方法論記事

変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

DOI：

10.3791/59666

⸱

2019年6月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以下の手順は、マウス背部皮膚における melanocytic 腫瘍開始の空間的および時間的な制御のための方法を説明する、遺伝子操作されたマウスモデルを使用する。このプロトコルは、肉眼的および微視的な皮膚黒色腫の開始を記載する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

皮膚黒色腫は、最も攻撃的な皮膚癌としてよく知られている。リスク要因と主要な遺伝的変化は、増加する深さで文書化され続けているが、皮膚黒色腫の発生率は、近年の間に急速かつ連続的な増加を示している。効果的な予防方法を見つけるためには、皮膚における黒色腫開始の初期段階を理解することが重要です。以前のデータは、成体皮膚組織における濾胞性メラノサイト幹細胞 (MCSCs) が発癌突然変異および遺伝的改変を発現するときに起源のメラノーマ細胞として作用し得ることを実証した。黒色腫の発生しやすい MCSCs から生じる腫瘍形成は、静止状態から能動的に MCSCs 移行するときに誘発されます。黒色腫を起こしやすい MCSCs におけるこの移行は、毛包幹細胞の活性状態または紫外線 B (UV-B) のような外因性の環境因子の変調によって促進することができる。これらの因子は、実験室で化学脱毛によって人工的に操作することができ、毛包幹細胞および MCSCs を静止から活性状態に移行させ、卓上型光を用いて UV-B 曝露を引き起こす。これらの方法は、マウス背部皮膚における皮膚黒色腫開始の空間的および時間的な制御を成功させる。したがって、これらの in vivo モデルシステムは、皮膚黒色腫の開始の初期段階を定義するのに有益であり、腫瘍予防のための潜在的な方法を試験するために使用することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Melanocytic 腫瘍の悪性の形態である黒色腫は、皮膚悪性黒色腫を有する皮膚において最も攻撃的な癌であり、大部分の皮癌の死亡に関与している1.米国では、黒色腫は一般的に診断されます。20182の推定新癌症例の中でも 5番目から 6番目の最も一般的な癌型であると予測される。さらに、全体的な癌の発生率は、ここ数十年で徐々に減少している傾向を示しているが、過去数十年の間に皮膚黒色腫の発症速度は、両性2の連続的かつ急速に増加することを示している。

皮膚黒色腫に対してより効率的に対処するためには、臨床的に有効な予防的方法をよりよく特定するために、黒色腫の発生の初期の事象をその起源細胞から明確に理解することが重要である。成体幹細胞は、皮膚組織3、4、5を含む多くの異なる種類の器官において癌の細胞起源として腫瘍形成に有意に寄与し得ることが現在知られている。同様に、マウス背部皮膚における成人メラニン細胞幹細胞 (MCSCs) は、 Ras/RafおよびAkt経路6の異常な活性化の際に起源のメラノーマセルとして働くことができる。しかし、これらの発癌変異単独では、静止 MCSCs から腫瘍形成を効率的に誘導することはできない。 Melanocytic 腫瘍は、最終的に自然な髪のサイクリング中にアクティブになるときに発症します。しかし、このプロトコルでは、腫瘍を起こしやすい MCSCs の細胞活性化を人工的に誘発する方法を説明し、メラノーマの開始6,7の正確な制御を容易にします。

ここに記載された方法を通して、 Pten発現の損失と共に発癌BrafV600E を発現する腫瘍性 MCSCs からの皮膚黒色腫開始の空間的および時間的制御が首尾よく行われ、6を報告している。この方法は、脱毛を介して毛包幹細胞活性化を示し、UV B にマウスの皮膚の露出が毛包とこの細胞の転座に MCSCs の活性化を促進する方法を示す以前の所見を組み込んでいますinterfollicular 表皮6、8、9、10への亜集団。これらの in vivo モデルシステムは、生理的および環境的変化が黒色腫を起こしやすい MCSCs の細胞の状態をどのように変化させるかに関する貴重な情報を提供することができ、これは皮膚に黒色腫の著しい開始を誘発する可能性がある。

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プロトコル

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すべての動物の処置は、コーネル大学機関の動物ケアおよびユース委員会 (IACUC) に従って行われます。

1. 準備

  1. 12日目の生後マウスからのテールクリップを収集し、95° c で 0.05 N NaOH の400μ l を1時間にわたって消化します。ボルテックスと 1 M トリス-HCl、pH 7 の32μ l を追加します。ジャクソン研究所を通じて提供される PCR プロトコールに従って遺伝子型マウスを、関心6の遺伝子型を有するマウスを同定する。
    - Tyr-就き-hemizygous (+/CreER)
    - LSL-BrafV600E –ヘテロ接合 (+/LSL-V600E)
    - Pten-ホモ flox (flox/flox)
    - LSL-tdTomato – hemizygous (+/LSL-tdTomato)
    注:プライマー配列は、材料の表に提供されています。
  2. 下記のすべての実験の前に2〜3日前に背部皮膚を剃るためにバリカン (電気トリマー) を使用して、マウスが約7週齢である場合。MCSCs を含む毛包幹細胞を活性化する創傷治癒応答を誘発する可能性があるため、電動トリマーを使用して薄いマウスの皮膚を損傷しないように注意してください。
  3. ヘアサイクルが休止期にあるかどうか、および待機期間中に皮膚が負傷しているかどうかを確認します。皮膚が怪我の兆候を示している場合、マウスはこれらの手順に使用すべきではありません。
    注:毛周期は遺伝的背景間でわずかに異なるかもしれないが、この年齢では背部皮膚における毛周期は通常、休止期状態11にある。Tyr-就きトランスジーンは休止期皮膚の MCSCs を標的とし、その後の遺伝的変化は、分化したメラノサイトおよび MCSC 腫瘍を含む melanocytic のすべての系統で永久に発現されます。

2. Lox 遺伝子組み換えのためのタモキシフェン治療

  1. 全身または局所的な遺伝子組換えのための腹腔内注射 (IP) または局所投与に対するタモキシフェンの調製
    注:タモキシフェンが組換えを誘発するためには、最初に肝臓によって 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) に代謝されなければならず、これは就きに結合して活性化することができる。タモキシフェンの局所適用はこのようにして代謝されず、OHT を直接使用する必要があります。タモキシフェンの送達には1つの方法しかなく、十分な組み換えが必要です。
    1. タモキシフェン: トウモロコシ油に溶解した 10 mg mL-1の濃度でタモキシフェンを調製してください。溶液中への薬物の溶解を支援するために、粉末状の薬剤に 100% の分子グレードのエタノールの総体積を 10% まで加え、3分間渦をかけ、次いでトウモロコシ油の残りの体積を加える。結晶材料が溶液中に見えなくなるまで渦を続けます。タモキシフェン溶液は、0.2 μ m フィルタを通過することにより滅菌することができる。治療のためのステップ2.2.1 に進みます。
    2. 4-OHT: 100% エタノールに 3 mg の mL-1までの hydroxytamoxifen の原液を準備します。その後、実用的なソリューションは、関心のあるスキン領域 (一般的には単一のアプリケーション) をカバーするために必要なだけ適用することができます。
      注:Hydroxytamoxifen の原液を 100% エタノールに溶解し、最終濃度 5 mM にすることができます。その後、作業溶液を調製するために、5μ l の4OH 原液を、15μ l の 100% エタノールに希釈することができる。4 mm2領域の場合、作業溶液の1〜3μ l を局所的に塗布することができる。
  2. 全身または局所的にタモキシフェンを用いたマウスの治療
    1. 全身治療の場合は、1日1回、26 G 針で3日間、IP 注射によってタモキシフェン 2 mg を投与してください。
      注:このモデルを用いて、静止 MCSCs の約 93% ± 4% が tdTomato6で標識されている。
    2. 地域活性化のために、4-OHT で1つの局所治療を行います。作業ソリューションで対象のスキン領域をカバーします。作業溶液の量は、ステップ2.1.2 に記載されている関心領域のサイズによって決定することができる。
  3. 48 h でタモキシフェンの最終投与に続いて、化学脱毛誘導腫瘍開始のためのステップ3に進むか、または UV B 誘導腫瘍開始のためのステップ4に進みます。

3. ケミカル脱毛

  1. 次の必要な材料とイソフルランシステムを含むマウス治療室を装備: 脱毛クリーム, コットンズ綿棒, 紙布, 水.
  2. 誘導チャンバにマウスを置き、3.5 で 4.5% のイソフルランと1リットル/分の酸素を麻酔します。
  3. 呼吸数が安定したら、マウスがつま先のピンチを実行することによって麻酔の適切な面にあることを確認し、イソフルランと1リットル/分の酸素を1〜 1.5% の麻酔を維持するメインチューブにマウスを移します。眼軟膏を塗布して、麻酔下で目を乾燥から守ります。
  4. 綿棒を使用して、脱毛クリームの薄い層をマウスの皮膚の剃毛領域に塗布します。
  5. クリームが均一に塗布されたら、除去を開始するためにきれいな綿棒を使用してください。クリームは、皮膚に接触している合計時間は1分を超えてはなりません。
  6. 湿らせたペーパークロスで優しく肌を拭いて、残留クリームが取り除かれていることを確認します。
    注:脱毛クリームは、完全に除去されていない場合、皮膚に刺激を引き起こす可能性があります。C57BL/6 バックグラウンド上のものなどのいくつかのマウスは、皮膚炎12を発症しやすい可能性がある。稀であるが、一部の動物は、脱毛クリーム塗布または機械的脱毛後24時間以内に皮膚炎を発症する。局所的な皮膚刺激の兆候を探すために、治療の翌日にマウスをチェックしてください。
  7. 除去されたヘアシャフトと、バイオハザードビンに使用されるすべての材料を破棄します。
  8. 麻酔が切れるまで、マウスを空の、きれいなマウスケージに入れます。
  9. マウスをケージに戻します。

4. UV-B 照射

  1. イソフルランシステムを含むマウス治療室には、UV-B ライトシステム、UV-B ライトメータ、マウス用保護カバー、研究者用 UV B 保護用 PPE、およびタイマーを装備しています。
  2. マウスは、対象の UV-B 投与量で照射されるべきである (すなわち、0-180 mJ/cm2)。UV-B ライトメータを使用して、マウスを照射するのに適切な時間の長さを決定する。
    注: mW/cm2 x 時間 = 線量
  3. マウスをイソフルランで麻酔ます。誘導室にいる間、4.5% イソフルランと1リットル/分の酸素に3.5 を使用してください。
  4. マウスが安定したら、つま先で麻酔の効果を確認し、UV 室にあるメイン麻酔管にマウスを移します。眼の軟膏を塗布して、麻酔下で目が乾燥するのを防ぎます。1 ~ 1.5% のイソフルランと1リットル/分の酸素で麻酔を維持します。
  5. 所望の領域のみが露出されるように、UV-B 保護材を用いて背面の皮膚をカバーしています。
    注:このとき、適切な PPE が利用されるべきである。マウスの照射に必要な時間は、使用する電球の強度によって異なりますが、必要な時間が30秒を超える場合は麻酔を監視する必要があります。
  6. 紫外線抵抗力があるふたか他の適した材料を使用して紫外線室をカバーしなさい。
  7. UV-B ランプの電源を入れ、特定の目的のために研究者によって決定された時間のためのマウスを照射.
  8. UV システムとイソフルランをオフにし、麻酔が磨耗するまでマウスを空のマウスケージに置きます。
  9. マウスをケージに戻します。

5. 組織処理

  1. 皮膚の分離
    1. 開始前に以下のものを入手してください: 剖検機器, フィルター紙と紙タオル.
    2. Euthanize は、IACUC によって承認されたプロトコルに従ってマウスを再処理し、続行する前に死亡を確認する。
    3. バリカンを使用して、背面の皮膚領域から任意の毛を剃ります。その領域をきれいにするために、けばのない組織で軽くブラシをかけます。
    4. 尾の基部のすぐ上に鋭いはさみで小さな切開を行います。
    5. 大きな鈍いはさみを切開部に挿入し、皮下結合組織を分離する。
    6. 慎重に組織の縁に沿って鋭いはさみで切断することにより、目的の皮膚領域を分離します。
    7. 清潔なペーパータオルの上に皮膚組織を置き、鈍い鉗子を使って皮膚を伸ばし、タオルに付着して教えられる。このステップは、その形状を維持しながら操作および処理することができるように、組織のための追加のサポートを提供するために役立ちます。
      注:鉗子は組織学的に見ることができる皮膚に損傷を引き起こす可能性があるので、皮膚組織の外側の領域のみを処理するように注意してください。
  2. 組織固定
    1. フィルター用紙を半分に折り、ラベルを適切に付けます。折り目に隣接する折り返し用紙の裏に紙タオルを添えてスキンを置き、サンプルが滑らかで折り畳まれていないことを確認します。開いた側面をホチキスで絞り、残りの用紙を将来のサンプルに使用できるようにトリムします。
      注:このステップは、固定中に皮膚がその形状を保持するように行われる。
    2. 組織サンプルを 10% 中性緩衝ホルマリンで 3 ~ 5 時間室温または一晩4° c で完全に水没させる。
    3. 固定の後、ホルマリンから試料を取り出し、脱イオン水で洗浄し (それぞれ2x、5分ずつ)、組織ブロックを作る。皮膚組織から任意の残留物質を慎重に除去します (すなわち, 残留紙).
  3. 凍結組織ブロックの作成 (図 1)
    1. それらがギザギザにならないように、皮膚サンプルのエッジをトリミングし、3つの矢状切断を行います。これらのストリップの幅は、cryomold (5mm) の高さ以上であってはなりません。次に、横方向のカットをして、cryomold (20 mm) の幅よりも長くない、埋め込むことができる皮膚の部分を持つようにします。背部の皮膚の残りの半分で繰り返し、または他の用途のために組織を保存する (交互に、固定する前に半分を保存する)。
      注:肌の部分を適切な向きに保つことが重要です。
    2. 縦方向に cryomold (25 x 20 x 5 mm3) を向き、10月の上に 4 ~ 5 個の皮膚を置きます。すべての部分が配置されたら、cryomold の底に皮膚の長いエッジをもたらすために、微細な鉗子の2つのペアを使用しています。皮膚は金型の基部に対して10月に垂直に立ち上がるべきである。この手順では、OCT 内のエアーポケットの形成を最小限に抑えるように注意してください (図 1)。
    3. 10月に2番目の唇に金型を記入し、ドライアイスの平らな面に置きます。ブロックがフリーズし始めると、移動中にシフトした可能性のあるスキンピースを調整するために鉗子を使用します。最下層が固化すると、組織の操作は不可能になります。
    4. 分析のための8-10 μ m のスライドを切りなさい。
  4. ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織ブロックの作成
    1. 固定された皮膚2個をラベル付きカセットに置き、エタノール濃度を増加させて (75% エタノールを30分、85% を30分、90% 30 分、95% を30分、100% を30分、キシレンまたはキシレンの代替を 2x 30 分間) 脱水します。パラフィンを58-60 °でインキュベートし、最初に30分間、その後一晩します。
    2. 24 x 24 mm2ステンレス鋼製のティッシュモールドに流動パラフィンを加え、-5 ° c で固化します。組織配向は、複数の毛包を横切る長手断面が視覚化できるように、凍結組織ブロックの方向と同様でなければなりません (図 1)。
    3. パラフィンが固化したら、金型を取り外し、5-10 μ m セクションに切断して分析します。

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結果

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化学脱毛によって誘発される皮膚黒色腫の開始

化学脱毛の手順は図 2に示されています。マウスが生後7週間のとき、その背側の皮膚は休止期にある。休止期の間、毛包幹細胞および MCSCs は休止状態にあることが知られている。皮膚はシェービング後に顕著な毛の成長を示さないはずです。一方、化学脱毛は、毛包幹細胞活性化を誘導することができ、その結果、対象領域から有意な毛髪成長が示される (図 2)。同様に、発癌変異を発現する腫瘍を起こしやすい MCSCs も、加速された腫瘍形成のために活性である必要がある。化学的脱毛は、毛包幹細胞と MCSCs の両方の活性化を有意に誘導することができる。有効状態の黒色腫が発生しやすい MCSCs は、腫瘍を形成し、化学脱毛を使用してから2週間以内に顕微鏡黒色腫の開始を観察するこ...

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ディスカッション

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皮膚黒色腫腫瘍によく見られるホールマーク遺伝子改変がよく記載されている13.最も支配的なドライバ変異はBrafV600Eであり、 BrafV600E媒介性黒色腫の遺伝子組み換えマウスモデルはボーゼンベルクグループ14によって生成され、ジャクソン研究所に沈着した。このマウスモデルを用いて、我々の最近の研究は、背側皮膚6におけるBrafV600E媒介性黒色腫の有意な開始に対する腫瘍が生じやすい MCSCs の細胞活性化の要件を示した。

脱毛は、背側皮膚6,10上にマウスの毛包幹細胞活性化を誘導するのに有効な方法であることが知られている。ネズミ MCSCs は、毛包内に位置し、さらに、濾胞性 MCSCs の細胞状...

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開示事項

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著者は利害の対立を宣言していない。

謝辞

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この作品は、ピアが受賞 W81XWH-16-1-0272 の下で癌研究プログラムを検討したことを通じて、保健省の補佐官の事務局長によって支持されました。意見、解釈、結論、および勧告は、著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されていません。この研究はまた、コーネル・ステム・セル・プログラムからのシード・グラントによっても支持されました。H. ムーンは、コーネル大学の脊椎動物ゲノム研究者プログラムによって支持されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
タモキシフェンシグマT5648-1G全身注射用
タモキシフェンケイマンケミカル13258注射用
コーン油シグマ45-C8267-2.5L-EA
4OH-タモキシフェンシグマH7904-25MG局所治療用
26G1/2インチ針さまざまな獣医グレード
1mLシリンジ各種獣医グレードの
ペット用ヘアトリマーウォール09990-502
毛クリームNairn / aほとんどのドラッグストアで利用可能
綿棒各種
電球UVP95-0042-08モデルXX-15MミッドレンジUVランプ
200プルーフエタノール各種純粋なエタノール
Histoplast PEFisher Scientific22900700パラフィンペレット
中性緩衝ホルマリン、10%SigmaHT501128-4L
Clear-Rite 3Thermo Scientific6901キシレン代替品
O.C.T. コンパウンドサーモ23730571
ティッシュ カセットさくら89199-430FFPE加工
クライオモールドさくら455725 x 20 mm
FFPE 金型ライカ380308224 mm x 24 mm
イソフルラン各種獣医用グレード
麻酔吸入システム各種獣医用グレード
ファインハサミFST14085-09ストレート、シャープ/シャープ
ファインハサミFST14558-09ストレート、シャープ/シャープ
MetzenbaumFST14018-13ストレート、鈍い/鈍
い鉗子FST11252-00デュモン #5
鉗子FST11018-12Micro-Adson
Tyr-CreER;LSL-BrafV600E;Pten-f/fJackson Labs13590
LSL-tdTomatoJackson Labs007914ai14
Cre-1n/aGCATTACCGGTCGATGCAACGA
GTGATGAG
Cre-2n/aGAGTGAACGAACCTGGTCGAA
ATCAGTGCG
Braf-V600E-1n/aTGAGTATTTTTTGGCAACTGC
Braf-V600E-2n/aCTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1該当なしAGCTAGCCACCATGGCTTGAGT
AAGTCTGCA
Kras-G12D-2該当なしCCTTTACAAGCGCACGCAGACT
GTAGA
Pten-1該当なしACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2該当なしAATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3該当なしGCTTGATATCGAATTCCTCGCAGC
tdTomato-1該当なしAAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2該当なしCCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3該当なしGGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4該当なしCTGTTCCTGTACGGCATGG
全身脱紫外線

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
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