ここでは、哺乳類のブラセマ形成と内皮形成を調べ、蛍光免疫組織化学と順次生体内マイクロコンピュータ断層撮影により分析した成体マウス末端ファランクス切断のプロトコルを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
ここでは、成体マウス遠位末端ファランクス(P3)切断のプロトコルを提示し、皮炎形成とイントラメブラヌス系化を含むエピモーフィック再生の手続き的に単純で再現可能な哺乳類モデルを提示する。蛍光免疫組織化学および順次生体内マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)。哺乳類の再生は、末端ファランクス(P3)の遠位領域を伝える切断に限定される。より近位レベルで切断された数字は、再生に失敗し、線維性治癒および瘢痕形成を受ける。再生応答は、増殖性芽細胞の形成によって媒介され、続いて骨の骨再生を経て、切断された骨格の長さを回復させる。P3切断は、哺乳類のエピモーフィック再生を調査する前臨床モデルであり、線維性治癒を正常な再生応答に置き換える治療戦略の設計のための強力なツールである。我々のプロトコルは、蛍光免疫組織化学を使用して1)早期および後期のブラセマ細胞集団を同定し、2)再生の文脈における再血管化の研究、および3)複雑な骨を必要とせずに内膜骨化を調査する安定化デバイス。また、生体内μCTでシーケンシャルを用いて、切断後の形態変化を調べる高解像度画像を作成し、再生過程で同じ数字の体積と長さの変化を定量化することも実証しています。このプロトコルは、哺乳類におけるエピモーフィック応答と組織再生応答の両方を調査する上で大きな有用性を提供していると考えています。
概要
ヒトおよびマウスを含む哺乳動物は、末端ファランクス(P3)1、2、3の遠位切断後に自分の桁の先端を再生する能力を有する。マウスでは、再生応答は切断レベルに依存します。ますます近位桁切断は、P3爪マトリックス4、5、6に近接および近接切断で完全な再生障害が完全になるまで、徐々に減衰した再生応答を示す,7,8.P3再生は、ブラステマの形成によって媒介され、切断された構造9を再生するために形態形成を受ける増殖細胞の集団として定義される。切断によって失われた構造を再生するブラステマの形成は、エピモーフィック再生と呼ぶプロセスで、傷害後の従来の組織修復から多組織レベルのP3再生応答を区別する6、 10.P3再生は、創傷治癒11、12、骨の有面性を含む複雑な再生プロセスを<....
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プロトコル
すべての動物の使用と技術は、テキサスA&M大学の機関動物ケアおよび使用委員会の標準的な操作手順に準拠していました.
1. アダルトマウス後肢遠位P3切断
- 酸素中のイソルランガスを用いて8~12週齢のCD-1マウス(材料表)を麻酔する。最初はチャンバー内で3%で麻酔を行い、続いて手術期間中にノセコーンによって供給される2%のイソファルランが続く。麻酔下での乾燥を防ぐために、眼科の目に眼のチントを適用します。
注:私たちの研究室で標準化された成人P3切断研究は、8〜12週齢のマウスで行われ、再生応答はすべての試験された株で保存される。 - 10倍の解剖顕微鏡の下で、外科ポビドネヨウ素および70%のエタノールと後肢の数字を殺菌する。マイクロハサミを使用して外科部位から髪をトリミングします。局所的なブピヴァカインの1 μLを局所的に適用し、手術部位を麻酔する。
- 滅菌#10メスを用いて、各後肢の2桁目と4桁上の末端ファランクス(P3)の遠位先端を切断する(図1A)。切断は、手術器具の殺菌を含む無菌条件下で行われなければならない。解剖顕微鏡の下で、後ろ足をそっと軽くこたえて中間桁面を露出させる。脂肪パッドに平行な角度でメスを保持し、図 1Bに....
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結果
6/7 DPA(図2A-D)、9DPA(図2E-H)、および10 DPA(図2I-L)でP3桁を再生する成体マウスは、Runx2、OSX、およびPCNAに対する抗体を用いて免疫染色し、骨内骨を可視化した。再生し、CXCR4およびvWFに対する抗体で免疫染色し、ブラステマ形成を可視化する。切断前および再生過程における様々な時点でスキャンされた数字の代表的なμCTレンダリング(図3A、B)および長さの測定値を識別するために使用されるランドマークの識別(図3B)は、以下の通りです。も示されます。
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ディスカッション
このプロトコルは、成体マウス遠位P3切断の標準化された手順、蛍光免疫組織化学染色を視覚化し、ブラステマ形成および内膜神経化を調査し、シーケンシャルインビボμCTスキャンを記述する。切断後の骨形態、体積、および長さの変化を識別する。P3切断は、ブラセマ形成を引き起こす再生創傷環境を分析するユニークで手続き的にシンプルで再現可能なモデルです。さらに、P3の数字モデルは、従来の骨損傷モデルに対して多くの利点を提供し、内皮内骨化を調べます。
このプロトコルを確実に成功させるには、完全なディジットデカール化を実行する必要があります。数字が完全にデカールされていない場合、それは断面処理中に崩れ、細断されます。さらに、熱検索免疫組織化学は、組織がわずかに剥離したり、スライドから完全に脱落したりする可能性があるという点で問題になる可能性があります。この問題を緩和するために、サンプルは組織学的接着剤を補充した水浴を使用して接着剤スライドに取り付けるだけでなく、使用前に65 °Cに乾燥したスライドを焼く必要があります。最後に、マウスの数字は比較的小さいです。したがって、形態を正確に視覚化し、骨の体積と.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
宗岡研究室とテキサスゲノム医学研究所(TIGM)のメンバーに感謝します。この研究はテキサスA&M大学の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| プロテインブロック 無血清 | DAKO | X0909 | すぐに使用できる |
| マウス抗PCNA抗体 | Abcam | ab29 | 1:2000 希釈 |
| ラット 抗CXCR4抗体 | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 希釈 |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 希釈 |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 希釈 |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 希釈 |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 希釈 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 希釈 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 希釈 |
| Prolong Gold 退色防止試薬 | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | すぐに使用できる |
| Z-Fix、水性緩衝亜鉛ホルマリン固定剤 | Anatech LTD | 174 | すぐに使用できる |
| CD-1 メスマウス | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
参考文献
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. <....
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再版と許可
