ゼブラフィッシュの幼虫を用いて出血性脳卒中の病理学的結果を研究する

Summary

ここでは、ヒト脳内出血 (ICH) の文脈において、ゼブラフィッシュの幼虫における脳の出血について、脳損傷、運動欠損および神経炎症を定量化するためのプロトコールを提示する。

Abstract

世界的な死亡率の高い脳卒中の最も重篤な亜型であるにもかかわらず、脳出血 (ICH) の患者に特異的な治療法はない。臨床的に事前にモデル化された ICH は困難であると証明されており、現在のげっ歯類モデルは人間の ICH の自然不在に乏しい。したがって、ICH における疾患メカニズムの研究および潜在的な薬物発見のための代替前臨床方法論のための緊急の要件がある。

ゼブラフィッシュの使用は、主として、大量の生殖速度と幼虫の透明度を含む、疾患の哺乳動物モデルに対する多くの利点のために、トランスレーショナル研究のためのますます一般的なアプローチを表しています。イメージング。他のグループは、ゼブラフィッシュの幼虫が脳血管発達の遺伝的または化学的破壊の後に自発的な ICH を示すことができると確立した。この方法論の目的は、前臨床 ICH 研究の文脈で、脳内出血の病理学的結果を研究するために、このようなモデルを利用することである。ライブイメージングおよび運動性アッセイを使用することにより、神経炎症に続く脳損傷、運動およびその機能を評価し、定量化することができます。

この研究は、ヒトにおける脳内出血の主要な病理学的帰結が、ゼブラフィッシュの前臨床調査のための貴重な生体内システムとしてモデル生物を強調していて、そのようにしている。この方法論の目的は、前臨床脳卒中コミュニティがゼブラフィッシュ幼虫モデルをげっ歯類への代替モデルシステムとして採用することを可能にすることである。

Introduction

脳出血 (ICH) は、自発的な脳血管破裂および脳損傷、身体障害およびしばしば死につながる実質への出血に関連する最も重篤なサブタイプの脳卒中である¹。ICH²に関連した死亡率および罹患率が高いにもかかわらず、基盤となる病因及び出血後の病理学の理解は未だ欠如している。そのため、ICH を予防または患者の転帰を改善するための特定の治療法はない。私たちの病気の生物学の理解のほとんどは、ICH³の前臨床げっ歯類モデルから来ているが、これらのモデルでの今日までの研究は、クリニック^4,5に任意の成功した治療法を翻訳することができませんでした。この障害は、一部、これらの前臨床モデルのいくつかの制限による、ヒト疾患の自発的性質を容易に不在することができないこと、および哺乳動物⁶においてモデルを生成する侵襲的手術の必要性を含む。さらに、げっ歯類は、無傷組織における ICH への細胞応答の急速な発症を観察することに関して実用的な問題を提起する。げっ歯類のモデルからの翻訳の欠如を考えると, 我々はこれらの実用的な問題を克服し、新しい薬のターゲットを識別するためにある場合、自然の ICH の代替モデルを開発することが不可欠です.

血管の発達の分子機構は、ゼブラフィッシュ (ダニオ rerio)⁷を含む脊椎動物の間でよく保存されている。このように、このモデル生物の採用は、脳血管疾患⁸を研究する上で、これまで以上に有用な機械的戦略となっている。多数のゼブラフィッシュモデルが、脳卒中関連の状態に関連する不在表現型の^{9、10、11、12}を生成している。ゼブラフィッシュの幼虫を使用して病気の病因を調査することは、哺乳類モデル⁸よりも実用的で科学的な利点を提供する。これは、げっ歯類に関連する侵襲的制約のない生体画像化を可能にする高い生殖速度、急速な発達および幼虫の透明度を含む。ゼブラフィッシュ研究コミュニティ内で利用可能な広範囲のトランスジェニックレポーターラインとこれらの利点を結合することは、疾患生物学を研究するための強力なインビボアプローチに相当し、病的な研究にはまだ利用されていないICH の結果。

脳内の血液に対する傷害の応答は、二相性¹³;一次侮辱は、ニューロンの死および細胞壊死を引き起こし、その後、自然免疫活性化によって誘発される二次的な損傷の波を開始する。脳損傷の第2段階は、特に神経炎症性成分が、将来の薬物治療¹³のための現実的な標的と考えられる。自発的および大脳特異的な出血は、ゼブラフィッシュの幼虫に以前は^{14、15、16、17、18、19}に記載されている。このような2つのモデルは、HMGCR 経路およびコレステロール生合成¹⁴を阻害するために24時間後受精 (hpf) でのアトルバスタチン (ATV) の使用であり、 arhgef7遺伝子に hypomorphic 変異を発現する bubblehead (bbh) 変異体、βpix、続いて、血管内結合のタイトなジャンクション¹⁸のアクチンリモデリングを阻害する。これらのモデルは、循環の開始時に自発的な脳特異的血管破裂 (〜 33 hpf) を示す。最近では、これらのモデルをさらに特徴付けて、ヒトとゼブラフィッシュ幼虫²⁰との間で脳損傷応答の重要な側面が保存されていることを明らかにした。本研究では、ゼブラフィッシュの幼虫における自発的な脳出血と、脳損傷を定量化する方法と、人間の状態に関連する運動と神経炎症性表現型を取得し、可視化するために必要とされる方法論を示す。これらのデータと技術は、前臨床 ICH 研究のための貴重な補完的システムとして、このモデル種の使用をサポートしています。

Protocol

ゼブラフィッシュは、前に説明したように、標準条件下でマンチェスター大学生物学サービスユニットで飼育され、維持しました。大人のゼブラフィッシュの畜産は、マンチェスター大学の動物福祉と倫理審査委員会によって承認されました。すべての実験は、英国のホームオフィスの規則に従って行われました (PPL: P132EB6D7).

注: 本研究で使用されるトランスジェニック線には、マクロファージ特異的系譜mpeg1:mCherry (先に記載されたような社内で構築される)、好中球特異的mpo:GFP²³、赤芽球特異的 gata1が含まれる。dsRed²⁴およびubiq:secAnnexinV-mVenus、野生型、真珠層 (mitfa^w2/w2 ) および変異体 (bbhm292) 背景における細胞死のレポーター (ハウス²⁵内に再由来)。図 1は実験のタイムラインを示しています。

図 1: 脳損傷、運動および神経炎症性の結果を特徴付ける実験のタイムラインの図。ICH、脳出血;bbh、bubblehead。フィギュアはクリエイティブ・コモンズ・ライセンスで許可を得て Crilly et al.²⁰から再現されています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1. 0 日目: 卵の生産と収集

1. 1男性と1-2 女性の大人のゼブラフィッシュから作られた繁殖箱で自然な産卵から受精胚を収集します。
   注: アトルバスタチンプロトコルの場合、任意の野生型/トランスジェニック動物を使用することができるが、出血率は株間でわずかに異なる。
2. 標準的な指針²⁶に従ってペトリ皿および段階ごとの標準 E3 の胚媒体の100の胚を28° c で孵化させる。
3. 〜6時間受精 (hpf) で、パスツールピペットを用いて皿から死亡した未受精胚を除去する。

2. 1 日目:24 hpf でのアトルバスタチン治療

1. 鋭い超薄解離鉗子²⁷を用いたアトルバスタチン治療のための Dechorionate 胚。実験に必要な数値は、それに応じて調整できます。
2. 2つのきれいなペトリ皿への E3 の胚媒体の30の mL を加えなさい。100の胚には1皿を使用してください。
   注: プレートが細胞培養用に設計されている場合、この初期段階で dechorionated ゼブラフィッシュは、しばしば底部に付着する。これを避けるために、使用前にきれいな水の中でプレートを十分にすすいでください。
3. 60μ l の胚水を処理プレートから取り出し、60μ l の 0.5 mM アトルバスタチン (ATV) を添加します。0.5 mM のストック濃度では、上記の希釈は1μ m の最終濃度になり、hemorrhaged (ICH-) および〜80の幼虫の hemorrhaged (ICH +) の〜 20% になる。未処理のコントロールにはもう一方のプレートを使用する
   注: アトルバスタチンは、0.5 mM ストック溶液を作るために蒸留水 (3 mg 10 mL に) で可溶化されます。攪拌を伴って暗所で室温で一晩インキュベートすると、可溶化に時間がかかる。完全な可溶化には1週間かかることがあります。DMSO を使用しないでください。溶液を等分し、-20 ° c で保存します。解凍を凍結しないでください。
4. パスツールのピペットを使用して、100の胚をできるだけ少量の水で治療プレートに移します。
5. プレートを28° c でインキュベートします。
   注: ICH は33と 48 hpf の間で発生します。アトルバスタチンは24時間以上インキュベートすると除去する必要がなく、さらなる発達問題を引き起こさない。

3. 2 日目: ICH と ICH + 50 hpf で母集団を分離する

1. ICH + 魚を無形から分離し、新しい料理に簡単に転送します。
   1. 1μ m の濃度で ATV モデルを使用した場合、75-100% の幼虫がこの時点で出血 (ICH +) を呈することになる。
      注: 幼虫の反応は菌株によって異なり、幼虫が所望の周波数で出血していない場合は、アトルバスタチンまたはより高い濃度の新鮮なバッチを使用してください。幼虫が 48 hpf によって出血を示さなかったならば、それを ICH と考えてください。
   2. Bbh モデルを使用する場合、すべてのホモ接合変異体は 48 hpf による出血を呈することになります。ヘテロ接合 incross を使用している場合、ICH-ヘテロ接合および野生型兄弟は実験のための制御動物として使用することができる。
2. 必要に応じて、0.02% の MS222 を E3 培地に添加して幼虫を局部的。パスツールピペットを用いて、新鮮な E3 培地への頭部の血液の存在のために幼虫を選別する。図 2参照。
   注: 頭の中の血液は、前部、中間、後脳、または組み合わせて現れることがあり、出血量は動物によって異なる場合があります。Bbh 変異体において、ICH は、より大きな頭部、眼とより拡散した出血の間のより広い空間によって認識される重度の浮腫と関連していることが多い。しかし、すべての ICH + bbh 幼虫は浮腫を呈するわけではない。

図 2: ICH + 脳内出血の表現型。トランスジェニック gata1 上に維持された幼虫 ICH 表現型の例: DsRed レポーター真珠層の背景を明視野実体顕微鏡 (トップパネル) および蛍光 (下パネル) で観察し、〜 48 h 後受精。ICH 幼虫では出血は認められなかった (左パネル)。脳および後脳 (矢印) における赤血球の明瞭な蓄積は、ICH + 幼虫 (右パネル) で観察された。スケールバーは250μ m を表します。図は、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスの下で許可を得て Crilly et al.²⁰から再現されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. 3 日目:72 hpf で細胞死と白血球分析

1. 幼虫を蛍光顕微鏡でスクリーニングして、蛍光タンパク質の発現を確認する。
   注: 本研究では、トランスジェニックubiq: SecAnnexinV-mVenus 幼虫は、脳細胞死および二重トランスジェニックmpo: GFP を報告するために使用された。mpeg1: mCherry またはubiq: secAnnexinV-mVenus;mpeg1: mCherry は白血球分析に用いられる。
2. 0.02% MS222 を含んでいる E3 媒体が付いている lightsheet の土台の部屋を満たしなさい。
3. 幼虫は 0.02% の MS222 を使用して局部的。単一の液滴中の乾式シャーレ表面に取り付け (n = 1-6) するために幼虫を移送する。できるだけ多くの液体を削除します。
   注: 1.5% 低メルトアガロースは、マイクロ波でメチレンブルーなしで 10 mL の E3 培地に溶解し、使用するまで45° c に保たれた低メルトアガロースの 0.15 g を使用して調製される。
4. 1.5% の低溶融アガロース (45 ° c の熱ブロックで液体として維持) を幼虫に加え、800μ m 取り付け毛細管を使用して、最初に幼虫を引き寄せます。位置決めが正確でない場合、幼虫はアガロースから排出され、再び取り付けられる。Lightsheet 室に挿入する前に、毛細血管を冷却したままにします。
   注: また、この手順では共焦点顕微鏡を使用することもできます。このために、幼虫はガラス底皿のアガロースに横方向に取り付ける必要があります。
5. アイレンズ間 (~ 300 μ m) のヘッドの z スタック画像を取得し、最大強度投影画像に加工します。
   1. 蛍光細胞の総数および全強度蛍光²⁰について収集された画像から脳領域を分析する。
6. 18-24 以上の多投影コンポジットのタイムラプス映像を作成し、白血球の移動性と瀕死の細胞との相互作用を追跡します。
   注: 長期のライブイメージングが実行された場合、1つの幼虫だけが毛細血管に取り付けられます。
7. イメージングが完了すると、euthanize に 4% MS222 の致死の過剰摂取に、装着毛細管から幼虫を追放します。

5. 3 日目:72 hpf で運動アッセイのための幼虫を選択する

1. 局部的の幼虫は 0.02% の MS222 でペトリ皿に入った。
2. 運動アッセイのための n = 24 個の幼虫をランダムに選択し、新鮮な E3 培地に移し、麻酔からの回復を可能にします。
   注: この時点での麻酔薬は、キャッチしやすい遅いスイマーのための選択バイアスを削除します。

6. 3-5 日目:72、96、120 hpf での運動をアッセイ

1. メチレンブルーなしの E3 培地に 72 hpf で選択した幼虫を移します。
   注: 3 つの dpf でアッセイする場合、幼虫は麻酔から回復するのに十分な時間 (> 1 時間) を許容する。
2. 1匹の幼虫を、ピペットを使って24ウェルプレートの 1 mL あたり1Ml でプレートします。
   メモ: ピペットの先端の端を切り、幼虫に損傷を与えないようにしてください。プレートサイズは実験計画により変更可能です。
3. 自発的な水泳を増加させるために白い光驚愕ルーチンを使用して10分間カメラ室とアッセイ運動にプレートをロードします。
   注: スイミングの動作は、カメラ室とトラッキングソフトウェアを使用して追跡されました (資料の表を参照)。
4. 96と 120 hpf で同じ幼虫で実験を繰り返します。測定プレート内の個々のハウジングからペトリ皿に幼虫を移動し、アッセイの間に28° c でインキュベートします。
5. アッセイ完了時に、euthanize は 4% の MS222 の致死的な過剰摂取で幼虫を投与する。

Results

トランスジェニック ubiq を用いた脳細胞死の評価:SecAnnexinV-mVenus は、全ての ich 幼虫には存在しない、ATV 及び bbh モデルの ICH + 幼虫における死細胞の明確で決定的なクラスターをもたらす (図 3)。クラスタは 96 hpf 前に後退します。画像解析を通じて、出血は、脳内の蛍光シグナルの総強度の有意な2倍の増加に関連し、マークされた細胞死を示す。

神経炎症性応答は、脳内のmpeg1陽性マクロファージ細胞の数を有意に増加させることによって ICH + 幼虫で同定される。なお、 mpo陽性好中球細胞の総数も増加したが、これは統計的有意性に達しなかった (図 4)。Mpeg1陽性マクロファージの形態は、細胞が活性、丸みを帯びた、アメーバ様形状を採用するにつれて、ICH + 幼虫に変化することも分かる。これらの活性化された丸い細胞はまた、経時的にモニタリングすることにより、 ubiq:SecAnnexinV-MVENUS を ICH + 幼虫で発現する死細胞の貪食反応の増加を示すことができる (図 5)。ramified プロセスを呈するmpeg1陽性マクロファージは不活性として分類された。

脳内出血は、bbh と ATV モデルの両方の ICH 兄弟コントロールと比較して、72および 96 hpf での運動性の有意な減少と関連している (図 6)。120 hpf での運動は、ベースラインのレベルに近いに回復します。卵のクラッチと株との間のベースライン運動にはしばしば違いがあるので、毎回 ICH コントロールに比較を行う必要があります。

図 3: ゼブラフィッシュ幼虫の脳内出血 (ICH) は定量化可能な脳損傷をもたらす。(A) ich + 幼虫 (右パネル) における脳損傷表現型の代表的な画像を、ich-兄弟 (左パネル) と比較して、72 hpf で表した。明視野画像 (下パネル、スケールバー = 250 μ m) は、ICH + 幼虫における脳出血 (矢印) の存在を実証する。Ubiq:SecAnnexinV-mVenus レポーターライン (トップパネル、スケールバー = 100 μ m) における細胞死を可視化する蛍光顕微鏡を実施しました。瀕死の細胞のクラスターは、hematomal の領域で観察されました。画像は脳のみの領域にトリミングされ、補助ファイル 1のマクロを使用して直径30ピクセル (白線) を超える丸い粒子の総緑色蛍光強度を分析しました。(B) 無処置の脳内での蛍光シグナルの定量化、ich-および ICH + 幼虫は、ATV モデル (n = 12、グループごと、3回の独立反復) で 72 hpf から得られました。ICH + を未処理 (* * p = 0.004) および ICH-(* p = 0.03) 兄弟と比較すると有意差が認められた。(C) bubblehead (bbh) モデルを介して得られた annexinV (n = 12/グループ、2回の独立反復) における ich-および ich + 幼虫の脳内での再結合のための読み出しとしての蛍光シグナルの定量化 72 hpf。グラフには、平均から SD が表示されます。MVenus の蛍光の有意差は、ICH + および ICH 年齢一致の兄弟間で観察された (* * p = 0.002)。フィギュアはクリエイティブ・コモンズ・ライセンスで許可を得て Crilly et al.²⁰から再現されています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: 脳内出血 (ICH) は、ゼブラフィッシュ幼虫脳における先天性細胞性免疫応答を開始する。Mpo について前に説明した脳領域内で定量化された白血球数: GFP; mpeg1: dsRed hpf の二重トランスジェニック幼虫 (n = 1 群あたり8個; 2 回の独立した複製) 72 では、好中球 (* p = 0.01) の有意な増加を明らかにします (p= 0.5)、ICH に対する応答である。フィギュアはクリエイティブ・コモンズ・ライセンスで許可を得て Crilly et al.²⁰から再現されています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: 活性化されたマクロファージ細胞は、脳病変に対する貪食反応を示す。(A) annexinV 陽性細胞 (ramified) に向かって移動するマクロファージを巡回する、代表的なタイムラプス静止²⁰を示す。静止画は、全脳を20x の目的で撮影した一連の画像から得られます。スケールバーは50μ m を表します。マクロファージは、annexinV 陽性細胞を phagocytosing 前にアメーバ様形態 (v) を獲得した (vi, vii)。貪食作用の後、マクロファージは ramified の形態を再開して移動し、annexinV 陽性細胞はもはや見ることができない (viii)。Ramified マクロファージ (#)、annexinV 陽性細胞 (矢印)、アメーバ様マクロファージ (*) が示されている。(B) アメーバ様および ramified 形態を呈する ich-および ich + 幼虫脳内のmpeg1陽性細胞の代表的な画像。スケールバーは50μ m を表します。 (C) アメーバ様 (貪食能) の割合が増加し、ramified (不活性) マクロファージの割合が減少したことが、ich 兄弟と比較して ich + 脳で認められた。フィギュアはクリエイティブ・コモンズ・ライセンスで許可を得て Crilly et al.²⁰から再現されています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6: ICH による脳損傷は、ゼブラフィッシュ幼虫において定量化可能な運動欠損をもたらす。(A) 72、96および 120 hpf において、ich-および ich + bbh 幼虫におけるスイミングトラックの代表例。(B) ICH + 幼虫は、72と 96 hpf の両方で10分の記録期間中にモバイルに費やされた累積時間を大幅に減少させた。有意性は、120 hpf 時間ポイントで失われた脳損傷からの回復にほのめか可能性がある (1 群当たり n = 24 幼虫; 3 回の独立反復; * * * p = 0.00006; * * p = 0.003; ns: p = 0.08)。(C) 120 hpf で未処理および ATV 処理された ich-および ICH + 幼虫での移動に要した累積時間の定量化。ICH + 幼虫は、10分間の記録期間中にモバイルに費やされた累積時間の著しい減少を示した。3つの技術的反復 (n = グループあたり24個の幼虫) を使用して、SD を平均から計算しました (* * p = 0.00004, * * p = 0.0003)。フィギュアはクリエイティブ・コモンズ・ライセンスで許可を得て Crilly et al.²⁰から再現されています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

本研究は、ゼブラフィッシュ幼虫における ICH が、系統的にアッセイおよび定量化が可能な人間の状態の重要な局面を含むする脳損傷応答を誘導することを示している。ゼブラフィッシュは、血管破裂を予防するのではなく、血液誘発脳損傷の標的に焦点を当てた将来の薬物介入研究を支援する自発的な ICH の一貫した再現性のあるモデルを提供しています^17、28。確かに、臨床状況に似た病気発症の急速な性質を考えると、このようなアプローチは、将来的に成功する翻訳のための刺激的な見通しを提供します。

ゼブラフィッシュの幼虫の使用にはいくつかの制限がありますが、それは現像システムや分類学的ランクの使用などですが、このモデルの実際的で科学的な利点は、ICH に新しい洞察を提供すると考えられなければなりません。出血を開始するか、または損傷の後の長期間にわたる細胞プロセスを監視するために外科は要求されない。ゼブラフィッシュの高い吉祥天の組み合わせは、簡単にアクセス可能で大きなサンプルサイズを生成し、幼虫の急速な発達に起因して、実験のタイムラインは、げっ歯類の研究^29,30に比べて著しく減少する。

現在、これらのモデルは、生きている無傷の動物の脳内の自然の ICH に対する即時の病理学的および免疫的反応を解明するために使用するのに適している。潜在的には、このモデルは、予防的または回復促進のいずれかにかかわらず、ICH 治療のための中高スループットの薬物スクリーニングに適応することができる。このように、本研究で提示されたポスト ICH 病理は、前臨床 ICH 研究のための代替の補完的プラットフォームを表している。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24ウェルプレート	Sigma-Aldrich	CLS3527
28 °Cインキュベーター	LMS	210
アトルバスタチン	Sigma-Aldrich	PZ0001-5mg
繁殖ボックス	Thoren Aquatics systems	10011
Daniovision observation chamber	Noldus	n/a
E3 medium 1x			4% Instant Ocean, 500 & micro;L メチレンブルー 1 L dH2O
EthoVision XTソフトウェア	ノルダス	バージョン11
ヒートブロック	Grant-Bio	PHMT-PSC18
インスタントオーシャン	インスタントオーシャン	SS15-10
ライトシート顕微鏡	ツァイ	Z.1
ライトシート顕微鏡取り付けキャピラリー	ツァイス	402100-9320-000
低融点アガロース	プロメガ	V2111
メチレンブルー	Sigma-Aldrich	319112-100ML
顕微鏡	ライカ	MZ95	剖顕微鏡
顕微鏡	カ	M165FC	蛍光顕微鏡
MS222			4gトリカイン粉末、500mLのdH2O、10mLの1Mトリス(pH 9)。pHを~7に調整
P1000ピペット	ギルソン	F144059M
P1000ピペットチップ	スターラブ	S1122-1830
パスツールピペット	スターラボ	E1414-0300
ペトリ皿	コーニング	101VR20
Pipetboy	インテグラ バイオサイエンス	ピペットボーイ
ストリペット 25ml	コーニング	CLS3527
トリカインパウダー	シグマ・アルドリッチ	A5040-25G
トリスベース	フィッシャーバイオ試薬	BP152-1
超微細解剖鉗子	寒天	AGT502
Zenソフトウェア	Zeiss	バージョン2.3