ヒト末梢血単核細胞(PBMC)-翻訳免疫腫瘍学研究のためのヒトヒト異種移植片マウスモデルについて説明する。このプロトコルは、I-O療法評価のための同様のモデルを確立し、特徴付けるための一般的なガイドラインとして役立つ可能性があります。
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方法論記事
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)移植型ヒト型異物移植モデル翻訳免疫腫瘍学(I-O)研究
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
近年の免疫腫瘍学(I-O)療法の発見と開発は、がん治療における画期的な出来事です。しかし、治療の課題は続きます。堅牢で疾患に関連する動物モデルは、追加の免疫チェックポイントの範囲に対処するために、継続的な前臨床研究開発のための重要なリソースです。ここでは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)-ヒト化異種移植片モデルについて説明する。BGB-A317(Tislelizumab)は、後期臨床開発におけるヒト化抗PD-1抗体の研究例として、プラットフォームのセットアップ、モデル特性評価および薬剤有効性評価を議論する例として用いられる。これらのヒト化マウスは、試験されたほとんどのヒト腫瘍の増殖を支持し、したがって、ヒト免疫とヒト癌の両方の文脈におけるI-O療法の評価を可能にする。確立されると、当社のモデルは比較的時間と費用対効果が高く、通常は非常に再現性の高い結果をもたらします。我々は、この記事で概説するプロトコルが、ヒトPBMCおよび腫瘍で再構成されたマウスモデルを確立するための一般的なガイドラインとして役立つことを示唆する。
概要
免疫腫瘍学(I-O)は、がん治療の急速に拡大する分野です。研究者は最近、腫瘍を攻撃するために免疫系の機能を調節する治療の可能性を理解し始めています。免疫チェックポイント遮断は、黒色腫、腎細胞癌、頭頸部、肺、膀胱および前立腺癌1、2を含む様々な癌タイプにおける励ましの活動を実証している。がん細胞を直接殺す標的治療とは対照的に、I-O療法は腫瘍3を攻撃するために身体の免疫系を増強する。
現在までに、関連するI-O動物モデルが数多く確立されています。これらには、1)マウス腫瘍細胞株または同種マウスにおける腫瘍ホモグラフトが含まれる。2)遺伝子組み換えマウス(GEM)または発癌性誘導に由来する自発性腫瘍;3)機能的なマウス免疫系におけるヒト薬物標的のノックインを有するキメラGEM;そして4)ヒト癌細胞または患者由来異種移植片(PDX)で移植された再構成ヒト免疫を有するマウス。これらの各モデルには明らかな利点と制限があり、他の場所で広く説明され、見直されています4.
免疫不備マウスにおけるヒト免疫の再構成は、翻訳I-O研究の臨床的に関連するアプローチとして高く評価されている。これは通常、成人免疫細胞の1)捕等(例えば、末....
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プロトコル
人間の参加者を含む研究で行われたすべての手順は、BeiGeneおよび/または国家研究委員会の倫理基準に従い、1964年のヘルシンキ宣言とその後の修正または同等の倫理基準に従っていました。インフォームド・コンセントは、研究に含まれるすべての個々の参加者から得られました。動物に関する研究で行われたすべての手順は、BeiGeneの内部審査委員会によって承認されました。このプロトコルは、ヒト化されたNOD/SCIDマウスにおけるBGB-A317(Tislelizumab)の評価のために特に調整された。
1. ヒトPBMCベースモデルの確立
-
シクロホスファミドを用いたNOD/SCIDマウスの骨髄アブレーション:最適用量の決定
- 女性のNOD/SCIDマウス(6-8週間)を購入します。
注:この研究に関与するすべてのマウスは雌であった。 - 生理生理で異なる用量(50、100および150 mg/kg)でシクロホスファミド(CP)を調調します。125 mg/kg で生理生理生理で 0.8% トゥエン-80 でディスルフィラム (DS) を調製します。
注:異なる濃度のCPは、異なる用量のCPを得るマウスに対して同量の薬物溶液の投与を可能にするために調製された。 - CP(i.p.)とDS(p.o.)を1日1回2日間治療す....
- 女性のNOD/SCIDマウス(6-8週間)を購入します。
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結果
ここで提示された手順に従って、PBMCベースのヒト化異種移植片モデルが正常に確立されました。簡単に言えば、NOD/SCIDマウスにおけるCP骨髄切除効果は、好中球および単球集団の流れ細胞メトリー分析によって決定されたCPおよびDS処理後(図1)。100 mg/kg CP プラス 125 mg/kg DS は最適な用量として決定され、レジメンとして後の研究で使用され、マウスに重度の毒性を引き起こすことなく好中球および単球の最大枯渇をもたらす。次に、ヒトPBMCおよび腫瘍移植を行った。腫瘍微小環境におけるヒト免疫細胞浸潤の存在をIHCにより検証した(図2)。
PBMCドナーのパネルを生体内でスクリーニングし、腫瘍微小環境における比較的高い免疫細胞浸潤および許容可能な腫瘍増殖速度を確保した(セクション2、図3A)。一方、30以上のヒト癌細胞株と20種類以上の異なる癌タイプのPD.......
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ディスカッション
近年、腫瘍細胞とそれに関連する間質の両方を総合的に理解することに重点を置き、がんの発症と進行に関する我々の知識は著しく進歩しています。宿主の免疫メカニズムを利用することは、がん細胞に対してより大きな影響を与える可能性があります, 有望な治療戦略を表す.同種およびGEMモデルのような無傷のマウス免疫系を有するマウスモデルは、チェックポイント媒介免疫の研究に広く用いられてきた。これらのモデルを用いた有効性評価は、サロゲート抗マウス標的抗体13,14に大きく依存する。しかし、ヒトとマウスの免疫系とマウスモデルにおける一部のヒト標的の欠如との本質的な違いは、I-O抗腫瘍効果15,16の前臨床試験を制限する。従って、ヒト免疫細胞とヒト腫瘍の両方を含む堅牢なマウスモデルが緊急に望まれており、これは新規なI-O治療薬の翻訳および開発を大幅に改善する。
ここでは、翻.......
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開示事項
すべての著者はBeiGeneに所有権を持っています。トン・ザンとカン・リーは、本研究で説明するBGB-A317をカバーする特許の発明者である。
謝辞
私たちは、私たちの研究室のメンバーに有益な議論に感謝します。この研究は、北京市科学技術委員会の生物医学・生命科学イノベーション・栽培研究プログラムの助成金第1号に部分的に支援されました。Z15100003915070(プロジェクト「新規免疫腫瘍学抗腫瘍薬BGB-A317に関する前臨床研究」)、また、前臨床研究のための社内資金によって部分的に支援された。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PBMC 分離/細胞培養 | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | 細胞分離 |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | 細胞培養 |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | 細胞培養 |
| FBS | Corning | 35-076-CV | 細胞培養 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン、液体 | Gibco | 15140-163 | 細胞培養 |
| トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド | Gibco | 25200-114 | 細胞培養 |
| マトリゲル | コーニング | 356237 | CDX 接種 |
| FACS 分析 | |||
| デオキシリボヌクレアーゼ I 牛膵臓 | Sigma | DN25 | サンプル |
| 調製 コラゲナーゼ I 型 | Sigma | C0130 | サンプル調製 |
| 抗マウス/ヒト CD11b (M1/70) 抗体 | BioLegend | 101206 FACS | |
| 抗マウス Ly-6C (HK1.4) 抗体 | BioLegend | 128008 | FACS |
| 抗マウス Ly-6G (1A8) 抗体 | BioLegend | 127614 | FACS |
| 抗ヒト CD8 (OKT8) 抗体 | SungeneBiotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation / dosing / measurement< strong> | |||
| シクロホスファミド | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | in vivo 有効性 |
| ジスルフィラム | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo 有効性 |
| シリンジ | BD | 300841 | CDX 接 |
| 皮下注射針 (14 G) | Shanghai SA Mediciall &プラスチックインスツルメンツ(株) | 0.7*32 TW SB | PDX 接種 |
| ノギス (MarCal) | Mahr | 16ER | 腫瘍測定 |
| IVC 個別換気ケージ | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | 動物< |
| strong>IHC | |||
| ライカASP200 真空ティッシュプロセッサー | ライカ | ASP200 | IHC |
| ライカ RM2235 ルーチン切片用手動回転ミクロトーム | ライカ | RM2235 | IHC |
| ライカ EG1150 H 加熱パラフィン包埋モジュール | ライカ | EG1150 H | IHC |
| アリオール-臨床 IHCおよびFISHスキャナー | ライカ | アリオール | IHC |
| 抗ヒト CD8 (EP334) 抗体 | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| 抗ヒト PD1 [NAT105] 抗体 | アブカム | ab52587 | IHC |
| 抗ヒト PD-L1 (E1L3N) 抗体 | 細胞シグナル伝達技術 | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus ポリマー HRP 検出システム | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
参考文献
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1....
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