ここでは、近赤外染料と免疫組織化学、高分解能走査を併用し、脳領域におけるアッセイタンパク質を測定するプロトコルを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
神経科学は、脳内の細胞が様々な機能を媒介する方法の研究であります.ニューロンおよびグリアにおけるタンパク質発現の測定は、細胞機能が細胞タンパク質の組成および活性によって決定されるため、神経科学の研究にとって重要である。この記事では、免疫細胞化学を近赤外高解像度スキャンと組み合わせることで、異なる脳領域におけるタンパク質発現の半定量的測定値を提供する方法について説明します。この技術は、同じ脳領域内の単一または二重タンパク質発現に使用することができる。この方法でタンパク質を測定することにより、実験的操作、学習と記憶の分子シグネチャ、分子経路での活動、複数の脳領域における神経活動を伴うタンパク質発現の相対的変化を得ることができます。正しいタンパク質と統計解析を使用して、脳領域間の機能的な接続性も決定することができます。実験室で免疫細胞化学を実装する容易さを考えると、近赤外高解像度スキャンで免疫細胞化学を使用すると、神経科学者の能力を拡張して、システムレベルで神経生物学プロセスを調べることができます。
概要
神経科学の研究は、脳内の細胞が特定の機能1を媒介する方法の調査に関するものです。これらは、グリア細胞が中枢神経系において免疫を与える方法などの性質の細胞であるか、または背部海馬におけるニューロンの活性が空間的なナビゲーションをもたらす方法を説明することを目的とする実験を伴うことができる。広い意味では、細胞機能は、セル内で発現されているタンパク質およびこれらのタンパク質2の活性によって決定される。その結果、脳細胞におけるタンパク質の発現および/または活性の測定は、神経科学の研究にとって重要である。
脳内のタンパク質発現を測定するために、多くの技術が利用可能である。これらには、小ペプチド4の受容体密度3およびマイクロ透析のための陽電子放射地形などのインビボの方法が含まれる。より一般的には、ex vivo の方法は、タンパク質の機能および発現を検査するために使用される。これらには、質量分析技術5、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)6、および免疫細胞化学7が含まれる。免疫細胞化学は、神経科学の分野で広く使用されています。この....
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プロトコル
次のプロトコルは、デラウェア大学の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) によって承認されました。男性スプレイグスプラーグラット約 55-75 日は、このプロトコルのために使用されました。
1. 脳の抽出と組織の準備
- ラットが麻酔誘導チャンバ内のイソフルランを有する麻酔ラットはもはや足のピンチに対する反応を示さない。
- ギロチンを使用して急速な斬首を介してラットを犠牲にする。
- 頭蓋骨の後部から前方に皮膚を切断し、頭蓋骨の上からクリアします。
- 慎重に頭蓋骨の後部を除去し、その後、頭蓋骨の正中線をカット小さな解剖はさみを使用して、脳組織を損傷を避けるために、常に頭蓋骨の上に押し上げて、rongeurs を使用してください。
- 脳を露出させるために頭蓋骨の右と左半分を剥がすために rongeurs を使用してください。
- 小さなスパチュラを使用して脳と神経をすくい、慎重に脳を高め、ドライアイス (少なくとも-20 ° c) で冷やしたイソペンタンで脳を凍結させます。この後、スライスするまで-80 ° c の冷凍庫で脳を保存します。
- -9 ° c から-12 ° c の間で維持されるクライオスタット内の 30 ~ 50 μ m の対象領域で、脳をスライスします。直接ガラススライド上にスライスをマウントし、免疫細胞化学アッセイの時間まで-80 ° c....
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結果
免疫組織化学の高解像度スキャンを使用する前に、プロトコルが動作することを確認する必要があります。これは、同じ動物からの脳切片が一次および二次抗体と共にインキュベートされる検証アッセイを用いて、二次抗体単独で、または一次でも二次抗体でも達成することができる。このような検証アッセイの結果を図 2に示す。この反応において、我々は、背部海馬および扁桃体における直初期の遺伝子 c-ジュンを検出した。C-ジュンの発現は、一次および二次抗体が脳組織に適用された場合にのみ認められた。
図 3は扁桃核における二重タンパク質検出を示す。この実験では、同一脳組織におけるα-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受容体と N-メチル-D-アスパルレセプター (NMDA) 受容体の NR2A サブユニッ.......
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ディスカッション
この記事では、近赤外免疫細胞化学を高解像度スキャニングと組み合わせて使用することで、脳組織におけるタンパク質発現の半定量的な測定値を得ることができることを示しています。また、同じ脳領域で同時に2つのタンパク質を標識するために使用することができます.我々は以前、近赤外免疫組織化学を用いて、複数の脳領域9,10における早期の遺伝子発現を測定してきた。早期の初期の遺伝子は、神経活動の尺度として使用することができる。また、これらの半定量的なタンパク質発現の測定を統計分析に適用し、脳領域を、即時初期遺伝子の相関レベル (IEGs) でグループ化することを可能にしました。これを機能的接続性の尺度として使用し、感情学習とメモリ9,10の間の恐怖回路内のノード間のストレスが機能的な接続にどのように影響するかを調べた。我々は、高解像度スキャニング13を備えた近赤外免疫細胞化学.......
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開示事項
作者は何も開示することはありません。
謝辞
この報告書の研究は、DK に授与される NIGMS (1P20GM103653) の助成金によって賄われた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 脳抽出 | |||
| 麻酔誘導室 | ケント・サイエンティフィック | VetFlo-0530SM | |
| クライネ・ギロチン | ハーバード装置 | 73-1920 | |
| フリードマン・ロンガー | ファイン・サイエンス・ツール | 16000-14 | 蓋骨の裏側を取り除くために使用 |
| 繊細な解剖はさみ | フィッシャー・サイエンティフィ | 08-951-5 | 頭蓋骨の正中線に沿って上向きにカットするために使用されます |
| マイクロスパチュラ | フィッシャー サイエンティフィ | 21-401-5 | 脳をすくい取るために使用されます |
| ガラス顕微鏡スライド | フィッシャー サイエンティフィ | 12-549-6 | |
| 免疫組織化学反応 | |||
| Triton X-100 | パラホルムアルデヒドに固着した細胞を透過処理する中性界面活性剤として使用され、宿主血清や二次抗体と組み合わせた中性界面活性剤としても使用されます | ||
| Tween-20 | TBS に少量添加した洗剤として使用され、一次抗体Licor Odysseyスキャナーでスライドをカバースリップした後、TBS-Tを調達します | ||
| Licor Biotechnology Inc. | |||
| イメージスタジオ | リコーバイオテクノロジー株式会社 |
参考文献
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al.
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再版と許可
