マウス精巣におけるタンパク質結合 RNA の効率的な同定のための拡張架橋免疫沈降 (eCLIP) 法

Summary

ここでは、精巣での RBP 候補の主要な RNA 標的を決定するための eCLIP プロトコルを紹介する。

Abstract

精子形成は、哺乳動物における男性生殖細胞分化の高度に順序付けられたプロセスを定義する。精巣では、転写および翻訳はクロッピングであり、RBPs によって組織化された遺伝子発現の転写後調節の重要性を強調している。RBP の機械的役割を解明するために、架橋免疫沈降 (CLIP) 法を用いて内因性の直接 RNA 標的を捕捉し、実際の相互作用部位を定義することができます。拡張クリップ (eCLIP) は、従来のクリップよりもいくつかの利点を提供する新たに開発された方法です。しかし、eCLIP の使用は、これまでのところ、拡張されたアプリケーションを呼び、細胞株に限定してきました。ここでは eCLIP を用いて、マウスの精巣における2つの既知の RNA 結合ヘリカーゼの MOV10 と MOV10L1 を研究した。予想通り、MOV10 は主に 3 ' 非翻訳領域 (UTRs) の mRNA に結合し、MOV10L1 は Piwi 相互作用 RNA (ピルナ) 前駆体転写物に選択的に結合することがわかった。私たちの eCLIP 法は、ディープシーケンシングを進めるための令状として、subclones の小規模なシーケンシングと、資格のあるライブラリの可用性を介して、様々な RBPs に縛られた主要な RNA 種を迅速に決定することができます。この研究は、哺乳類の精巣における eCLIP の適切な基礎を確立する。

Introduction

哺乳類の精巣は、複雑な細胞分化プログラムが、多数の精子を生成するために周期的に動作する優れた発達モデルを表しています。このモデルのユニークな値は、精子形成の特定の段階での転写不活化の出現にあり、典型的に meiotic 性染色体不活性化 (MSCI) が^1,2発生し、ラウンド spermatids が起こるときspermiogenesis³の間の抜本的核圧縮。これらの inconsecutive 転写イベントは、RNA 結合タンパク質 (RBPs) が重要な役割を果たし、トランスクリプトームを形成し、男性生殖能力を維持する転写後の遺伝子調節を必要とします。

インビボで個々の RBP の真正な RNA 標的を同定するために、架橋免疫沈降 (CLIP) 法が、通常の RNA 免疫沈降 (RIP) を超えて^4,5を開発した、^6、7、紫外線 (UV) 架橋を含む主要なステップの組み込みによって、シグナル特異性を改善するために厳しい洗浄およびゲル転送を行う。クリップの高度なアプリケーションと....

Protocol

すべての動物実験は、南京医科大学の委員会によって承認されています.オス C57BL/6 マウスは、制御された光周期条件下で保持し、食物および水を供給した。

1. ティッシュの収穫および紫外線架橋

1. Euthanize は、二酸化炭素 (CO2) を 1-2分または呼吸が止まるまで使用して2つの成体マウスを用いた。次に、各マウスに頸椎脱臼を行う。
2. 各免疫沈降実験のために適切な年齢のマウスから100の精巣を収穫し、その組織を氷冷リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に入れる。
3. 中膜の albuginea を1組の微細なピンセットでそっと取り除いてください。
4. ティッシュグラインダーで氷冷 PBS を 3 mL 追加し、ゆるいガラスの乳棒を使用して穏やかな機械的力によって組織を triturate します (ガラス乳棒をタイプします)。
   注:このステップの目的は、細胞を溶解することではなく、組織を引き離すことである。細胞の生存率と完全性の維持が重要である。
5. 組織懸濁液を細胞培養皿 (直径 10 cm) に移し、氷冷 PBS を6ml まで添加する。
6. 液体が皿の底を均等に覆うように、プレートを素早く振ります。組織が適切に接地されている場合、均一に分布した seminiferous 尿細管が目に見えるが、組織集塊の....

Results

ECLIP の手順と結果を図1、図 2、図 3、図 4に示します。マウスを、手術用ハサミを用いて下腹部に二酸化炭素と小切開で安楽死させた (図 2a、B)。マウスの精巣を除去し、detunicated した後、粉砕後に UV 架橋した (図 2c−I)。精巣組織において2つの既知の RNA 結合ヘリカーゼを使用した eCLIP の代表的な結果を

Discussion

生物学的および病理上の文脈の両方で RBPs の普遍的な役割の理解が増すにつれて、クリップ法は RBPs^20、32、33の分子機能を明らかにするために広く利用されてきた。 ^34、35。ここで説明するプロトコルは、マウスの精巣への eCLIP 方法の適応された適用を表す。

精巣で eCLIP を行う際の1つの課題は、新鮮な精巣細胞の生存性と完全性を維持することであり、これは効果的架橋にとっても重要である。緩い乳棒を使用して軽度の機械的力で精巣を剪断することは、細胞溶解^32,36を防ぐことができる。RNA の適切な消化は、成功した eCLIP アッ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-mouse MOV10  抗体	Proteintech, China	10370-1-AP
抗マウスMOV10L1抗体	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, China	A7016
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242R
Digital sonifier	BRANSON,USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 Hz
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen,USA	12321D
Miniブロットモジュール	Invitrogen,USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen,USA	A25977
振盪インキュベーター	エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ	Thermomixer comfort
ティッシュグラインダー、Dounce	PYREX、米国	1234F35	のみ  「緩い」乳棒は、このプロトコル
TProfessional標準96勾配	Biometra、ドイツの	シリアル番号で使用されています:2604323
チューブリボルバー	クリスタル、米国	シリアル番号:3406051
UV光架橋剤	UVP、USA	CL-1000
Materials
TC処理されたカルチャーディ	ッシュコーニング、米国	430167	100 mm
チューブ	コーニング、米国	430791	15 mL
マイクロチューブ	AXYGEN 、USA	MCT-150-C	1.5 mL
試薬
酸性フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール	Solarbio, China	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen,USA	NP0005
DH5α competent bacteria	Thermo Scientific, USA	18265017	これらの経済的な細胞は、>1 x 106 形質転換体/µg 制御 DNA per 50 µL反応。
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
ECL reagent	Vazyme, China	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001	add fresh
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
FastAP酵素	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, Switzerland	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
MiniElute gel Extraction	QIAGEN, Germany	28604	column store at 4 ?; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads	Thermo Scientific, USA	37002D	nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA		NP0336BOX 4%–12%、1.5 mm、15ウェル
NuPAGE MOPS SDS バッファーキット	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube	中国、天元	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
Proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR マスターミックス	NEB、ニューイングランド	M0492L
RLT緩衝液	QIAGEN, ドイツ	79216	RNA精製溶解緩衝液
RNAクリーン&コンセントレータ-5カラム	ZYMO RESEARCH, US	R1016	RNA 精製および濃縮カラム
RNase I	Invitrogen, USA	AM2295
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
RQ1 DNase	Promega, USA	M610A
Sample Reducing Agent	Invitrogen,USA	NP0009
SDS Solution	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	protect fromライト
T4 PNK酵素	NEB、ニューイングランド	M0201L
T4 RNA リガーゼ 1 高濃度	NEB, ニューイングランド	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, China	C601-01
TBE	Invitrogen,USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, China	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
X-ray Films	Caresteam, Canada	6535876