 20X に希釈
293T 細胞株ATCCCRL-3216DMEM 培地 10% FBS
酢酸Sigma-AldrichA6283
BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225
塩化カルシウムSigma-AldrichC1016
セルスクレーパーサーモフィッシャー179693
クーマシー ブリリアントブルー R-250 染色液バイオ・ラッド1610436
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma-AldrichD2650
GraphPad プリズムGraphPad ソフトウェアVersion 6.0統計解析・描画ソフトウェア
Sigma-AldrichH1758
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.52画像処理・解析ソフトウェア
M-PER Cell Lysis ReagentThermo Fisher78501
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)CorningR21-040-CV
PronaseRochePRON-RO10 mg/ml
Nadiumchloride Sigma-AldrichS7653
フッ化ナトリウムSigma-AldrichS7920
オルトバナジン酸ナトリウムSigma-Aldrich450243
ピロリン酸ナトリウムSigma-Aldrich221368
Trizma塩基Sigma-AldrichT1503pH 8.0
&β;-グリセロリン酸Sigma-AldrichG9422
に調整

参考文献

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