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方法論記事

ミニチュアブタからの原発性大動脈内皮細胞の単離と培養

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DOI:

10.3791/59673

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2019年8月14日

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1Department of Nephrology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 6People's Hospital of Longhua

この記事について

サマリー

小型ブタから原発性ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)を単離するための有効な酵素法が記載されている。単離された一次pAECは、xeno移植における免疫および凝固応答を調べるために使用することができる。

要約

Xeno移植は、末期臓器不全患者のヒト臓器不足を解決する有望な方法であり、ブタは適切な臓器源と考えられている。免疫拒絶反応と凝固は、xeno移植の成功のための2つの主要なハードルです。血管内皮細胞(EC)損傷および機能不全は、xeno移植における炎症および凝固応答の発症にとって重要である。したがって、ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)の単離は、免疫拒絶反応および凝固応答を調べるための必要がある。ここでは、小型ブタから高精製されたpAECの分離、特性評価、拡大のためのシンプルな酵素アプローチを開発しました。まず、小型豚をケタミンで麻酔し、大腸の長さを取り除いた。第二に、大動脈の内皮表面を0.005%コラゲナーゼIV消化液に15分間曝露し、大動脈の内皮表面を細胞スクレーパー(<10回)で一方向にのみ削り取り、その過程で圧縮されなかった。こする。最後に、3日目の単離されたpAECを、および通路1および通路2の後に、抗CD31抗体を用いたフローサイトメトリーにより同定した。CD31陽性細胞の割合は、それぞれ97.4%±1.2%、94.4%±1.1%、92.4%±1.7%(平均±SD)であった。コラゲナーゼIVの濃度、消化時間、方向、スクレイピングの頻度と強度は、線維芽細胞汚染を減少させ、高純度および多数のICを得るために重要です。結論として、我々の酵素法は、小型ブタ大脳からICを分離するための非常に効果的な方法であり、細胞を体積して異種移植における免疫および凝固応答を調べることができます。

概要

移植のための利用可能な臓器の不足は、世界的に顕著な問題です1.中国赤十字社によると、2018年に中国で末期臓器不全を起えた患者はごくわずかです。

Xeno移植は、臓器不足の問題を解決するための有望な方法です。豚の臓器は、解剖学的および生理学的類似性2、3のために人間に最も適した器官であると考えられている。ブタ異種移植片の不全は、霊長類の免疫拒絶反応および凝固応答に大きく関連している。これらの細胞は、抗体、補体、サイトカイン、および免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、およびマクロファージ)を含む霊長類免疫系と相互作用する最初の細胞であるため、ブタ内皮細胞(IC)は重要である4、5。ブタのICはブタの臓器およびイレットの細胞移植6、7で重要な役割を果たしている。したがって、ICは、ブタ移植片に対する拒絶反応および凝固応答を調出するための重要な細胞である。xeno移植研究には高品質のブタICの分離が必要です。

異なる臓器(例えば、心臓、腎臓、肝臓および大腸)からICを分離する試みにおいて、いくつかのプロトコルは、異種移植設定8、9、10、11、12で報告されている。しかし、分離されたICの超純粋な文化を維持することは、標準プロトコルでは顕著な問題です。消化溶液の濃度の増加は、不適切な消化時間および擦り傷強度が、現在の研究8、10、13における線維芽細胞汚染の増加に寄与しうる。また、小型ブタからpAECを単離する方法はあまり研究されていない。ここでは、精製性の高いpAICを小型ブタ(無気力またはバマ)から分離するための最適化された酵素法について説明する。プロトコルのいくつかのステップは、線維芽細胞汚染を低減し、高純度のICを得るように設計されています。

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プロトコル

動物の使用は、動物福祉の原則に従って、深セン第二人民病院の倫理審査委員会によって承認されました。

1. 動物、培地、バッファーの調製

  1. ミニチュアブタを準備します。
    注:すべてのミニチュアブタは、中国のムジシャンまたはバマ豚(雄)でした。ブタの年齢及び重量は、それぞれ100日±8日及び5.7kg±1.0kg(平均±SD、n=3)であった。
  2. 培養培地を調製する:内皮細胞培地(ECM)を10%(v/v)熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)および1%(v/v)内皮細胞増殖サプリメント(ECGS)で補充した。
  3. 洗浄バッファーを準備する: 1x PBS 溶液 (pH 7.4) 1% (v/v) P/S.
  4. 0.005%コラゲナーゼIV消化液を調出す:PBS溶液の20mLでコラゲナーゼIV粉末の1mg。消化前に37°Cでコラゲナーゼ消化液を予温める。
  5. 停止バッファーを準備する:ダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)を10%熱不活性化FBSと1%P/Sで補充した。

2. ブタ大動脈内皮細胞分離の手術と準備

  1. 手術を行う前に、手術室を1時間の紫外線と医療消毒剤84液(利用可能な塩素含有量は4.0%~5.0%、材料の表)で消毒します。
  2. ミニチュアブタは、15mg/kgケタミン、15mg/kgの塩酸キシラジン、塩酸0.05mg/kgのフェナセチン(容積:100μL/kg、材料の表)で形成された筋肉内注射を受けた後(図1A)、動物の確認ブタの痛みを伴う刺激(例えば、片方の耳をつまむか、片方の前肢を振る)と生理学的指数(血圧、心臓および呼吸数)をチェックする麻酔状態。
    注:それは目を覚ます兆候を示している場合は、別の半分の用量注射は、豚に与えることができる。
  3. メスで腹部を切断し、劣った静脈カバを露出させ、その結果、5 mL注射器で下の静脈カバにヘパリンナトリウム(5,000 U、材料のテーブル)を注入する。
  4. 5分後、腹部大動脈にカテーテルを血液に挿入し、胸部の皮膚を切断し、メスで横隔膜を切開し、その後左心室を切り取る。
    注:ブタが血液を採取し、心臓を切断した後に大動脈性脈拍をチェックすることによって安楽死していることを確認してください。
  5. 肋骨を骨鉗子(材料の表)で物品を取り除き、心臓と肺を露出させる。心臓と肺に大動脈の後部を見つけ、両端をクランプします。大器をあらかじめ冷却した洗浄バッファーで一度洗います(図1B,C)。
  6. はさみで大動脈を切り取り、大動脈を両側に締め付けたままにします。生殖不能の鉗子およびはさみで大断のまりの余分なティッシュを切除する。50 mL遠心管に大小管を入れ、予め冷却された洗浄バッファー3x(1洗浄あたり30mL)で大王を洗浄し、大王を実験室に移す(図1D)。

3. ブタ大動脈内皮細胞の単離

  1. 無菌条件下で、ブタ大器を洗浄バッファーから取り出し、150mmペトリ皿に置きます(図2A)。
  2. 大両の両端をそっと切り取り、無菌鉗子とはさみで大断の周りに余分な組織を取り除く(図2B)。大器の外側と内側(室温で培養皿の上)を20~50mLの洗浄バッファーで洗浄します。
    注:一部のICがこの領域で損傷を受けたため、手術中にクランプが置かれた領域のみをカットし、余分な組織や動脈側の枝を取り除くようにしてください。
  3. 外科縫合糸を大通しに渡し、外科縫合糸(5-0,90cm,材料の表)を使用して大曲の一方の端を結ぶ。外科縫合糸は大通りの内側に保つ(図2C、D)。
  4. 結ばれた端の近くの大腸を鉗子でそっと固定し、外科縫合糸をゆっくりと引っ張って大腸の内皮表面が露出するまで大腸を逆転させる(図2E-G)。
    注:結ばれた端の近くに大曲を固定し、大曲をしっかりと固定しないことを確認するか、外科縫合糸を引っ張ることによって大口を逆にすることはできません。
  5. 大王の内皮表面を洗浄バッファー3x(洗浄当たり10mL)で洗浄し、この溶液を廃棄します。大器を15mL遠心管に入れ、0.005%のコラゲナーゼIV消化液をチューブ内の10mLで覆う(図2H)。
    注:消化前に37°Cで0.005%コラゲナーゼIV消化液を予め温めなさい。
  6. 37°Cで15分間インキュベートし、消化大器と消化液を100mm培養皿に入れ、予冷止停止バッファーの10-15 mLを加えることで0.005%コラゲナーゼIVの効果を止める。
    注:推奨消化時間は10~20分です。大器の内皮表面が停止バッファーで覆われていることを確認します。
  7. セルスクレーパーを使用して、大陸の内側からPAECをそっと削り取ります(図2I)。掻き取った大オルタ3xを洗浄バッファー(1回あたり5mL)で洗浄します。培養皿の溶液を50mL遠心管に入れます。培養皿の底部を洗浄バッファー(1回あたり5mL)で洗い、溶液を再び50mL遠心管に入れます。
    注:一方向に優しく擦り、圧縮しないでください。端や穴の近くの組織に触れないでください。5−8xのスクレイピングをお勧めします。
  8. 4 °Cで6分間600 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨て、50 mL遠心管の底部に10mLの溶液を残します。50 mL遠心管に20mLの洗浄バッファーを加え、ペレットを再サスペンドします。この手順では、気泡を避けてください。
  9. 4 °Cで6分間600 x gの遠心分離機。上清をゆっくりと捨てます。培養培地の1 mLで細胞ペレットを再中断し、よく混ぜます。
    注:cm大次あたりの得られた平均IC数は1.9 x 105 ± 1.4 x 10 4(平均±SD、n =3)です。
  10. セル カウンタを使用してセルをカウントします。細胞数に応じて任意の材料をコーティングすることなく容器内の細胞をプレートおよび培養する。細胞数が1.0 x 106以下の場合、25cm2フラスコ中の培養細胞。細胞数が1.0 x 106より大きい場合、複数の25cm2フラスコ(フラスコあたり1.0 x 106セル)で培養細胞。フラスコを5%CO2で37°Cのインキュベーター(振らず)に入れ、2−3日ごとに培地を交換します。
    注:一部の細胞は、セルスクレーパーによって損傷を受けています。細胞生存率アッセイでは、生細胞の割合が95.7%±1.7%であることが判明しました(平均±SD、n=3)。単離細胞の倍増時間は約1−2日である。

4. 純粋な内皮細胞の収穫と特徴付け

  1. 細胞は約4−5日間成長したままにする。細胞が80%の合流率(図3A)に達すると、0.25%トリプシンで細胞を消化し、細胞を通過させる。次いで、単離細胞の一部(3日目、パッセージ1およびパッセージ2)を収集し、フローサイトメトリー(抗CD31抗体を用いて)によって同定する。
  2. 標識単離されたpAEC(細胞数:1x 10 5)(3日目、パッセージ1およびパッセージ2)を抗ブタ性CD31-フルレッセインイソチオシアネート(FITC)共役抗体(100μL細胞当たり10μL抗体、4°Cで30分間染色)を行い、フローサイト分析を行った。
  3. 前方散乱プロットを持つゲート全ライブ細胞集団、陰性対照として染色されていないサンプル。次いで、ゲート細胞のCD31陽性細胞をヒストグラムで提示する。
    注:CD31陽性細胞の有効性は97.4%±1.2%(3日目)、94.4%±1.1%(P1)、92.4%±1.7%(P2)(平均±SD)、それぞれ(図3B)である。

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結果

この方法は、高精製されたICを小型ブタから大口から分離する効果的な方法を提供することを目的としています。大横手術の過程を図1に示す。最初のステップは、大小全部が豚から取り除かれることです。他の細胞や細菌の汚染を防ぐことは非常に重要です。したがって、標的化されていない細胞や細菌が大腸を汚染した場合に他の器官や組織を傷つけないようにし、予め冷却された洗浄バッファー3xで大腸を洗浄する(図1B-D)。細胞の生存率を維持するためのもう一つの重要なステップは、外科標本と単離手順を得ることまでの期間を最小限に抑えることである。

pAECの精製に関与するプロセスを図2に示します。大腸の一方の端が結ばれ、内皮表面が露出するので、我々の方法は他のものとは異なります(図2C-G)。続いて、大口全体の内皮表面を15mL遠心管(図2H)

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ディスカッション

内皮細胞は、血管機能障害、糖尿病、組織再生、移植、および癌14、15、16、17、18の研究で一般的に使用される。これらの疾患におけるICの生物学と機能を理解し特徴付けるために、異なる疾患の臓器や組織のICを単離する多数の方法が報告されている8,19,20,21歳,22歳,23歳,

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、広東省自然科学財団の助成金、助成金/賞番号:2016A030313028の助成金によって支援されました。広東省医学科学研究財団, 助成金/賞番号: B2018003;深セン科学技術振興財団、助成金/賞番号:JCYJ20180306172449376、 JCYJ20180306172459580、JCJY2016029204849975、GJHZ201703141713575556、JCYJ2016042151030000110300001とJCYJ20101000011000001深センロンフア地区科学技術財団、助成金/賞番号:2017013;中国国家主要研究開発プログラム、助成金/賞番号:2017YFC1103704;深センの医学のサンミンプロジェクト, 助成金/賞番号: SZSM201412020;広東省の高レベル病院建設特別基金(2019年)深センの高レベル医療規律建設基金,助成金/賞番号: 2016031638;深セン健康・家族計画委員会、助成金/賞番号:SZXJ2017021およびSZXJ2018059。我々は、原稿の準備を支援してくれた深セン大学のハンチェン・ジャンとZhicheng Zouに感謝する。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BD FACSAria IIBD Bioscience
BoneforcepsBeijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. 中国HL-YGQ  
BOON ディスポーザブルシリンジ (10ml)Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. 中国
CD31-FITC 抗体バイオ・ラッドMCA1746F
セルスクレーパーコーニング 3010#
コラゲナーゼIVSigma-AldrichC5138#-1G
化合物ケタミン注射剤 中国瀋陽の獣医用医薬品工場ケタミン塩酸塩?0.3g/2ml,キシラジン塩酸塩:0.3g/2ml, フェナセチン塩酸塩?1mg/2ml
Sciencell1052#
エッペンドルフ スナップキャップマイクロチューブ(1.5mL) AXYGENMCT-150-C#
Falcon 100mm Cell Culture DishCorning353003#
ウシ胎児血清GIBCO10270-106#
Flowjo v10.0
鉗子 上海医療機器有限公司中国
ヘパリンナトリウム江蘇湾バンバイオ医薬品有限公司中国
ヨウ素チンキ桂林LiFeng医療用品有限公司
ミニチュア豚(バマまたは武子山)カンイーエコロジカル農業株式会社、中国
Mshot顕微鏡 広州マイクロショットテクノロジー株式会社M152
ペトリ皿 (150 x 15 mm)Biologixgroup66-1515#
ペニシリン/ストレプトマイシンライフテクノロジーズ15070063#
ベントキャップ付き長方形傾斜ネック細胞培養フラスコ?T25ですか?コーニング 3289#
はさみ上海医療機器有限公司中国
血清学的トランスファーピペット(10ml)JETバイオフィルGSP010010# 
滅菌パスツールピペットGeneBrickGY0025#
滅菌シリンジフィルター (0.22µm)ミリポアSLGV033RS#
外科用メスShangHai medical instruments Co.,Ltd.China22#
外科用縫合Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd5-0#
Syringe?5mL?Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China
Trypsin-EDTA (0.25%)、フェノールレッドGIBCO25200056#
75% 医療用アルコールGuilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China
20 x PBS 溶液 (pH 7.4、ヌクレアーゼフリー)Sangon BiotechB540627#
Medical disinfectant 84 liquidSichuan Province Yijieshi Medical Technology Co.,Ltd450ml/ボトル
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)ライフテクノロジーズD1306#DMEMライフテクノロジーズ11965118#ECM Sciencell 1001#ECGS 中国糸

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