マウスの視覚を評価するために迫り来る視覚刺激の使用

サマリー

マウスの視界を調べるために、迫りくるテストを実施しました。マウスは、天井にモニターと大きな正方形のアリーナに配置されました。迫り来る視覚刺激は、マウスで一貫して凍結または飛行反応を誘発する。

要約

中枢神経系の視覚系は多様な視覚信号を処理する。全体的な構造は、視覚皮質への側面 geniculate 核を通って網膜から特徴付けられているが、システムは複雑である。視覚処理を支えるメカニズムと、その拡張による疾患のメカニズムを解明するために、細胞・分子研究が行われています。これらの研究は、人工視覚システムの開発に貢献するかもしれない.これらの研究の結果を検証するには、行動ビジョンのテストが必要です。ここでは、迫り来る刺激実験が、比較的簡単なセットアップを必要とする信頼性の高いマウスビジョンテストであることを示します。迫り来る実験は、一角に避難所があり、天井にコンピューターモニターがある大きな囲いで行われました。コンピュータモニタの隣にある CCD カメラは、マウスの動作を観察するために役立った。マウスを筐体に10分間置いて、周囲に順応して探索することを許可した。その後、モニターは、プログラムからの迫り来る刺激を10回投影した。マウスは、凍結するか、隠れ場所に逃げることによって、刺激に反応しました。迫り来る刺激の前後のマウスの挙動を記録し、モーショントラッキングソフトウェアを使用してビデオを解析しました。マウスの動きの速度は、迫り来る刺激の後に大きく変化しました。対照的に、盲検マウスにおいて反応は認められなかった。私たちの結果は、単純な迫り来る実験がマウスビジョンの信頼できるテストであることを示しています。

概要

視覚系は網膜から始まり、光受容体によって視覚信号が捕捉され、双極性細胞 (2 番目の第3次ニューロン) となり、最終的には神経節細胞に渡される。網膜 2^ndおよび 3^rd次数ニューロンは、色、運動、または形状などの視覚信号の特定の側面を伝える複数の神経経路を形成すると考えられています。これらの多様な視覚機能は、側面 geniculate 核と視覚皮質に中継されます。対照的に、眼球運動につながる視覚信号は、優れた索に送られます。古典的には、2つの retino-皮質経路が同定されている: magnocellular と中経路。これらの経路は、それぞれ移動し、静止したオブジェクトを符号化し、それらの存在は、並列処理^{1、2、3、4、5}の基本的な概念を具体化し、 ⁶最近では、15種類以上のバイポーラ細胞^{7、8、9、10、11}および神経節細胞^{12、13、14 、15、16}は、霊長類網膜を含む多くの種の網膜に報告されている。これらの細胞は、形態学的な側面だけでなく、^{8、10、17、18}の明瞭なマーカーおよび遺伝子の発現によっても区別され、視覚信号は並列処理されており、当初予想されていたよりも複雑です。

細胞と分子の技術は、視覚処理や異常な視覚処理から生じる可能性のある潜在的な疾患メカニズムの理解に貢献しています。このような理解は、人工眼の発達に寄与し得る。細胞の検査と分析は細胞レベルで深い知識を提供しますが、行動実験と細胞実験の組み合わせによって、微細な視覚プロセスに関する現在の理解が大幅に強化されます。例えば、吉田 et al.¹⁹は、スターバーストアマクリン細胞がマウス網膜の動き検出のための重要なニューロンであることを発見した。細胞実験に続いて、optokinetic 眼振 (OKN) 行動実験を行い、スターバーストアマクリン細胞が機能不全になっていた変異マウスが移動対象物に反応しなかったことを示し、それによって細胞調査。また、ピアソン et al.²⁰は、マウス網膜における感光体移植を実施し、罹患マウスにおける視力を回復させる。彼らは細胞実験だけでなく、optomotor 応答記録と水迷路タスクの使用を通してマウスの行動を測定したが、ピアソン et al は、これにより、以前の盲検における視力の回復を移植したことを確認することを可能にしたマウス。ともに、行動実験はマウスの視覚を評価する強力なツールです。

マウスの視覚を測定するには、複数の方法があります。これらの方法には、利点と制限があります。インビボで ERG は、マウス網膜、特に光受容体および双極性細胞上の、適切に軽い刺激に応答するかについての情報を提供する。ERG は、暗所視または明所視条件^21、22のいずれかでテストすることができます。しかし、ERG は、麻酔を必要とし、出力測定²³に影響を与える可能性がある。Optokinetic 反射 (OKR) または optomotor 応答 (OMR) は、マウスビジョンの両方の機能成分であるコントラスト感度と空間分解能を評価する堅牢な方法です。しかしながら、OKR は、マウス頭蓋²⁴に固定装置を取り付けるための手術を必要とする。OMR は手術もマウストレーニングも必要としません。しかし、実験者が光学ドラム^25,26における移動格子に応じて微妙なマウスの頭の動きを主観的に検出できるようにする訓練が必要である。瞳孔光反射は、麻酔を必要とせず、客観的かつロバストな応答を示す光刺激に応答して瞳孔狭窄を測定する¹⁹.瞳孔反射は生体内での網膜光応答を模擬しているが、その反射は主として本質的な感光性網膜神経節細胞 (ipRGCs) ²⁷によって媒介される。IpRGCs は少数派の RGCs を表し、従来の画像形成神経節細胞としては機能しないので、この測定は、神経節細胞の大部分に関する情報を提供しない。

迫り来る光実験は、これまでマウスの視界を測定するための主要なテストとは考えられていませんでした。しかし、それはまた、マウス^28、29、ゼブラフィッシュ³⁰、イナゴ ^31、32、および人間^33、34のような様々な種にわたって堅牢で信頼性の高い視力検査であり、³⁵重要なことに、迫りくる実験は、画像形成経路を試験する少数の方法のうちの1つであり、中枢神経系の視覚および辺縁系システムがこの回路³⁶に関与していることを考えれば、反射経路ではない。 ^37、38。我々は迫り来る視覚刺激システムを確立し、マウスにおける動き検出を誘発する能力を実証し、マウス視覚システムの intactness を評価するためのプロキシとして使用しています。

プロトコル

すべての実験と動物のケアは、ウェイン州立大学 (議定書 no. 17-11-0399) の制度的な動物ケアと使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施しました。

1. 実験準備

1. 迫り来る視覚刺激のプレゼンテーションの間にマウスを収容するために長方形の開いたふたのエンクロージャを造る。アルミフレーミングと PVC パネルを使用した 40 cm x 50 cm x 33 cm エンクロージャを構成しました (図 1a、B)。エンクロージャーのフロア全体を覆うように用紙を1枚置いて、試験間の清掃を容易にします。入り口がアリーナの中央に面していて、入口と出口が簡単になるように、囲いの隅に不透明なシェルターを追加します。
2. マウスの動作をキャプチャするための広角レンズを備えたカメラを設定します。エンクロージャーに隣接するテーブルマウントスタンドにカメラを固定します。最高品質のビデオキャプチャを行うには、60 FPS 以上のカメラフレームレートを使用します。
3. エンクロージャーの上部にコンピューター・モニターをセットアップします。外部からモニタを見ることができなかったため、2台目のモニタを用意し、プライマリモニタに表示されたイメージを複製しました。
4. 投影のために迫り来るパターンを準備します。これを行う1つの方法は、MatLab ソフトウェア内の PsychToolbox3 を使用して、拡大する黒い円をコードすることです (図 1C)。刺激を2°の視覚角度で開始し、250 ms 上の50°に拡大するように設定してください。これらのパラメータは、刺激速度を決定します (目視角度計算のために図 1Dを参照)。1秒間隔で刺激を10回繰り返すようにコードを設定します。
   注: 刺激は前のプレゼンテーションの終了の直後に各反復を始めました。刺激表示の詳細については、セクション3を参照してください。
5. 迫り来る刺激のために関心のあるマウスを選択します。ここでは、C57 の背景の32の健常な眼マウスを使用し、男性と女性は、4〜14週齢である。また、迫り来る刺激に対する応答が本当に視覚的に導かれた行動であるかどうかを評価するために、3つの盲検マウス (両眼に重度の白内障) を使用する。これらの盲目のマウスは、瞳孔光反射と無 optomotor 反応を有しなかった。

2. マウス順応

1. 筐体にマウスを置き、自由に周囲を探索できるようにします。可能であれば、フリーハンドの背面を、サポートなしでハングさせるのではなく、マウスの休憩場所として使用して、動物の移動中のストレスを最小限に抑えてください。マウスはエンクロージャー全体が安全であることを確認し、隠れ場所を発見する必要があります。避難所の反対側の隅にいくつかの食品ペレットをドロップして、避難所の外にとどまるようにマウスを奨励します。
2. マウスが7から15分^29,39のどこにでも順応できるようにします。刺激の開始前には、馴化の10分を許可しました。さらに、実験前の1日に10分馴化して、マウスを楽にしてもよい。

3. 迫り来る視覚刺激投影

1. マウスをアリーナに挿入する前に、刺激コードを実行する準備ができていることを確認して、マウスが筐体内にあるときにできるだけ少ない照明の変更を行います。ソフトウェアを実行する準備が整ったら、マウスをそっとエンクロージャに置きます。
2. 刺激の10秒前に、ビデオキャプチャを開始します。
3. マウスは避難所から離れているとオープンアリーナで自由に移動するときに迫り来る視覚刺激を開始します。最後の刺激プレゼンテーションの10秒後に記録を終了します。
   1. マウスが避難所から最も遠い隅にあるときに刺激のプレゼンテーションを開始します。しかし、マウスが遠くの隅を探索したくないと思われる場合は、マウスがアリーナの別のコーナーにあるときに刺激を提示します。これは動物行動反応において違いを示さない。
4. マウスを元のケージに戻します。70% のエタノールで壁と避難所を噴霧し、次のマウスのための筐体をきれいにし、それを拭いてください。汚れている場合は紙床ライナーを交換し、動物の移動や囲いのクリーニング中に移動した場合は、同じ初期の場所に避難所を再配置します。

4. ビデオ分析

1. 解析ソフトウェアへの転送中にデータ損失が発生しないようにするために、ファイル圧縮を行わずに各マウスのビデオクリップを avi 形式で保存します。
   注: 圧縮がないとファイルサイズが大きくなります。そのため、ストレージには外付けハードドライブを使用してください。
2. 分析ソフトウェアを使用して、刺激のプレゼンテーションの前、最中、および後に、アリーナ周辺の動物の動きを追跡します。すべてのビデオフレームでマウスの頭の位置を追跡する手動追跡機能を備えた市販のソフトウェア (資料の表を参照) を使用して、1/60 ミリ秒ごとに X と Y のコーディネーションを生成した他のモーショントラッキングソフトウェアが含まれていますフィジー (NIH)⁴⁰および EthoVision (Noldus)。
3. 避難所からの速度とマウスの距離を計算します。ビデオアングルによってアリーナのイメージが歪む場合は、計算の前に X と Y のコーディネーションを修正します (図 2)。
4. 接近刺激の発症前後のパラメータを比較して、凍結、逃走、または行動の変化を示さないかどうか、マウスがどのように刺激に反応したかを判断します。速度が 0.5 s またはそれ以上 20 mm/s 未満のエピソードとしてフリーズを定義します。速度が 400 mm/s またはそれ以上に増加し、避難所でマウスで終了したエピソードとして飛行を定義します。凍結と飛行のための定義は Franceschi et al.²⁹によって設定されたものに基づいた

結果

健康な目をしたマウスを筐体に入れ、10分間順応させた。天井のモニターが付いているアリーナは mesopic 光条件 (7 x 10⁵光子/μ m²/s) の下で保たれました。順応期間中に、マウスは空間を探索し、避難所として不透明なドームを発見しました。マウスが避難所から離れて移動すると、ビデオキャプチャーが開始され、その後に視覚刺激の開始が続きます。迫り来る刺激に応答して、ほとんどのマウスはドーム (飛行応答) に走り、これは31匹のマウスのうち30個 (97%) で観察された。いくつかのマウスは、逃げ前に凍結反応を示した (19/31 マウス、61%)。迫り来る刺激により、光条件1ログ (6 x 10⁵光子/μ m²/s) が減少しました。

キャプチャしたビデオクリップは、手動トラッキング機能 (Image Pro Plus) またはフィジー (NIH) を備えた商用分析ソフトウェアのいずれかを使用して解析されました。トラッキング機能を使用して、マウスの位置は、迫り来る刺激の前、最中、および後...

ディスカッション

迫り来る視覚刺激システムでは、過半数 (97%)健康な眼マウスの、飛行応答を示した。29匹のうちの1匹は明白な飛行反応を示さなかった。しかし、マウスはドームに向かって歩いて、迫り来るまでその近くにとどまり、迫り来る刺激が起こったときにマウスが少なくとも慎重だったことを示す。したがって、迫り来る刺激は、健康な目のマウスにおいて生来の恐怖応答を一貫して誘発した。一方、3つの盲検マウスは、迫り来る (予備的な結果) に対するいかなる反応も示さなかった。まとめて、迫り来る実験がマウスにとって有用で一貫したビジョンテストであることを示します。

迫り来る刺激の速度を192度/s で設定します。 Franceschi et al.²⁹は様々な速度で迫り来る反応を検査し、5 ~ 84 度/s、より低い速度での凍結応答を優先的に観察した。・ヨーマとマイスター²⁸は350度/s に35で飛行応答を観察しました。しかし、フライトの待ち時間がより高速になりました。したがって、一貫性のある飛行応答を呼び起こすには...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10.1インチモニター(2度;ディスプレイ)	Elecrow	Elecrow 10.1インチラズベリーパイ1920x1080p解像度ディスプレイ
14インチビジネスクラスラップトップ5490	デル	84 / rcrc961481-4860836
20インチ×50インチ吸収ライナーフィ	ッシャーサイエンティフィック	AL2050	、アリーナの床を保護するためにうまく機能し、
ライナー21.5インチモニター(1°ディスプレイ)		Acer Acer R221Q bid 21.5インチ IPSフルHDディスプレイ
CCDカメラ	Lumenera Corporation	Infiniyy3S-1UR	高いfps率(60fps)により行動研究に優れた
エンクロージャー(アルミフレームとPVCパネル)	80/20 Inc.	4x cat.#9010, 4x cat.#9005, 1x cat.#9000, 5x cat.#65-2616	優れた、PVC、ジョイント、フレームを見つけるためにクイックビルドタブを使用
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	22-032-601
Excelスプレッドシートソフトウェア	Microsoft Office		のユーザーフレンドリーで広範な知識
Freearm	Amazon		は、テーブルにカメラを取り付けるために使用し、任意のマウント可能なものを使用できます拡張可能な腕
ImageProプレミア3D	メディアサイバネティックス	バージョン9.3	良いプログラムは、自動追跡機能Matlab
ソフトウェア(Psychotoolbox 3)	MathWorks	Matlab R2018b 64ビット(9.5.0.944444)	任意の条件のパターン刺激を生成する優れたソフトウェア
SteamPixソフトウェア	Norpix	StreamPix 7 64ビットシングルカメラ	うまく機能し、フレームのドロップに関するいくつかの問題がありますが、優れたカスタマーサービス
マイブック外付けハードドライブ	ウエスタンデジタル	WDBBGB0080HBKハードドライブ8TBのUSB3.0	は、ファイルのサイズが大きいため圧縮コーデックなしで.aviファイルを使用する場合に必要です
広角レンズ	Navitar	NMV-5M23	優れた、アリーナ全体をキャプチャするために必要です