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方法論記事

虚血多灌流損傷の設定における転移性肝腫瘍のマウスモデル

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DOI:

10.3791/59748

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2019年8月30日

 , 
1Department of Surgery, University of Pittsburgh

この記事について

サマリー

臨床的に関連する大腸癌肝転移(CRLM)腫瘍モデルと、腫瘍増殖および転移における肝虚血再灌流(I/R)の影響について詳しく述べる。このモデルは、肝転移成長の手術誘発促進の根底にあるメカニズムをよりよく理解するのに役立ちます。

要約

肝虚血および再灌流(I/R)損傷は、一般的な臨床課題であり、複数の組織および器官損傷を誘発することが示されている避けられない病態生理学的プロセスのままである。最近の進歩と治療アプローチにもかかわらず、全体的な罹患率は、特に基礎となる公示的異常を有する患者において不十分なままであった。積極的な癌の成長と転移の文脈では、外科的I/Rは腫瘍の再発を調節するプロモーターであると疑われる。この記事は、肝臓I/Rおよび大腸肝転移の臨床的に関連するマウスモデルを説明することを目的としています。そうすることで、肝臓転移の促進に対する肝臓I/Rの影響をよりよく理解するために、このモデルを確立し、完成させるのを支援することを目指しています。

概要

肝臓は転移性疾患1の発症のための最も一般的なサイトの一つである。死亡率は、肝臓の腫瘍増殖に関連する合併症にほぼ常に起因する。肝臓に転移性固形腫瘍を有する患者では、手術は疾患制御および可能な治癒的アプローチのための重要な介入のままである。しかし、患者の大半は最終的に再発性疾患を有し、主に肝臓2、3に存在する。肝手術中、術中出血は一般的であり、しばしば輸血を必要とし、血管クランプ法を含む出血を制御するための異なる技術的アプローチを必要とする。しかし、このような措置は肝組織に肝虚血/再灌流(I/R)を引き起こす。肝細胞機能に対するI/Rの悪影響は十分に文書化されている。肝臓I/R侮辱は、炎症経路を介した血流の回復中に炎症性カスケードを点火する 4.肝臓I/R損傷は肝不全に寄与するだけでなく、現在のエビデンスは、I/R損傷が腫瘍細胞の接着を刺激し、転移の発生率および既存の微小転移性疾患の増殖を促進することを示している5。我々は以前、外科的ストレスが原発腫瘍の増殖に役立つだけでなく、循環6内の癌細胞を捕捉することによって転移を促進する免疫細胞の活性化を誘発することを報告した。

ここでは、肝転移マウス腫瘍モデルを確立する手法を詳細に説明する。本モデルでは、肝切除時に臨床的に存在する外科的ストレスの代理として作用する肝虚血再灌流傷害を誘導する方法も提示する。癌注射と肝I/Rの組み合わせ方法は、原発性腫瘍切除を受けた患者におけるCRLMの発症を正常に解釈することができる。

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プロトコル

すべての動物プロトコルは、機関動物管理および使用委員会によって承認され、国立衛生研究所(NIH)ガイドラインに準拠しています。あらゆる外科的処置に使用される器械は十分に殺菌された。

1. 初期準備

  1. マウス脾臓に癌細胞を注入する前に、オートクレーブと手順中に使用されるすべての器具を殺菌します。
  2. 加熱パッド、外科手袋、ガーゼ、はさみのペア、小さなクランプ、容器拡張器、外科鉗子、および針ホルダーを殺菌および/またはオートクレーブ。
  3. 術後鎮痛剤(ブプレノルフィンの0.1mg/kg)を脾臓摘出後に投与し、12時間毎に2日間投与する。

2. 細胞培養

  1. マイコプラズマELISAキットを使用して、がん細胞にマイコプラズマ汚染がないことを確認してください。
  2. マウス大腸癌細胞(MC38)の培養用に4°Cでダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)培養培地の500mL溶液を調剤する。培養培養培養剤は、10%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、ペニシリン100U/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、HEPESの15mMおよびL-グルタミンの200mMで補充されるべきである。
  3. DNAseおよびRNAseフリーフラスコ(75 cm 2)で癌細胞を培養する。5%CO2を含む細胞/組織加湿インキュベーターで細胞培養をインキュベートする。温度を37°Cに保つ。
  4. 増殖細胞が90~100%の合流率に達したら、古い培地を吸引し、1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で細胞を洗浄し、1xトリプシン(0.25%)で処理するフラスコからセルを切り離します。
  5. 15 mLの円錐形の管および遠心分離機の700 x gで5分間細胞を集める。
  6. メディアを吸引し、遠心分離を繰り返して1x PBSで2回洗浄します。
  7. トリパンブルー染色(0.4%)で細胞を染色して細胞生存率を確認します。
  8. 1x PBSで1 x 106細胞/100 μLの濃度に細胞を再中断します。任意の束を避けるために徹底的にピペ状細胞。注射の前に氷の上に癌細胞を保つ.

3. 腫瘍細胞の注入

  1. 1mL 25G(0.5 mm x 16 mm)の針を用いてケタミン(150mg/kg)とキシラジン(12mg/kg)を経口内投与することにより、8~12週齢の雄(C57BL6)マウスを麻酔する。
  2. 術後の感染を避けるためにバリカンを使用してマウスの腹部の皮膚を剃る。
  3. 磁気固定体引き込みシステムにマウスを置きます。マウスがつま先または尾をつまむことで麻酔の効果を完全に受けていることを確認します。
  4. 手順中の乾燥を避けるために、目に生理食塩水滴を追加します。
  5. スクラブポビドネヨウ素溶液 (7.5%)外科的切開を行う前に皮膚を消毒するために剃った腹壁に。
  6. 最初に歯の鉗子で皮膚を持ち上げ、外科はさみの助けを借りて中線切開を行う。その後、腹筋と腹膜を持ち上げて、約3cmの中線切開(中腹部からキシフスプロセスに腹部を露出させる。広範囲の出血を避けるために、xiphoid プロセスを超えて切開を拡張しないように注意してください。
  7. 切開の両側とxiphoidプロセスの下にヘモスタットを置きます。尻尾を下に引っ張ってテーピングして腹部を伸ばします。6インチの無菌綿先端アプリケーターを使用して、脾臓を膵臓脂肪組織から分離し、露出させます。
  8. 脾臓に注射する前に、細胞の塊を避けるために癌細胞を渦。
  9. 注射には0.5 mL 28G(0.36 mm x 13 mm)のインスリン注射器を使用してください。気泡を避けてください。
  10. 脾臓の先端に100 μLの細胞をゆっくりと慎重に注入します。綿の先端を置き、腹部に逆流を避けるために穏やかな圧力を加えます。注射の成功は、注射中に肝臓の色の変化を識別することによって観察することができます。.
  11. 1x PBSで滅菌ガーゼを湿らせ、解剖した領域の上に置きます。
  12. マウスを15分間加熱パッドに移し、がん細胞がシステム内を循環できるようにします。
  13. 外科的虚血および再灌流損傷を続行するには、手順 5.3-5.10 に従ってください。
    注:この手順は、転移性病巣のI/R誘発確立の効果を研究する。

4. 脾臓摘出術

  1. 脾臓摘出術を行うには、手持ち型の焼灼装置を使用します。慎重に滑らかな鉗子で脾臓を持ち上げ、過度の出血を避けるために脾臓の血管を焼く。焼き付き部で血管を透過して脾臓を取り除きます。
  2. 処置の直後に、最初に筋肉層と皮膚を縫合することによって二重層パターンで切開を閉じる。腹壁と皮膚の両方に4-0ポリプロピレン縫合糸を使用してください。
  3. 別の動物に手順を繰り返す前に、70%のイソプロパノールでそれらをスプレーするか、ビーズ浴にそれらを挿入することによって、すべての器具を消毒します。
  4. マウスを元のケージに戻し、苦痛や手術後の痛みの兆候を探します。
  5. 術後の痛みを避けるために、術後鎮痛剤(ブプレノルフィン0.1mg/kg)を2日間毎に12時間注射する。

5. 虚血再灌流損傷

  1. 最初の開腹術の5日後に、1mL 25G(0.5mm x 16mm)の針を用いてケタミン(150mg/kg)とキシラジン(12mg/kg)を腹腔内投与してマウスを麻酔する。手順 3.3~ 3.4 に従います。
  2. スクラブポビドネヨウ素溶液 (7.5%)マウスの剃った腹部に皮膚を消毒し、ステップ3.6で上述したように中線開腹術を行う。
  3. 2つの湿った綿の先端を使用して、穏やかに入虫から腸を動かして、ポータル静脈を含む関連する構造を露出させる。周囲の組織から肝臓のヒラムを解剖する。
  4. 中央値を持ち上げ、横隔膜に対して左横葉を持ち上げます。四肢葉を左横葉から分離し、手術顕微鏡を使用して肝ヒラムをスプリングハサミで解剖し、ポータルトライアド構造に向かって明確な可視性を確保します。
  5. 中央ローブと右横ローブの間に小さな湿った綿棒を置き、クランプのための十分なスペースを作成します。容器のディレーター鉗子を使用して、慎重にポータルトライアドを持ち上げるために10 cm糸(4.0ポリプロピレン縫合糸)を渡します。ロック付きマイクロセレファインクランプアプリケータを使用して小血管クランプを配置することにより、左および中央の肝葉にポータルトライアド(肝動脈、ポータル静脈、胆管)内のすべての構造を閉塞します。
  6. ローブに有意なブランチが表示されない場合は、クランプを取り外して再適用します。
    注:クランプを再調整しても肝臓の即時ブランチが起こらない場合は、I/Rを続行するかどうかを慎重に検討してください。
  7. 中央分離帯と右横葉の間に置かれた小さな綿棒を取り除きます。腸を腹腔にそっと置き換える。湿ったガーゼ(1x PBSで浸した)で腹壁を覆い、蒸発損失を最小限に抑えるためにプラスチックラップで覆います。
  8. マウスを加熱パッドの上に置き、60分間クランプを適用します。
  9. 虚血間隔を通して、右中間および左中間および横葉の淡いブランチを視覚化することによって虚血損傷の証拠を求める。
  10. 60分後にクランプを取り外して再灌流を開始します。
    注:再灌流の証拠は、中央値と左横葉の即時の色変化によって観察することができる。
  11. 再灌流の直後に、最初に筋肉層と皮膚を縫合することによって二重層縫合パターンで切開を閉じる。腹壁と皮膚を閉じるために針ホルダーの助けを借りて4-0ポリプロピレン縫合糸を使用してください。
  12. 別の動物に手順を繰り返す前に、70%のイソプロパノールでそれらをスプレーするか、加熱されたビーズ浴にそれらを挿入することによって、すべての機器を消毒します。
  13. マウスを元のケージに戻し、苦痛や手術後の痛みの兆候を探します。
  14. 術後の痛みを避けるために、術後鎮痛剤(ブプレノルフィンの0.1mg/kg)を12時間ごとに2日間注射する。
  15. 肝臓I/Rシャムマウスの場合は、開腹術、ヒラム解剖および腹部縫合を行う。
    注:肝転移の確立に影響を与える外科的ストレスの役割は、2つの異なる実験計画を通じて調べることができる。上記のプロトコル(モデル-1)は、微小転移性肝疾患を確立し、肝I/Rが成長に及ぼす影響を研究するために使用される(図1A)。あるいは、肝臓I/Rおよび腫瘍注射を同時に行うことができ(モデル-2)、新しい転移性病巣の確立におけるI/R損傷の効果を調べることができる(図1B)。これを行うには、上記のように脾臓に癌細胞を注入し、15分間循環できるようにする 60 分の循環期間後に肝臓I/Rまたは偽の手術を行う 60 分後に横脾臓摘出を行い、その後開腹切開を閉じる.

6. マウスの評価

  1. 外科的処置の間にマウスが触診および角膜反射テストを行うことによって段階III麻酔の影響を受けることを保障する。反射神経の徴候に追加の麻酔用量を与えられなければならない。
  2. 手術後の痛みを避けるために、手術直後に手術後鎮痛薬(ブプレノルフィン0.1mg/kg)を2日間、12時間ごとに提供します。
  3. マウスに麻酔からの回復時間を30~60分許可する。常にマウスを監視し、完全な回復まで放置しないでください。
  4. 背中を突き出し、目を閉じたり、動きが遅くなったり、新郎新婦に失敗するなどの苦痛の兆候を探してください。マウスが正常な活動に戻るまでそれに応じて治療する。
  5. 体液、熱、キシラジンのためのヨヒンビン反転剤、柔らかいペーパータオル寝具(吸引を避けるために)を含むサプリメンタルケアは、回復期間を改善するために手術後に提供されるべきです。

7. 肝虚血再灌流損傷の評価

  1. クランプを適用した直後に、中央分離帯と左横葉の淡いブランチが、カウデートおよび四角形の葉と比較して発生することを確認します。
  2. 血清アラニントランスアミナーゼ(sALT)、セラムアスパラギントランスアミナーゼ(sAST)および血清乳酸デヒドロゲナーゼ(sLDH)レベルを測定することにより、肝虚血傷害を評価する。血液は、再灌流の開始後に血清3-6hを抽出するために顔面静脈から引き出すことができます。肝虚葉内の腫瘍領域の割合を分析するために肝神経学を実行します。

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結果

全てのワイルドタイプ(C57BL6)マウス(n=20)を、上述のプロトコルを用いて肝転移モデルに供した。虚血再灌流損傷の有無にかかわらず注射されたすべてのマウスは、犠牲の日まで生き残った。癌注入肝臓の概略図図1Aは、部分的な肝虚血(70%)を誘発するポータルトライアド(肝動脈、門脈、胆管)のクランプを示す中央値に向かって侮辱し、左横葉。肝転移の数の増加は虚血再灌流損傷後2〜3週間以内に観察することができる。MC38癌細胞を注射したマウスをランダムにシャム群とI/R群に分けた。図1Bに示すように、マウスの最初の群は癌注射後15分で脾臓摘出術を受けた。肝虚血再灌流手術は注射の5日後に行った。このモデルは循環癌細胞(CC)が器官内に確立することを可能にする。図2Aは、外科的ストレスが肝臓内の確立された微小転移の量を有意に増加させたことを示す。第2群(図1C)は、癌注射後15分の外科I/Rを受けた。再灌流は、...

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ディスカッション

この原稿に記載されている動物モデルは、2つの主要なアプローチに基づいています。第一は、がん細胞が肝葉に局所化し増殖する能力を認識することです。第二は、腫瘍の増殖および転移に影響を及ぼす肝虚血再灌流損傷の影響を研究することである。このモデルは、免疫能力の高いマウスに二次転移がない場合の肝転移の関連研究を可能にする。このモデルは、細胞生存の贅沢や増殖などの転移効率の問題に対処するのに役立ちます。

第1のモデルでは、癌細胞が最初に注入され、微小転移性疾患が形成され、形成され続ける。その後、肝臓I/Rは5日後に行われる。このモデルは、既に確立された微小転移性疾患に対する手術の効果を研究する際に重要である。イメージングは過去10年間で著しく改善されましたが、イメージングでは検出できない微小転移性疾患が存在し、治療を目的とする計画的な肝切除後に取り残される可能性があります。この残留顕微鏡疾患は、手術に伴う炎症性変化、特に肝臓I/Rの影響を受け、成長は指数関数的に増加する。一方、第2モデルでは肝臓I/Rと腫瘍注射が同時に行われる。このモデルは、循環癌細胞に対する肝臓I/Rの影響と新しい転移性病巣...

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開示事項

著者らは、この作品に関連する利益相反を明らかにしていない。

謝辞

著者は、言語的改訂のためにサラ・ミネマイヤーとアレクサンダー・コマルチに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコの修正されたワシミディアムロンザ12-614F
胎児ウシ血清ロンザ900-108
L-グルタミンギブコ25030-081
ペニシリンフィッシャー科学15-140-122
レトマイシンフィッシャー科学15-140-122HEPES
フィッシャー科学
トリプシンHyclonesh30042.02
細胞培養フラスコ 75cm5 細胞スター658170
15ml PP 円錐管BioExcell41021037
トリパン ブルーステインGiibco15250-061
ガーゼフィッシャーブランド1376152
CautryBovieAA01
微小血管クランプファインサイエンスツール18055-03
ロック付きマイクロセルファインクランプアプリケーターファインサイエンスtoosl FST-18056-14
スプリングシザーファインサイエンスtoosl FST-15021-15
血管拡張器ファインサイエンスtoosl FST-00276-13
磁気固定具 リトラクションシステムファイン科学tooslFST-18200020
マイクロ広告鉗子ファインサイエンスtooslFST-11019-12
マイクロ広告鉗子ファインサイエンスtooslFST-11018-12
4-0ポリプロピレン縫合糸エチコンK881H
ニードルホルダーハーバード装置72-8826
加熱パッドフィッシャー科学
クリッパーオスター559A
ポビドン ヨウ素溶液メドラインMDS093945
シリンジ 1ml 25GBD 安全 グライド305903
インスリン シリンジ 0.5 mlBD インスリン シリンジ32946
コットン チップ アプリケーターフィッシャー サイエンティフィック23-400-101
サージカル顕微鏡ライカLR92240
マイコプラズマ エリサキットロシュ11663925910
ケタミンパトニー#056344
キシラジンNADA#139-236
ALT ストリップヘスカ15809554
AST ストリップヘスカ15809542
LDH ストリップヘスカ15809607
ストSH30237011443915

参考文献

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