小動物陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影における連続的な血液サンプリングにより、動脈入力機能の測定が可能

サマリー

ここでは、動脈入力機能(AIF)を測定するラットのPET/CTイメージング中に連続的な血液サンプリングを行うプロトコルについて説明する。カテーテル法、システムの較正およびセットアップおよび血液放射能のデータ分析が実証される。生成されたデータは、後続のバイオキネティックモデリングの入力パラメータを提供します。

要約

陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)データの定量分析および生運動モデリングでは、動脈入力関数(AIF)とも呼ばれる時間的血液時間活動濃度の決定は、特に重要なポイントである。動物病モデルの特性化と新開発の放射線トレーサーの導入のため。血液中の放射線トレーサーの利用可能性の知識は、組織活性のPET/CT由来データを解釈するのに役立ちます。この目的のために、PET/CTイメージング中のオンライン採血はAIFを測定することをお勧めします。手動採血および画像由来のアプローチとは対照的に、連続的なオンライン採血にはいくつかの利点がある。最小の失血に加えて、改善された決断および血活動の測定のための優秀な正確さがある。しかし、オンライン採血の主な欠点は、動物の大腿血管をカテーテル化するための高価で時間のかかる準備である。ここでは、小動物PET/CTイメージング中のカテーテル法と連続血液サンプリングのための簡単で完全なワークフローを説明し、手動採血と画像由来のアプローチと比較した。この高度に標準化されたワークフローを使用して、フルオロデオキシグルコース([18 F]FDG)AIFの決定が実証される。さらに、この手順は、トレーサー運動性およびモデル特性の基本的な知識を作成するために、異なる動物モデルと組み合わせて任意の無線トレーサに適用することができます。これにより、腫瘍学的、神経変性および心筋疾患の前臨床研究における診断および治療アプローチの両方において、医薬品の挙動をより正確に評価することができます。

概要

ポジトロン放出断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)は、トレーサーとも呼ばれる放射性標識リガンドの注入後、体内の代謝過程を可視化できる核イメージング技術です。リガンドは代謝経路に関与する分子であるか、細胞表面タンパク質を標的とする分子であるのに対し、放射性標識は陽電子放出放射性核種である。ガンマ線は、陽電子崩壊によって間接的に放出され、体外PET検出器を用いて生物内での分布を検出することができます。このようにして、異なる細胞分子を標的にすることができます:神経伝達物質受容体およびトランスポーター、グリシスまたはミトコンドリアタンパク質のような代謝プロセス、トランスロケータタンパク質18 kDa(TSPO)のような代謝プロセスは、活性化グリア細胞を検出する。

前臨床研究では、PET/CTは生体内で非侵襲的な方法で生化学的プロセスを研究する魅力的な方法であり、縦方向の研究を可能にします。PET/CTデータは、疾患メカニズムの分析、新薬の特性と薬物動態の評価、翻訳研究のための現在および新規の放射線トレーサーの両方の検証をサポートします。

PET/CT解析中に3つのトレーサー状態を定義することができます(2組織コンパートメントモデルの例):まず、トレーサーは、その適用後に血液中に流れます(状態1;conc.[_血液])。第二に、毛細血管床を介して組織に入り、細胞外空間内を自由に移動するか、または多様な細胞または細胞外構造に特異的に結合されていない(状態2;conc.[unspec])。第3に、トレーサーは、その標的分子(状態3、conc.[spec])に特異的に結合することができる(代謝捕捉の有無にかかわらず)。コンパートメント間のすべてのこれらの動的プロセスは、ある程度双方向であり、拡散プロセスはレート定数(K1、k2、k3、およびk4)によって記述される。血液中のトレーサーの濃度(すなわち、状態1)は「入力」と呼ばれるが、非特異的および具体的に結合されたトレーサーの濃度(すなわち、状態2および状態3)は「出力」と呼ばれ、PET画像から直接誘導することができる。この生理的関係は、2組織コンパートメントモデル(図1)に表示することができる。

図 1: 2つの組織区画モデル。3つの異なるトレーサー状態の生理学的状態とそれらの間の動的プロセスが表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

理想的な場合、conc._[spec]は、その標的分子の濃度に比例します。ただし、PET/CT測定の出力は、コン_ク[仕様]とconc.[unspec]の合計です。対象領域_{におけるconc.[spec]を}決定するために、標的タンパク質/経路を欠損する基準領域のconc[unspec]_が決定される。適切な数式を使用することで、コンパートメントモデル(バイオキネティックモデリングアプローチ)を最も一般的に使用して、conc.[spec]を計算できるようになりました。しかしながら、多くの場合、標的タンパク質を欠損するような基準領域は^利用できない1,2である。これらの場合、conc._{[血液] を}使用して conc._{[spec] を}決定できます。conc.[_{血液]は、}異なる肝臓および腎臓のクリアランスによって変化するので、排泄、血流、異なる脳血門関浸透および疾患関連因子3、現在のゴールドスタンダードは、簡潔な基準を測定_{する。血液」は}連続的な血液サンプリングによるPET/CTスキャンと並行して行います。これは、^時間の経過とともにconc.[_血液]として定義される動脈入力関数(AIF)を与える。注意して、連続的な血液サンプリングを行うことは、特にラットまたは^マウス5のような小動物において、技術的に非常に困難であると考えられる。

ここでは、大腿静脈と動脈の間の動脈(a-v)シャントを介してラットからの血液を継続的にサンプリングするための簡単で実用的なプロトコルを提供します。市販の検出器ポンプシステムと組み合わせることで、ラットの^動的[18F]フルオロデオキシグルコース([18F]-PET/CTスキャン中にリアルタイムで連続的なAIFを生成し、代替アプローチと比較することができます。PET/CTイメージングは、マルチモダリティPET/CTスキャナを用いて平均重量462g±33g(平均±標準偏差)で4ヶ月齢の雄スプラードーリーラットで行った。

一連の測定(線量キャリブレーター、オンライン血液サンプラー、PET/CT、およびウェルカウンター)の間に多種多様な装置が使用されるので、クロスキャリブレーションと呼ばれる品質管理手順は、すべてのシステムの定量的精度をチェックし、違いを補う。オンライン血液サンプリングのコンテキストにおけるクロスキャリブレーションは、補正されたPET画像で測定された所定の活性濃度のカウントレートを、同じ濃度のツイライト系で測定した濃度に変換できることを意味します。そこで、PET/CT間のクロスキャリブレーション手順、血液採取系、およびウェルカウンターが確立されている。

この高度に標準化された方法論は前臨床小動物の研究の代謝および細胞プロセスを定量化する強力なアプローチを提供し、AIFの信頼性および再現性を改善する優雅な方法である。AIFは、バイオキネティックモデリングを使用して前臨床PET/CTデータの組織内の特異的結合トレーサーを定量するために使用することができます。

プロトコル

すべての動物の取り扱いと実験は、メクレンブルク西部ポメラニア州動物研究委員会によって承認されました (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, 承認: 03.04.2018).実験は、ARRIVEガイドラインに従って行われました。

注:動物は、水と食品のアドリビタムと標準的な条件(22±2°C、12時間の昼夜サイクル)の下で保たれた。シャントシステムの準備に必要なすべての機器、操作手順、実際の測定値は、材料の表に記載されています。

1. 動物のカテーテル法の準備と外科的処置

1. 水への自由なアクセスと少なくとも12時間の動物を速く。麻酔の場合は、ラットを誘導室に入れ、酸素/イソファランミックスで連続的に充填します。開始使用の場合は2.5-3.5%のイソファランとメンテナンスのために1.5-3.0%(流量1.2-1.5 L/min)。
   注: 断食は、トレーサー^[18F]FDG を使用するスタディには必要ですが、他のトレーサーには必要ありません。セクション4で説明する手動血液引き出しを使用してグルコース血中濃度を測定することは、安定した値を確保するか、運動モデリングで修正することをお勧めします。
2. 麻酔されたラットを加熱マットの後の位置に置き、外科顕微鏡の下に置き、目に獣医の整分を加える。直腸プローブで実験中にラットの体温を連続的に監視し、維持します(37 ± 0.5 °C)。
3. ラットの脚を作業面にテープで留め、脚を位置に保持します。粘膜消毒剤で手術部位を消毒し、ラットの脚と股(操作側)を剃ります。消毒剤で最終的なクレンジングで仕上げます。
4. ラットの鼠径部に外科鉗子とはさみを用いて約20mmの切開を行う。細かい皮膚層を解剖し、大腿静脈、動脈および神経をマイクロ鉗子で露出させる。各大腿静脈と動脈の下に2つの細かいフィラメントを置きます。
5. 各遠位フィラメントで静脈と動脈をシールし、ブルドッグクランプで緊張の下で保持します。
   近位縫合糸フィラメントを使用して、ブルドッグクランプ(結び目なし)を使用して容器を張合します。
6. 動脈瘤クランプ近位で静脈をブロックしますが、ブルドッグクランプで縫合糸から2〜3mm遠位。角膜はさみを使用して静脈(直径の1/3)に小さな切開を行い、無菌綿スワップで漏出した血液を除去します。鈍い鉗子で静脈を拡張し、それを開いたままにします。シャープなカテーテル(内径[ID]:0.58mm、外径[OD]:0.96mm)を静脈に挿入し、動脈瘤クリップまで近位方向に押し込みます。
7. 動脈瘤クリップを開き、カテーテルを近位方向(約2〜3センチメートル)に押し、カテーテルが右に置かれると、血液がカテーテルに流れ込む。2つの結び目を作ることによって近位縫合でカテーテルを固定する;必要に応じて、静脈とカテーテルの周りに追加の縫合糸を配置します。ヘパリン化生理食液(50単位/mL)の100 μLで満たされたインスリン注射器(30G針)を洗い流し、吸引することによってカテーテルの機能を確認してください。
8. ステップ 1.6 と 1.7 を繰り返して、動脈にカテーテルを配置します。
9. 両方のカテーテルが正しく置かれたら、縫合糸で足を閉じ、PET/CTに動物を運ぶ。
   注:動物の輸送中にカテーテルで可能な限り注意してください、そうでなければカテーテルのシフトが発生する可能性があります。

2. シャントシステムのセットアップ

図 2:測定設定のスキーム。(A) 測定設定の概略図。(B) ツイライト検出器、蠕動ポンプ、異なるコネクタタイプを備えた接続シャントシステムの写真。動物(1)がPET/CT(2)でスキャンされている間に、ラットの血液中の放射能の時間経過が検出される。従って動脈(a)および静脈(b)カテーテルはアダプタの部分(コネクタオレンジ、コネクタ青およびコネクターの緑)を介して検出器ポンプシステムに接続される。動脈血液は、検出器(3)を介して動脈カテーテルから蠕動ポンプ(4)に送り込まれ、静脈カテーテルを介して体内に戻される。3ウェイバルブ(7)は、トレーサー注入、手動血液の描画とすすりを行うためにチューブシステムに統合されています。Tピース(8)を組み立てて活性を注入する。検出器は、連続的な血液データを表示、校正、修正するためにコンピュータに接続されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1. 細かい穴のポリエチレンチューブ(FBPT)の6つの部分を切り取ります(ID:0.58 mm、OD:0.96 mm)c = 735 mmの長さで切り取ります。e = 100ミリメートル;f = 171 mm, g = 875 mm;h = 90 mm およびi = 75 mm (図2)シリコーンポンプチューブ(ブラック/ブラック、ID:0.76mm、OD:2.48mm)の8つの部分を切り取り、長さは約20mmです。
2. シリコーンポンプ管dの両端に(ID 2.5 mmからID 1.5 mmまで)(イエロー/ブルー/イエロー、ID:1.52 mm、OD:3.20 mm)を配置します。使用するリダクション コネクタのもう一方の端に、シリコーン チューブ (ブラック/ブラック/ブラック) の準備済みの 20 mm 部分を配置します (図 2のコネクタ青を参照)。
3. FBPT の準備済み部分cを、シリコン ポンプ チューブdの一端に青色(イエロー/ブルー/イエロー)、および組み立てコネクタコネクタの準備済み部分e を青で組み立てます。他の端。2つのTピース5と6の両端にシリコーンチューブ(黒/黒/黒)の準備された20mm部分を置きます(チューブTコネクタID:1.5mm、図2のコネクタグリーンを参照)。
4. FBPTの部分eの自由端を組み立てられたコネクターの左側に緑色(5)接続し、FBPTの準備された部分fをコネクタグリーン(5)の反対側に置きます。 組み立てられたコネクタの左側にFBPTの部分fの自由端を緑(6)に置き、FBPTの準備済み部分gをコネクタグリーン(6)の反対側に置きます。 組み立てられたコネクタの自由端にFBPTの準備された部分hを、組み立てられたコネクタの緑(5)とFBPTの準備された部分iを、組み立てられたコネクタの自由な端に緑(6)に加えます。
5. コンビストッパーを皮下針(G 23 x 1 1/4'/ø 0.60 mm x 30 mm)に接続し、3ウェイバルブに追加します。FBPTの部分hの自由な端に針が付いている準備された三方弁を置く。皮下注射針にコンビストッパーを接続し、FBPTの部分iの自由な端に針を置きます。
   注: オンライン採血を開始する前に、セクション 5 を参照してください。
6. FBPTの部分cおよびgの自由な端をヘパリン化生理食液(50単位/mL)の20 mLで満たされた100 mLビーカーに入れる。シャントシステムが生理生理生理生理液で完全に満たされるように、流量1.52 mL/minの蠕動ポンプを開始します。その後、部分cとgの端部とFBPTの部分iの中央に3つのはさみクランプをセットしました。
7. FBPT のパーツcおよびgからはさみクランプを取り出します。動脈カテーテルaをFBPTの部分cの自由端に接続し、静脈カテーテルbをFBPTの部分gの自由端に接続する(図2のコネクタオレンジを参照)。

3. 画像の取得と再構築

1. シャトルベッドパレット(70mm)の頭の位置に動物を置きます。ラットの呼吸を制御し、画像取得を通じて加熱パッドと直腸プローブを使用して体温を37±0.5 °Cに保ちます。シャトルベッドを注射用の拡張ベッド位置(取得前)に移動し、挿入されたカテーテルをシャントシステムに接続します。
2. イソファルラン(酸素中のイソファルラン2.5%、流量1.2-1.5 L/min)を鼻コーンを介して麻酔下に置きます。
3. 1.52 mL/minの流量で蠕動ポンプを起動し、シャントシステムを動物の血液で満たします。シャトルベッドをPET検出リングの視野の中央に移動し、オンライン採血システムを開始します(セクション5を参照)。
4. 60 sの後にセクション3.5に記載のパラメータを使用してPET/CTワークフローを開始し、その後、Tピースを介して約0.5±0.1mLの体積で約22 MBq^[18F]FDGの用量を注入します。その後、約150μLのヘパリン化生理理液でTピースを洗い流します。
5. 60分以上のダイナミックPETとPETイメージングの最後にCTスキャンを取得します。
   1. PET放出取得の場合は、時間オプションで取得に3600 s(60分)を設定します。研究同位板として F-18 を選択し、エネルギー レベルとして 350-650 keV を使用し、タイミング ウィンドウとして 3,438 ns を使用します。
   2. CT 取得の場合は、取得オプションで減衰スキャンを選択します。[投影設定] フィールドで、半分の合計回転に対して 120投影を選択します。視野(FOV)と解像度の設定では、275 mm軸スキャン長のバインディングとして低倍率と4 x 4を選択し、3328 pxを経軸CCDサイズとして選択します。露光設定フィールドでは、電流の場合は500 μA、電圧では80kV、露光時間は180ミリ秒に設定します。
   3. PET発光ヒストグラムの場合は、ダイナミックフレーミングとして20フレーム(6 x 10秒、8 x 30秒、5 x 300秒、1 x 1800秒)を設定します。遅延として減算を選択します。高度な設定フィールド 128 をsinogram幅として選択し、3をスパンとして、リング差とデッドタイム補正として 79 を選択します。
   4. PET の再構成では、2 次元順序付きサブセット期待値の最大化 (2D-OSEM) を使用して、散布シノグラム、4反復、フーリエを再構成アルゴリズムとして再ビニングします。マトリックスサイズとして128 x 128を選択し、1をイメージズームとして使用し、すべてフレームとして、すべてのセグメントとして使用します。

4. 手動採血の手順

1. 撮像集録を開始した後、手動採血を30s、60s、90s、600sおよび1800sに行う。
   注:特にトレーサー注射後の最初の1分以内に手動血液の採取数を増やすことを強くお勧めします。したがって、血液サンプル体積は、サンプル6当たり20〜30μLに減少する必要があります。
   1. 最初の3ウェイバルブを開き、トレーサー注射後に毛細血管採血EDTAチューブ30sに100μLの動脈血液を集めます。他の時点についても同じ手順を繰り返します。空のチューブと血液充填チューブの重量を決定します。
   2. ウェルカウンターで180sの全血の活動(カウント/時間単位)を測定し、後でkBq/mLでデータを得るためにクロスキャリブレーションされます。ウェルカウンタ測定の開始時刻を記録します。kBq/mLで手動血液サンプリングの各時間ポイントの全血の活動を計算し、減衰補正を適用し、時間活動曲線でデータを転送します。

5. オンライン採血の手順

1. チューブガイドを使用してチューブを検出器に入れます。血液サンプラーソフトウェア(例えば、PSAMPLE)を起動し、集録インターフェースを開きます。オンラインの血液サンプリングセットアップとPET/CTのコンピュータが時刻同期であることを確認します。
2. トレーサーを注入する前に、スタートボタンを正確に60度押して、背景補正に十分なデータを取得します。測定後、PMODデータベースの保存ボタンを介して生データを保存します。
3. オンライン血液データの補正と校正については、補正インターフェースに切り替えます。減衰補正を有効にし、18 F. 画像取得の開始時刻を定義し、平均ボタンで背景補正を実行できるようにします。前に決定したキャリブレーション係数でキャリブレーションとタイプを有効にします(セクション7.1を参照)。
4. 保存TACボタンを使用して修正および校正された血液データを保存し、ファイルblood.crvを選択します。このファイルは、運動モデリングツールに全血入力曲線としてロードすることができ、運動モデリングを実行することができます。余分な肉体シャントシステムからカテーテルを切り離します。
5. PET/CTスキャナから動物を切り離し、ペントバルビタールで安楽死させる。
   注:この実験では、実験設計におけるインビトロ分析に脳を用いたため、測定後に動物を安楽死させた。この設定では、縦方向の研究で繰り返し測定も実装可能⁷.次の動物のための完全に新しいチューブシステムを使用してください。

6. 画像派生入力機能

1. PMODでヒューズツールを開きます。PET イメージを入力として読み込み、CT を参照として読み込みます。既に一致しているクリックします。
2. 対象のボクセル (VOI) ツールを開きます。CT の昇順大上部内にカーソルを置きます。正確に 0.7 mm の半径を定義する VOI 統計ボタンで時間活動情報を抽出し、平均値をクリップボードにコピーします。

7.ツイライトシステム、PET/CTおよびウェルカウンターのクロスキャリブレーションの手順

1. ツイライトペット/CTキャリブレーション
   注:ツイライトのキャリブレーションのための提示されたワークフローは、PMODのPSAMPLEモジュールのリファレンスマニュアルに記載されている手順に部分的に基づいています。
   1. ^[18F]FDGの約100 MBqで注射器を充填します。キャリブレーションされた用量キャリブレータで正確な活動A _Fを測定し、測定の日時と完全なシリンジの体積と一緒にそれを文書化します。記録された時間は、すべての減衰補正を実行するための基準時間ポイントです。
   2. 500 mLの水道水でビーカーを満たします。正確な容積は計量方法によって決定される。適切で校正された精密スケール(少なくとも精度クラスII)で空のビーカーの重量m _eを測定します。ビーカーを水道水で満たし、フルビーカーの重量mfを測定します。
   3. 質量と水道水の密度の差を使用してビーカーの体積Vbを計算します(r = 0.998 g/mL、20°C)
      
   4. 充填ビーカーに[18 F]FDGを注入し、空のシリンジを不活性な水道水で元の体積に補充し、用量キャリブレーター内の補充シリンジの活性AEを測定する。ビーカー中の溶液の活性濃度cbは、約200kBq/mLであるべきである。
   5. ビーカーからの溶液で50 mLの円錐遠心管を充填し(大きな気泡を避ける)、PET/CTスキャナの視野に中央に配置します。PET/CTイメージング実験で使用されるタイプと同じカテーテルを充填し、ツイライトシステムのチューブガイドに入れます。蠕動ポンプを使用してビーカーからトレーサー溶液でカテーテルを充填します。
   6. セクション5で説明するように時間活動曲線の測定を開始し、積分時間に同じパラメータを用いて、実験と同様に再ビニングし、測定ヘッド内のカテーテルガイドを含まない。この手順により、適切な背景補正に十分なデータを取得できます。2分後、ツイライトシステムのデータ取得を停止することなく、充填チューブでカテーテルガイドを測定ヘッドに入れ、約5分間データ集録を継続する。
   7. 50 mL円錐遠心分離管の10分PET取得を並行して開始し、その後減衰補正のための標準的なCT取得を開始する。セクション3で説明する同じPET再構成アルゴリズムとパラメータを使用して、50 mL円錐遠心管の静的PET画像を再構築します。後処理イメージングツール(例えば、PVIEW)を使用し、50 mL円錐遠心管の再構成されたPET画像の内部に体積の約70%をカバーする円筒形VOIを配置します。VOI内のkBq/mLで平均活性濃度c _PETを抽出する。
   8. 血液サンプラーソフトウェアに戻り、キャリブレーションモードを使用して、取得したTACの減衰、分岐分数、背景を修正します。核種、活性濃度、PET取得開始時刻に必要なすべての情報を追加します。内部的には、ソフトウェアはツイライトシステム(CR_{ツイライト)}で測定されたカウントレートを抽出し、PETおよびツイライトシステム(CF_{PET/ツイライト)}のクロスキャリブレーション係数を計算します。
      
      注:分岐分率は、PET再構成プロセスで補正される異なる同位体間で異なるため、キャリブレーションとPET/CT実験の両方に同じ同位体を使用することが重要です。この手順は、システムの重要なコンポーネント(例えば、チューブ、取得および再構成パラメータ)を変更した場合、および修理作業後、品質管理の面で定期的に繰り返す必要があります。
2. PET/CTウェルカウンターキャリブレーション
   1. ウェルカウンタのキャリブレーション係数CF_{ウェルカウンター}を計算するには、ツイライトシステムの較正のためにビーカーで生成されたのと同じ活性溶液を使用します。ウェルカウンターのシンチレーション検出器のデッドタイム効果を最小限に抑えるために、減衰による特定の活性の低減を可能にするために約6時間待ちます。蒸発を避けるためにビーカーをふたします。
   2. 基準点までの正確な時差を算出し、元の活性濃度を補正してビーカーの溶液の実際の活性濃度c(t+)を決定する。実験内で測定された血液サンプルの体積(例えば、200 μL)と同一のピペット定義体積(V_{サンプル)}を、ビーカーから5つのセーフロックチューブにします。180sの井戸カウンターで5つの管のそれぞれの活動を測定する。
      注: 単一の測定の変動係数が 1% を超える場合は、測定時間を増やす必要があります。各チューブの1分あたりのカウント数[cpm]と測定開始時間の測定カウント率を記録します。減衰補正を実行します。
   3. ビーカーの減衰補正活性濃度でウェルカウンターの減衰補正カウント率CRウェルカウンターを割って各測定のキャリブレーション係数CFウェルカウンターを算出c_{ビーカー(t+)}:
      
   4. 平均キャリブレーション係数を得るために5つのキャリブレーション係数を平均します。

結果

シャント システムの設定を図 2に示します。30分の期間にわたる3匹の野生ラットにおける手動採血データと比較した連続血液採取データの代表的な結果を図3A,Cに示す。連続的な血液サンプリングの開始時に、初期ピーク(放射能濃度の最大値)は、トレーサー注入後5sで見ることができます。その後、血液中の活動は急速に低下し、約15分で高原に達する。手動採血データでは、検出されたピークは小さく、高原を定義することは容易ではありません(図3A,C)。連続血液サンプリングと画像由来データの比較を図3B,Dに示す。画像由来データでは、高原のピークと始点がはっきりと見えるが、それにもかかわらず、ピークの最大値はすべての動物の連続的な採血データと比較して小さい(図3B,D)。

我々のセットアップとの連続的な血液サンプリングの最適でない結果を図3E,Fに示す。連続的な血液採取の開始時に、血液凝固のために最初の3.5分以内のデータ獲得は不可能であった。コネクタオレンジでチューブシステムを切断し、ヘパリン化生理液で浮遊することにより、チューブシステムの流れを再開し、測定を続けました。ピークは約4分で見ることができ、血液中の放射能の最大値を記録していない(図3E,F)。手動採血(図3E)および画像由来分析(図3F)は依然として可能であり、正しい結果に匹敵する。

図 3:手動採血と比較した連続的な血液採取の代表的な結果。手動採血(左列)と画像由来アプローチ(右列)と比較して、連続的な血液サンプリングから得られる典型的な動脈入力機能が示されている。パネルA-Dは、2つの異なる動物におけるプロトコルの正しい実装の結果を示す。パネルEおよびFは測定の最適でない結果を示す。 表示されるすべてのデータは、クロスキャリブレーション係数と背景について修正されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

提示された結果は、野生型ラットと比較してハンチントン病のトランスジェニック動物モデルにおける神経活動に関する大規模なプロジェクトから抽出される。合計30個のトランスジェニックおよびワイルドタイプラットをカテーテル化し、[18F]FDG-PET/CTと並行して手動およびオンライン血液サンプリングを行った。野生型ラットの3つのAIFを示し、プロトコルの可能な結果の範囲を示す。ハンチントン病の動物モデルにおける神経活動の変化に関するプロジェクトの結果は、他の場所で公表される予定です。

ここで説明した方法は、大きなコホートでの迅速かつ正確な連続的な血液サンプリングを可能にし、小動物における動的PET/CTデータの運動モデリングのためのギャップのないAIFを提供します。外部の血液循環は、動物の血液中の実際の時間活動を検出するために生成されます。その結果、血液の損失が回避されます。外科的処置はJespersen^ら8に基づいており、PET/CTの測定の間に動脈採血の必要性を満たすために変更された。シャントシステムはウェーバー^ら9によって検証された。ここで使用されるセットアップでは、約1.1 mLの外部血液量が検出器ポンプシステムを介して実行されています。生後4ヶ月のラットの総血液量は約30mLである。大腿静脈および動脈の直径は約0.45-0.6 mm¹⁰であり、使用されるカテーテルを挿入するために少し澱粉する必要がある。

AIFはまた散発的な手動採血によって測定されるか、またはPETイメージ自体の初期の時点から再構成することができる(画像由来)。両方のアプローチは、ここで提示されたデータで行われ、連続的な血液サンプリングと比較した。

手動採血と比較して、オンライン採血では、顕著な高い時間分解能(ここでは、30分あたり1800データポイント)が可能になります。手動血液採取(ここでは、30分あたり5つのデータポイント)は、これらのサンプルが動物の循環に戻ってポンピングされないため、小動物に存在する血液量に制限されます。さらに、10~15秒の最大間隔は技術的に実装可能であり、運動モデリングのための重要な情報は見逃されます。これは提示されたデータでも見ることができ、連続的および手動採血の検出された最大値の差は明らかである(図3A,C,E)。オンライン採血では、検出されたピークは昇順大器11の画像由来入力関数よりも高かった(図3 B,D,F)。イメージ派生入力機能は、部分的なボリューム効果¹²の原因となる PET スキャナの空間解像度に制限され、再構築された時間枠の影響を受けます。

この連続的な血液採取のプロシージャの一般的な利点は、トレーサーがカテーテルを介して適用できることであり、これは横尾静脈を介した注射よりも妨害を起こしにくい。トレーサーは、チューブ システムの先頭にトレーサーが残らないように、適度なボリュームで適用する必要があります。Tピースの死んだ体積に活性が残らないようにするために、その後ヘパリニ化生理液で洗い流される。さらに、輸液ポンプの使用は、トレーサー注入の速度の調節を可能にし、手動採^血13による最大放射能ピークのより協調的な獲得に寄与することができるので助言される。

プロトコル処理中に発生する可能性のあるいくつかの問題があり、次のトラブルシューティングで処理できます。カテーテルの最適でない位置は、プロトコルの不完全な実行につながる可能性があるため、それらが近位縫合糸で正確に固定され、カテーテルが2〜3cm近位に容器に押し込まれるようにする。また、フィブリン接着剤を用いることができる。また、血栓の形成は、カテーテルを詰まらせることができます。これは、ヘパリン濃度を増加させ、カテーテルまたはチューブシステムのその後のフラッシュを増加させることによって処理することができる。このようなカテーテルの目詰まりによる最適でない結果が結果に示され、最大ピークが見逃される(図3E)。動物の保護と幸福に関するもう一つの重要なポイントは、体外血流の長さです。したがって、チューブシステムの長さを最小限に抑らすことが推奨されます。

採血を行う場合、結果として得られるAIFの3つの補正を考慮する必要があります。まず、プラズマ補正。トレーサーは血漿と血液細胞の間で平衡化します, 主に赤血球.これらの拡散プロセスの速さに応じて、利用可能なトレーサーは主にプラズマに存在します。一部のトレーサーでは、より親油性のものなど、全血に対する血漿の比率を考慮する必要があります。このような場合、プラズマ活性を決定する必要があります。^[18F]FDGを使用する場合、血漿と赤血球の間で非常に速く平衡化し、血漿中の[18 F]FDGの利用可能性は全血中と同様であるので、血漿活性を決定するために血液を遠心分離する必要はありません。第二に、代謝産物補正。多くのトレーサーは全血中で代謝され、これらの代謝産物の一部はまだ放射性^標識14.この分数はAIFに存在しますが、組織取り込みには使用できません。いくつかのトレーサーの代謝産物は、全血または血漿中で決定する必要があり、AIFを修正する必要があります。第三に、分散補正。分散は、(a)末梢サンプリング部位に対する組織内のトレーサー到着時間(遅延補正)と(b)およびAIFの形状の塗りつぶしとの間の系統的時差を含むいくつかの要因によって引き起こされる。チューブシステム内では、その最初のオーダーラグ(PT1)運動学の影響を受けます。IIDA et al.¹⁵によるモデルを中心に、デコンボリューションに基づくいくつかの補正が提案されているが、そのほとんどはノイズの影響を受けやすい。反畳を回避し、したがってノイズが発生しにくい補正方法が、Munk et al.¹⁶によって提案されている。補正パラメータを推定するために必要な測定は、使用するチューブとトレーサーの組み合わせごとに実行する必要があります。分散補正は、時間遅延^補正17の前に行う必要があります。しかしながら、主に高速組織灌流プロセスは分散の影響を受け、また示されているが、[18F]FDGのモデリングのために分散補正は絶対に必要ではない18。したがって、提示された例では、AIFの分散補正は適用されていない。

オンサイト用量キャリブレータの適切なキャリブレーションとその定期的な品質管理は、ここで提示されるクロスキャリブレーション手順のタイプの前提条件です。しかし、動物に投与された活動を同じ用量口径測定で測定した場合、偏差が一定であり、完全なクロスキャリブレーション手順が実行されている場合、精度の偏差は取り消されます。核種特異的な補正(例えば、半減期または異なる分岐比の変化のために)。人間のヘルスケアおよび研究で使用されるPET/CTシステムを調和させるためのそのような校正手順を使用して、少なくとも5-10%の精度は19、20を達成することができる。

このプロトコルの正常な実装によって生成された校正および修正されたOFは、動物疾患モデルの特性評価、新しい治療オプションのテスト、新しいトレーサーの確立、および転送のためのPET/CTデータの定量化を可能にします。別の種に既存のトレーサー。ラットにおける[18]FDG-PET/CTにおける連続的な血液サンプリングは、バイオキネティックモデリングにおける入力の計算に最も信頼性の高い情報を提供する。個々の代謝、特に肝臓クリアランスを考慮に入れることによって、関連する病理学的または治療的効果のより正確な評価が可能である。この実用的なプロトコルによって、前臨床PET/CTデータ分析のより高い効率は容易に実施可能である。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
><<動静脈シャント>
麻酔ステーション	グロップラー
動脈瘤クリップ	Aesculap	FT190T	5 mm、閉鎖力70 g
ブルドッグクランプ	Aesculap		35 mm
解剖はさみBC165	Aesculap	490-866	鈍い、皮膚の準備
加熱マット
インスリン注射器	ブラウン		30G
ニードルホルダー	メディコン	11.62.18
動脈瘤クリップ用マイクロ手術用プライヤー	Aesculap	FT 470T	Yasargil
portex ファインボアポリエチレンチューブ	スミスメディカル	800/100/200	ID 0.58 mm、OD 0.96 mm;カメラ付きPE50相当チューブ
手術用顕微鏡	ライカ		M50 + MC120 HD
縫合糸フィラメント6.0			6.0、ポリプロピレン
縫合糸フィラメント3.0			3.0、吸収性、編組
2つの解剖学的鉗子	ハンマッハーゾリング	HSC601-11	マイクロ手術、45°;
血管または角膜ハサミ	Geuder	G19605	マイクロ手術用ハサミ
PET/CT イメージング
用量校正器 ISOMED 2010	nivia instruments GmbH		トレーサーポーション用
Inveon PET/CT	シーメン
トレーサー (例:18F-FDG)
manuel 採血
毛細血管採血 EDTAチューブ	KABE Labortechnik GmbH		GK 150 EDTA 200 µl
試験管	SARSTEDT		5 ml, 75 x 12 mm, PS
well counter CAPTUS 700t	Capintec		manuel 血液活動の測定
自動採血
BD Venflon TM pro 安全シールド IV カテーテル; 18 G (1.3 mm x 32 mm)	BD	3932269	ルアー接続 (t 接続に適合)
血液サンプラーtwilite two	swisstrace GmbH
コンビストッパー	ブラウン	4495101
ヘパリン			50U / ml、実験前のチューブフラッシングとカテーテル手術中の吸引
下注射針			G23 x 1 1/4 " / 0.6 x 30 mm
マイクロプロセッサ制御チューブポンプ	Ismatec/Cole-Parmer	ISM596	12ローラー、2チャンネル
PMODのPSAMPLEモジュール PMOD
リダクションコネクタ	Ismatec/Cole-Parmer	ISM569A	ID 2.5 mmからID 1.5 mmまで
シリコーンポンプチューブ	Ismatec/Cole-Parmer	070535-17-ND /SC0065Nローラー	ポンプ用(黄色/青/黄ID 1.52 mm、WT 0.84 mm、外径 3.2 mm)
シリコーンポンプチューブ-アダプターチューブ	Ismatec/Cole-Parmer	SC 0107	黒/黒 ID 0.76 mm、WT 0.86 mm、外径: 2.48 mm
TピースまたはT接続	Ismatec/Cole-Parmer	ISM 693A	ID 2.5 mm