フローサイトメトリーによるBKポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定

Summary

この原稿では、tdTomatoおよびeGFPを発現する双方向レポータープラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞を用いてBK-ポリオマウイルス転写活性のFACSベースの測定を行うプロトコルが提示される。この方法はさらに、ウイルス転写に対する新規化合物の影響を定量的に決定することを可能にする。

Abstract

BK-ポリオマウイルス(BKPyV)のようなポリオマウイルスは、免疫不全患者に重篤な病理を引き起こす可能性がある。しかし、現在、非常に効果的な抗ウイルス剤は入手できないため、潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が求められている。ここでは、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする二重蛍光レポーターを構築し、tdTomatoおよびeGFPを介してウイルス遺伝子発現に対する潜在的な抗ウイルス薬の影響を定量化した。式。また、このプロトコルで例示的に得られたBKPyV-NCCRアンプリコンをクローニングすることにより、免疫不全の腎移植患者の血液由来DNAから得られ、NCCR再配列がウイルス遺伝子発現に及ぼす影響を判定することができる。患者由来アンプリコンのクローニング後、HEK293T細胞をレポータープラスミドでトランスフェクトし、潜在的な抗ウイルス剤で治療した。続いて、細胞を平均蛍光強度72hポストトランスフェクションを測定するためのFACS分析を行った。また、潜在的な細胞周期阻害効果を有する薬物の分析をテストするために、トランスフェクトのみ、したがって蛍光細胞が使用される。このアッセイは大きなT抗原発現細胞で行われるので、早期発現と後期発現の影響を相互に独立した方法で分析することができる。

Introduction

ポリオマウイルスは、シミアンウイルス40(SV40)をプロトタイプ種として有する小さな二本鎖DNA(dsDNA)ウイルスの独立したファミリーを表す。一次感染は主に小児期に起こり、通常は疾患症状なしで進行し、通常は免疫有能な宿主で潜伏感染を引き起こす。BK-ポリオマウイルス(BKPyV)は、主に腎管細胞に腎症を引き起こすことなく持続するが、腎移植後の免疫能力の障害の場合、ウイルスは再活性化し、重度の損傷および移植片の障害を引き起こす可能性がある。高ウイルス血症(1 x 10⁴ BKPyV DNAコピー/mL)1、2に達すると機能します。腎臓移植レシピエントのおよそ10%において、BK-ポリオマウイルス(BKPyV)の再活性化は、腎同種移植片障害のリスクが高い80%に関連したポリオマウイルス関連腎症(PyVAN)をもたらす3,4.承認された抗ウイルス剤が利用できないため、現在の治療は免疫抑制の減少に基づいている。興味深いことに、 mTOR 阻害剤は、抗ウイルス効果を持っているようです。;したがって、免疫抑制療法をmTORベースの免疫抑制に切り替えると、BKPyVウイルス血症5、6、7の進行を防ぐための代替アプローチを表しうる。しかし、mTORベースの抗ウイルス機構は現在まだ完全に理解されていない。したがって、臨床的に関連する濃度における潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が必要とされる。

BKPyVの円形ゲノムは、複製の起源として機能する非コード制御領域(NCCR)を約5kbに収容し、それに付き合って早期および後期mRNA転写物の発現を駆動する双方向プロモーターで構成される。自発的に発生するNCCR再配列、欠損、および複製は病原性BKPyV⁸に見出され、PVAN 5、9に苦しむ患者において有意に蓄積されるので、原型(wt)および再配置された(rr)NCCR活動は、ウイルス複製性の適合性を特徴付けるために有用である。

図1に要約すると、このプロトコルは、レポータープラスミド5^{から発現した2つの蛍光体tdTomatoおよびeGFPの蛍光を定量することにより、BKPyV NCCR転写活性を測定するために一般的に使用される方法を説明する。9,10,11}.この手順は、SV40大型T抗原(lTAg)の存在下で行われ、これは、NCCR活性の早期および後期に対する潜在的な抗ウイルス剤の影響を別々に5に分析することを可能にする。このアッセイは、NCCR活性に対する再配置の影響とwt-NCCR5,9との比較をさらに分析する。レポータープラスミドは、各蛍敵オープンリーディングフレームの下流にあるSV40後期ポリアデニル化信号を、tdTomatoおよびeGFPの両方のトランスクリプトの同等かつ効率的な処理を保証します。qRT-PCRベースの方法5、12と比較して、このFACSベースのアプローチは、感染した細胞培養のための複雑な抽出プロトコルがなく、高価ではないため、低コストで高スループット対応の代替手段を表します。免疫蛍光染色のための抗体が必要です。さらに、フローサイトメトリーを介して定義された量の蛍光細胞を分析するので、細胞周期阻害剤の分析も定量的に可能である。

Protocol

このプロトコルは、デュースブルクエッセン大学(14-6028-BO)の医学部の倫理委員会によって承認された人間の研究のガイドラインに従います。

1. 血液または尿サンプルの採取とポリオマウイルスDNAの単離

1. EDTAチューブまたは取得チューブ内の尿中の血液の少なくとも3 mLを収集します。
2. 2,500 x gで15分間サンプルを遠心分離します。必要に応じて、ピペットプラズマを新しいチューブに入れ、プラズマサンプルを数日間4°Cで保存するか、-20°Cで凍結して長期保存します。
3. 40 μLのプロテインサーゼKを1.5mLマイクロ遠心分離管に準備し、ピペッティングにより400μLのプラズマを追加します。
4. 400 μLのリシスバッファーを加え、15sの渦を加えてサンプルをlyseし、56°Cで10分間インキュベートする。
5. 製造元の指示に従ってDNA採取キットを用いてDNAを分離する。簡単に言えば、アルコールを追加し、DNA結合シリカベースの膜を含むスピンカラムにライサテスをロードします。純粋なDNAを得るために列を数回洗います。
6. TE バッファーの 30-50 μL で得られた DNA を溶出します。

2. 非コーディング制御領域(NCCR)の増幅

1. 物理的に離れた部屋で次の手順を実行します。試薬を準備し、PCRチューブにミックスを分配するために隔離された部屋を使用してください。
2. プライマーペアA(表1)を合計体積50μLで使用してPCR前のマスターミックスを準備し、ステップ1.6から以前に単離したDNAを使用します。プレ PCR と入れ子になった PCR のマスター ミックスを準備するためのピペッティング スキームは、表 2に出力されます。
3. マスターミックスの45 μLをPCRチューブに分配します。
4. 単離されたDNAをPCRチューブに5μLを加えます。
   注:汚染を避けるために、マスターミックスの準備のために1つ以外の部屋を使用してください。
5. 表 3に示すように、反応条件を使用して PCR を実行します。35サイクルで脱退、アニーリング、延長を繰り返します。
6. 入れ子になった増幅の場合は、AgeI および SpeI の制限部位を収容するプライマー ペア B を使用します (表1)。
7. 手順 2.2 ~ 2.5 で説明したように、入れ子になった PCR を、PCR 前の 5 μL を使用して実行します。
8. PCR製品の10 μLを6倍ゲルローディング色素の2μLと混合します。1.5%のアガロースゲルにミックスの10 μLをロードし、60 mAで30分間ゲルを実行します。
9. 適切なUVドキュメンテーションシステムを使用してゲルを視覚化します。
   注:アンプリコンのサイズは、再配置(削除、挿入、または重複)が発生したかどうかに応じて300~500 bpの間であると予想されます(図2C)。
10. 製造元の指示に従って、PCR精製キットを使用してPCRアンプリコンを浄化します。溶出バッファーの30 μLでPCRアンプリコンを溶出します。
11. プライマーペアBを使用してサンガーシーケンシング用のアンプリコンを送信します。

3. 二重蛍光レポーターへのNCCRのクローニング

1. 表4に記載されているように、精製されたアンプリコン(ステップ2.10)をAgeIおよびSpeIで2時間37°Cで消化する。
2. ステップ2.10を繰り返し、消化されたアンプリコンを精製します。
3. 並行して、表5に記載されているように、プラスミドバックボーン(1.5 μg)をAgeIおよびSpeIで2時間37°Cで2時間消化する。この手順は 1 回だけ実行する必要があります。その後の反応については、-20°Cで消化を凍結します。
4. 0.8%低溶融アガロースゲルで消化されたプラスミドバックボーンを分析します。
   注:40 mAより高い電流でゲルを実行しないでください。もともとプラスミドpEX-K4 2-LTR CD3¹³に由来するスペーサー領域の期待挿入は128 bp(図2C)である。
5. 長波紫外線(320nm)を用いてDNA断片を可視化し、きれいなメスを使ってバックボーンバンドを切り取ります。低溶融ゲル断片を新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。DNA損傷を防ぐために、長時間の紫外線曝露時間を避けてください。
   注:低溶融アガロースを使用しているので、ライゲーションの前にDNAを精製する必要はありません。
6. 低溶融アガロース片を含むバックボーンを65°Cで10分間加熱し、ゲル片を溶かし、穏やかな渦で2分ごとに混ぜます。溶融ゲルは、ライゲーションに直接使用することができます。
7. 表6に示すスキームを用いて、T4 DNAリゲスを16°Cで一晩使用してバックボーンと消化アンプリコンをリゲートする。
8. ヒートショック法、LBアンプレート上のプレート細菌、および一晩37°Cの培養を用いて大腸菌の形質転換を行う。
9. 翌日、3つの陽性クローンを選択し、一晩大腸菌培養(LB-Ampの5mL)と37°Cの培養物を調製する。
10. 他の場所^で説明されているように標準プロトコルを使用してプラスミドDNAを分離し、AgeIとSpeI消化を行って陽性クローンをチェックし、1%アガロースゲル上の断片を視覚化します。スペーサーバンド(128 bp)は、より大きなNCCRシーケンス(300~500 bp、上記参照)に置き換えられます。
11. プライマーEGFP-NまたはプライマーペアB(表1)を使用してサンガーシーケンシング用のプラスミドを送信します。
12. 突然変異が自然に起こる可能性があるため、シーケンス結果とアンプリコンで得られたシーケンス結果を比較します。アンプリコンと比較して同じシーケンスを含むクローンのみを使用してください。
13. 分子ワークベンチソフトウェア(フリーウェアGENtle 1.9.4またはその他のシーケンス編集プログラム)を使用して、得られたシーケンスを整列および編集します(図3)。
14. GENtle 1.9.4 を起動し、[インポート] ボタン(緑色の下向き矢印) をクリックして DNA 配列をインポートします。
15. 次にツールをクリックし、メニューから[整列]を選択します (ショートカットとして Ctrl キーを押しながら GG を使用)、位置合わせ用の DNA シーケンスを選択します。
16. [削除] をクリックして[配列を追加]または[シーケンスを削除]をクリックして、配置にシーケンスを追加します。JN192438¹⁵のような原型NCCRコンセンサスシーケンスを含め、一般的に使用されるダンロップ株16からのNCCR配列を使用しないでください。株。
    注: NCCR には、翻訳開始コドンが既に含まれています (図3)。
17. ツールバーの[アルゴリズム]をクリックして位置合わせの方法を選択し、alustal W. アライメントパラメータを2に一致させる位置合わせパラメータを設定し、ギャップ延長ペナルティ-1;ギャップペナルティ-2をクリックして位置合わせを実行します。

4. レポータープラスミドによるHEK293T細胞の一過性トランスフェクションと潜在的な抗ウイルス剤による治療

1. その後のトランスフェクション実験のために十分な量のプラスミドDNAを調製するために、150mLの一晩培養を調製する。プラスミド分離キットを用いてプラスミドDNAを単離する。あるいは、他のプラスミド精製キットを用いてもよい。
2. シード1 x 10⁵ HEK293T細胞を含むDMEM中の10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシン(1x)を12ウェルプレートのウェル当たり24時間前にトランスフェクションし、37°Cおよび5%CO₂で一晩インキュベートし、トランスフェクション中に活性増殖を維持する。
   注:細胞はトランスフェクション時に約80%のコンフルエントでなければなりません。
3. 減らされた血清培地の250 μLを無菌チューブに入れ、各レポータープラスミドDNAの1 μgを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
4. DNA混合物にトランスフェクション試薬の3μLを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、15分間インキュベートします。
5. 混合物を井戸に滴下し、そっと井戸に分配します。
6. 4時間後、上清を試験剤と溶媒制御を含む新鮮な培地に置き換えます。分析するまで37°Cでインキュベートします。この例では、mTOR阻害剤INK128(100 ng/mL)およびラパマイシン(100ng/mL)を用いた。

5. 蛍光顕微鏡とフローサイトメトリー

1. 蛍光顕微鏡下で赤色と緑色の蛍光を細胞で確認してください(図4)。
   注:赤色および緑色蛍光は、それぞれ初期および後期のBKPyV遺伝子発現に対応する。
2. 72時間後トランスフェクション後、上清を吸引し、1mLの冷たいPBSで細胞を2回洗浄する。
3. 500 μLのトリプシンをゆっくりと加え、細胞の早期剥離を避けるためにプレートを少し回します。この手順は、セルの二重化を避けるために重要です。
4. 追加した後、同じピペットチップで直接トリプシンを削除します。
5. 細胞を37°Cで少なくとも5分間インキュベートします。
6. 3%FCSを含むPBSの1 mLでトリプシン化された細胞を再懸濁し、事前に標識されたFACSチューブに懸濁液を移します。
7. FACS 解析の前に DAPI (1 μg/mL) を追加します。
8. フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。各サンプルについて、DAPI染色に対して陰性である少なくとも10,000個の生細胞を測定します。

6. データ分析

1. フローサイトメトリー解析ソフトウェアにデータをインポートし、クリックしてワークスペースにドラッグしてサンプルを追加します。
2. 読み込んだファイルをダブルクリックして、グラフプロットを作成します。X 軸と Y 軸をクリックして、FSC-A と SSC-A を選択します。ツールバーのポリゴンをクリックし、セルの母集団をフレーミングして、メインセルの人口をゲートします(図5)。必要に応じて、選択したセルの母集団に名前を付けます (たとえば、"単一セル")。"単一のセル" が新しいワークスペースとして表示されます。
3. DAPI陰性(すなわち「生細胞」)の「単一細胞」をゲーティングに進めます。生細胞を同定するために、DAPI染色の有無にかかわらず細胞集団を比較する。どちらのプロットでも FSC-A と太平洋青-A を選択します。
4. 長方形をクリックしてDAPI陰性細胞集団を選択し、選択した細胞集団に「生細胞」という名前を付け、前述のようにFITC(eGFP)とPE(tdTomato)を示す新しいドットプロットを作成します。
5. ツールバーから[クワッド]を選択して、「生きているセル」に象限を追加します。各個体の端に象限の中心をドラッグして、母集団をゲートします。象限は、1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+を表します。
   注:FITCとPEの間の放出スペクトルのスペクトルオーバーレイのために、最初の補償は赤と緑の信号を区別し、正確な結果を達成するために不可欠です。
6. 象限を右クリックし、[統計の追加] を選択して、平均蛍光強度 (MIS) を決定します。[平均]を選択し、[OK] をクリックします。 平均 MFI は、「統計」セクションの母集団の下に表示されるようになりました。象限 2 と 4 は初期式に対応し、象限 3 と 4 は後期式を表します。
7. 統計力のために同じ方法で追加の反復を追加します。
8. データ解釈の場合は、バープロットの早期および後期のMFI値をプロットします。
9. 異なるドナーまたはウイルス株から得られたNCCR活性を比較するには、原型制御またはダンロップ^株16を追加し、その相対MFIを100%に設定し、相対MFI値を計算する。各反復を繰り返し、平均と標準偏差を決定します。
10. 転写活性に対する潜在的な化合物の効果を評価するには、溶媒対照を100%に設定し、処理された細胞のMFIをプロットする。

Results

この代表的な実験では、BK-ポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性をフローサイトメトリーを介して測定した。さらに、BKPyV再活性化後の患者の治療に使用される可能性のあるmTOR阻害剤を、ウイルス早期遺伝子発現の阻害について試験した。この目的のために、二重蛍光レポーターアッセイは、以前^に公表された5として使用された。実験セットアップの全体的なワークフロースキームは、F igure 1に示されています。まず、免疫不全の腎移植患者からの血液サンプルを、制度倫理委員会の承認を受けたヒト研究のガイドラインに従って採取した。血液はEDTA含有チューブで採取され、相は遠心分離によって分離された。続いて、400μLの血漿をポリオマウイルスDNAの単離に用いた。非符号化制御領域(NCCR)は、外側のプライマーペアBKV-CR-1fwおよびBKV-CR-1rvを用いて図2Aに示すように入れ子になったPCRプロト...

Discussion

本稿では、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする一般的に使用される方法が提示される。NCCR活性は同時に測定することができ、トランスフェクトされた細胞のリシスを必要としない。さらに、比較的多くの細胞を分析することができ、蛍光値の正規化のための追加マーカーの共トランスフェクションは必要ありません。

この方法の重要な部分は、クローン化されたNCCRがアンプリコンシーケンシングによって識別されるのとまったく同じ配列を含むべきであり、これは患者血漿中に存在する大多数の変異体に対応する。正確な結果を達成し、PCRが発生しやすいエラーを最小限に抑えるために、証拠読み取り活性を持つポリメラーゼを使用することを強くお勧めします。あるいは、配列は、市販の遺伝子合成サービスによって注文することができる。指定されたNCCRシーケンスは、直接クローンを作成するためのサイドエイジIおよびSpeI制限サイトを含む注文することができます。この場合、プラスミドをバックボーンプラスミドに平行に消化し、スペーサーインサートを合成コンストラクトから対応するNCCRフラグ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bpのはしご	NEB	N3231	1 kbまでの範囲の任意のはしごを代用可能
2丸太のはしご	NEB	N0550	10 kbまでの範囲の任意のはしごを代用可能
寒天、神戸	I カールロス	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
アンピシリン ナトリウムザルツ セルピュア	カールロス	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	、任意のメーカーBD
FACSCanto&tradeで代用することができます。II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	、Sigma	10236276001
DFC450Cカメラモジュール	ライカ		任意のカメラが使用可能
DMEM	Gibco	41966-029	どのメーカーでも代用可能
DMIL LED顕微鏡	ライカ		任意の蛍光顕微鏡DNA
血液ミニキット	Qiagen	51104	は、任意のメーカーで代用することができます
大腸菌DH5alpha コンピテントセル	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	任意のFBSを使用することができます
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		任意のフローサイトメトリーソフトウェア FBSは使用することができます
ゲルローディング染料、パープル(6X)	NEB	B7024	任意の6倍ローディング色素を細胞HEK293T置換可能
	ATCC	11268	これらの細胞は、サルウイルス40(SV40)の大きなT抗原を構成的に発現し、クローン17は、その高いトランスフェクタビリティのために特別に選択された。
HERAcell® 240i CO2インキュベーター	サーモサイエンティフィック		は、どのメーカーでも代用可能
HotStar PCRキット	Qiagen	203203
Intas ゲルドキュメンテーションシステム	Intas		アガロースゲルを含む染色DNAの任意の視覚化システムを使用可能
低メルトアガロー	バイオザイム	850081	、どのメーカー
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	は、
任意の製造業者pBKV(34-2)	ATCC	45025	であり、ポジティブコントロールとして使用した。DNA Seq.Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	生産終了品	任意のサーモサイクラーを使用可能
PCRヌクレオチドミックス、10 mM	Promega	#C1145
PCR1およびPCR2プライマー	メタビオン	は適用されません	脱塩。(10 µM) PCR グレードの水
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	は、任意のメーカーで代用できます
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	dsDNA 濃度を測定するための蛍光ベースの染色
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
トリプシン 0.05% - EDTA	Gibco	25300-054	は、任意のメーカーで代用可能
ZymoPURE II プラスミドキット	Zymo	D4201	は、任意のメーカーで代用することができます