このプロトコルの目的は、ショウジョウバエメラノガスターにおける生体内実験の設計と性能を概説し、ヒト疾患に関連する希少遺伝子変異体の機能的影響を評価することです。
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方法論記事
ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
シーケンシング技術の進歩により、全ゲノムデータセットと全エキソメデータセットは、臨床診断と最先端のヒト遺伝学研究の両方でアクセスしやすくなりました。これらのデータセットで同定された変異体の病原性を予測するために多くのシリコアルゴリズムが開発されているが、特に誤った意味で、特定のゲノム変異体がタンパク質機能に与える影響を決定するには、機能的研究が重要である。バリアント。未診断疾患ネットワーク(UDN)およびその他の希少疾患研究コンソーシアムでは、ショウジョウバエ、C.エレガンス、ゼブラフィッシュ、マウスを含むモデル生物(MO)が、ヒト疾患を引き起こす原因の機能を評価するために積極的に使用されています。バリアント。このプロトコルは、UDNのモデル生物スクリーニングセンターショウジョウバエコアで使用される希少ヒト変異体の機能評価のための方法を説明する。ワークフローは、複数のパブリックデータベースから人間とMOの情報を収集することから始まり、MARRVELウェブリソースを使用して、バリアントが患者の状態に寄与する可能性があるかどうかを評価し、利用可能に基づいて効果的な実験を設計します。知識とリソース。次に、遺伝ツール(例えば、T2A-GAL4およびUAS-ヒトcDNAライン)が、ショウジョウバエに関心のある変異体の機能を評価するために生成される。これらの試薬の開発に際して、救助および過剰発現実験に基づく2極機能アッセイを行い、バリアント機能を評価することができます。救助分岐では、内因性フライ遺伝子は、直視性ショウジョウバエ遺伝子を参照または変異型ヒトトランスジーンに置き換えることによって「ヒト化」される。過剰発現分岐では、参照および変異体のヒトタンパク質は、種々の組織において外因性駆動される。いずれの場合も、任意の可視表現型(例えば、致死性、眼の形態、電気生理学)は、目的の疾患に関係なく、読み出しとして使用することができる。参照対立と変異対立性の間で観察された差異は、バリアント特異的効果を示唆し、したがって病原性の可能性が高い。このプロトコルは、既知および未知の機能を有する遺伝子の有病種のヒト疾患を引き起こす変異体の迅速な、生体内評価を可能にする。
概要
稀な疾患を持つ患者は、正確な診断1を得るために「診断オデッセイ」と呼ばれる困難な旅をしばしば受ける。ほとんどの希少疾患は、強い遺伝的起源を持っていると考えられています, 遺伝的/ゲノム分析は、臨床ワークアップの重要な要素を作ります.染色体マイクロアレイに基づく候補遺伝子パネルシーケンシングおよびコピー数変動解析に加えて、全エキソメ(WES)および全ゲノムシーケンシング(WGS)技術は、過去10年間でますます価値のあるツールとなっています2, 3.現在、WESおよびWGSにおける既知の病原性変異体を同定するための診断率は〜25%(小児症例では高い)4、5である。臨床WES/WGSの後に未診断のままであるほとんどの場合、一般的な問題は、多くの候補遺伝子と変異体があることです。次世代シーケンシングは、多くの遺伝子で新規または超希少な変異体を識別することが多く、これらの変異体が疾患発現型に寄与するかどうかを解釈することは困難です。例えば、遺伝子のほとんどのナンセンスまたはフレームシフト変異は、エンコードされた転写物のナンセンス媒介的な崩壊による機能喪失(LOF)の対遺物であると考えられているが、最後のエキソンで見つかった切り捨て変異はこのプロセスをエスケープし....
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プロトコル
1. ヒトおよびMO情報の収集:ショウジョウバエにおける疾患表現型と機能的研究の実現可能性に対する関心の変異体の可能性
- 広範なデータベースおよび文献検索を実行して、目的の特定の遺伝子および変異体が、対象患者の表現型を説明するのに適しているかどうかを判断する。具体的には、以下の情報を収集します。
- 目的の遺伝子が以前に他の遺伝性疾患(既知の疾患遺伝子の意味的な拡張)に関与しているか、または全く新しい疾患候補遺伝子であるかどうかを評価する[不確定意義の遺伝子変異体(GVUS)]。
- 疾患または制御集団データベースにおける関心の変異体の対立頻度を評価する。
- この遺伝子を疾患または制御集団データベースに含むコピー数変動(CNV)があるかどうかを評価します。
- マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、C.エレガンス、酵母を含む異なるMO種のオルソロゴス遺伝子がどのようなものであるかを評価し、これらのオルソロゴス遺伝子の既知の機能および発現パターンをさらに調べる。
- 目的の変異体がタンパク質の機能ドメインに存在するかどうか、および目的とするアミノ酸が進化的に保存されているかどうかを評価します。
注: これらの 5 つの質問 (手順 1.1.1-1.1.5) への回答は、多数の人間および MO デ....
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結果
神経発達型に関連するEBF3におけるデノボミスセンス変異体の機能的研究
低血圧、運動失調、世界的な発達遅延、発現性言語障害を含む神経発達表現型を有する7歳の男性において、国立衛生研究所の医師およびヒト遺伝学者(UDP)。EBF3(早期B細胞因子3)15におけるデノボ誤知覚変異体(p.R163Q)を同定し、COE(コリアー/嗅覚-1/早期B細胞因子)ファミリー転写因子をコードする遺伝子を同定した。このケースは、機能的研究のために2016年3月にUDN MOSCに提出されました。この遺伝子がこの場合の良い候補であるかどうかを評価するために、MOSCはOMIM、ClinVar、ExAC(現在はgnomADに拡張)、ジェノ2 MP、DGV、およびDECIPHERからヒトの遺伝的およびゲノム情報を収集しました。さらに、主要なMO種のオルソロゴス遺伝子は、DIOPTツールを用いて同定された。その後、個々のMOデータベース(ワームベース、フライベース、ZFIN、MGIなど)からの遺伝子発現.......
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ディスカッション
ショウジョウバエメラノガスターを用した実験的研究は、疾患関連ヒト変異体の結果を評価するための堅牢なアッセイシステムを提供する。これは、過去1世紀89年にフライフィールドの多くの研究者によって生成された知識と多様な遺伝的ツールの大規模なボディによるものです.しかし、他の実験システムと同様に、存在する注意事項と制限事項を認識することが重要です。
データ マイニングに関連する注意事項
このプロトコルの最初のステップは、対象遺伝子に関連する情報のためにデータベースをマイニングすることですが、出発点としてのみ使用することが重要です。例えば、バリアント関数のシリコ予測では貴重な洞察を提供しますが、これらのデータは常に注意して解釈されるべきです。すべての主要なアルゴリズムは、ヒトの変異体が良性であると予測するいくつかの例がありますが、ショウジョウバエの機能的研究は明らかにそのような変異体24の有害な性質を実証しました。同様に、.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
私たちは、原稿の批判的な読み取りのためにホセサラザール、ジュリア王、カレン・シュルツ博士に感謝します。我々は、ここで議論したTBX2変異体の機能特性に関して、ニン・リウ博士とXi Luo博士を認める。未診断疾患ネットワークモデル生物スクリーニングセンターは、国立衛生研究所(NIH)共通基金(U54 NS093793)を通じて支援されました。H. T. C. はさらに、NIH[CNCDP-K12 および NINDS(1K12 NS098482)]、米国神経学アカデミー(神経科学研究助成金)、バロウズウェルカム基金(医学科学者キャリア賞)、児童神経学会および小児神経学財団()PERFエルターマン助成金)とNIHディレクターの早期独立賞(DP5 OD026426)。M.F.W.はサイモンズ財団(SFARI賞:368479)によってさらに支援されました。S.Y.はさらに、NIH(R01 DC014932)、サイモンズ財団(SFARI賞:368479)、アルツハイマー病協会(新研究者研究助成金:15-364099)、ナマン家族基礎研究基金、キャロライン・ウィーズ研究のための法律基金によってさらに支援されました。分子医学BCMの共焦点顕微鏡検査は、NIHグラントU54HD083092によって知的発達障害研究センター(IDDRC)神経可視化コアに一部サポートされています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Drosophila UAS-human cDNA transgenesis | |||
| Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
| Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
| Plasmid DNA | |||
| Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
| Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
| 分子生物学キットおよび試薬 | |||
| アガロース | Sigma-Aldrich | #A2790 | 特異的試薬:アガロース(分子生物学グレード) |
| 化学的にコンピテントな細胞(E.coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent:DH5α |
| DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
| DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
| High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
| Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | 特異的試薬:Gateway BP Clonase kit |
| リコンビナーゼ媒介クローニングシステム | Thermo Fisher | #11791100 | 特異的試薬:Gateway LR Clonase II 酵素キット |
| Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent:Quick Change II Mutagenesis kit |
| electroretinogram Rig 関連機器 | |||
| ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
| ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
| ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |
参考文献
- Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
- Lupski, J. R., et al. Whole-Genome S....
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再版と許可
