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方法論記事

ドコサヘキサエノイ酸、エイコサペンタエノイック、アラキドイン酸のエポキシ化代謝産物の酵素合成

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DOI:

10.3791/59770

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2019年6月28日

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1Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

この記事について

サマリー

細菌シトクロムを用いたアラキドン酸(AA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)、エイコサペンタエン酸(EPA)のエポキシドの特異的なエナンチオマーおよびレジオソームの大規模な酵素合成および精製に有用な方法を提示する。P450酵素(BM3)。

要約

エポキシ脂肪酸と呼ばれる様々な多価不飽和脂肪酸(PUF)のエポキシ化代謝物は、ヒト生理学において幅広い役割を有する。これらの代謝産物は、酵素のシトクロムP450クラスによって内因性に産生される。その多様で強力な生物学的効果のために, これらの代謝産物を研究することにかなりの関心があります。.エポキシ脂肪酸は、最初にかなりの量と高純度で取得する必要があるため、体内でこれらの代謝産物のユニークな役割を決定することは困難な作業です。天然源から化合物を得ることは多くの場合、労働集約的であり、可溶性エポキシドヒドロラーゼ(sEH)は代謝産物を急速に加水分解する。一方、化学反応を介してこれらの代謝産物を得ることは非常に非効率的であり、純粋なレジオソーマーおよびエナンチオマー、低収率、および広範な(そして高価な)精製を得ることの難しさに起因する。ここでは、バチルス由来の細菌CYP450酵素であるBM3を用いたエポキシ化によるDHAからの19(S)、20(R)-および16(S)、17(R)-エポキシドコサペンタエン酸(EDP)の効率的な酵素合成を提示する。 メガテリウム(それは大腸菌で容易に発現される)。核磁気共鳴分光法(NMR)、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析(MS)を用いて、純度の特性評価と決定を行います。この手順は、PUFAエポキシ代謝産物の酵素合成の利点を示し、類似性エポキシエポキシサトリエノICを産生するアラキドン酸(AA)およびエイコサペンタエン酸(EPA)を含む他の脂肪酸のエポキシ化に適用可能である。酸(E):エポキシアイコサテトレーネイン酸(EQ)。

概要

多価不飽和脂肪酸(特にオメガ3およびオメガ-6多価不飽和脂肪酸)がヒト生物学で果たす役割への関心が近年高まっており、研究者は代謝産物が魅力的な利点の広い範囲に注目しています。展示。特に、シトクロムP450クラスの酵素によって産生されるエポキシ脂肪酸代謝産物が大きな注目点となっている。例えば、エポキシエイコサトリエノール酸(EAT)、エポキシコサペンタエイン酸(EDP)およびエポキシエイコサテトレーヌ酸(EQ)を含む多くのPUFAエポキシドは、血圧および炎症の調節において重要な役割を果たす1、2,3,4,5.興味深いことに、AAおよびEPAエポキシドの特定のエナンチオマーおよびレジオソーマーは、血管収縮6、7に対して様々な効果を持つことが知られている。ETおよびEQのエナンチオマーおよびレジオダイマーの生理的効果は文書化されているが、DHAから形成された類似性エポキシドコサペンタエン酸(EDP)の効果についてはほとんど知られていない。EPAとDHAの両方に富む魚油8の広範な使用はまた、EDP9への関心をかき立てている。これらのサプリメントの利点は、EDPの生体内レベルが食事10のDHAの量と非常によく調整するので、下流のDHA代謝物(16,17-EDPと19,20-EDPが最も豊富である)に部分的に起因すると考えられています,11.

メタボロミクス、化学生物学、およびその他の方法によってこれらのエポキシ脂肪酸のメカニズムと標的を研究することは、レジオとステレオ異性体の混合物として存在し、純粋な量を得る方法が困難であることが証明されています。エナンチオマーとレジオソーマーが必要です。これらの化合物を化学的に合成するための従来の手段は効果がないことが証明されている。エポキシ化のためのメタ-クロロペルオキシ安息香酸のようなペルオキシ酸の使用は、多くの欠点を有し、特にエポキシ化選択性の欠如は、個々のレジオソーマーおよびエナンチオマーの高価で骨の折れる精製を必要とする。DHAおよびEPA代謝産物の全合成は可能であるが、高コストおよび低収率12、13などの大規模合成には実用的ではないという欠点にも苦しんでいる。酵素反応がレジオおよびステレオ選択的14であるとして、効率的な全体的な生産は、酵素合成で達成することができる。研究は、AAとEPA(BM3を用いて)の酵素エポキシ化が直腸選択的およびエナンチオ選択的15、16、17、18の両方であることを示しているが、この手順はDHAでテストされていない、または大規模なスケール。我々の方法の全体的な目標は、スケールアップし、この化学酵素エポキシ化を最適化し、個々のエナンチオマーとして大量の純粋なエポキシ脂肪酸を迅速に生成することです。ここで提示された方法を使用して, 研究者は、EDPや他のPUFAエポキシ代謝物の合成のためのシンプルで費用対効果の高い戦略へのアクセスを持っています.

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プロトコル

注意:記載されている化学物質を使用する前に、関連するすべての材料安全データシート(MSDS)を参照してください。

1. 野生型BM3の発現

  1. pBS-BM3を接種したDH5α大腸菌(F.アン・ウォーカー博士からの寛大な寄付)を20mL培養管に0.5mgのアンピシリンを加えた無菌LBブロスの5mLに入れた。
  2. 200 rpmで24時間37°Cでシェーカーで細胞培養をインキュベートする。フェルンバッハまたはエルレンマイヤーフラスコで無菌LBスープの1Lに一晩スターター培養(5 mL)とアンピシリンの100mgを追加します。200 rpm で 6 時間 37 °C で振り、次に 200 rpm で 18 h の 30 °C で振ります。
  3. 1,000 x gで10分間4°Cで細胞培養を収集し遠心分離する。上清を捨て、酵素精製まで-78°Cで細胞ペレットを保存します。
    注:上清は、漂白剤による処理によって化学的に殺菌するか、オートクレーブを使用して殺菌し、その後、排水管を注ぎ込むことができます。

2. BM3の精製。

  1. 細胞リシス
    1. 氷上の細胞ペレットを解凍し、氷冷(4°C)可溶化バッファーの40 mLで再中断(10 mMトリス、0.01 mMフェニルメチルスルホンルフッ化物(PMSF;)、0.01 mM EDTA;pH 7.8)を再沈下します。
      注意: PMSF は接触によって有毒です。
    2. 氷の上で、超音波ホモジナイザー(出力電力設定10、デューティ100%)で1分間細胞を超音波処理し、続いて細胞をlyseseするために氷上で1分間のブレークを行います。この手順を 6 回繰り返します。ペレット細胞の破片に11,000 x gで30分間4°Cで細胞を遠心分離します。
  2. アフィニティクロマトグラフィー
    1. 強いアニオン交換クロマトグラフィーカラム(材料の表を参照してください;直径:2.8 cm x 6 cm、カラム容積:37mL)を4°CでバッファA(10 mMトリス、pH 7.8)の5カラム容積(CV)で洗浄して準備します。
    2. 細胞は平衡カラムに溶出し、コールドバッファーA.の3 CVでカラムを洗浄し、カラムをコールドバッファーB(10 mMトリス、600mM NaCl、6CV)で洗浄してBM3を溶かします。
    3. 赤褐色の溶出画分を収集します。タンパク質がすぐに使用されていない場合は、グリセロールと液体窒素とフラッシュ凍結の等しいボリュームとそれを混合します。冷凍溶液を-78°Cに保管してください。

3. BM3によるDHAのエポキシ化

  1. 解凍したBM3酵素の20nMと共に、ジメチルスルホキシド(DMSO)の18.8mLに0.308g(0.940mmol)を加えて反応を調製し、2Lの撹拌反応バッファー(0.12Mリン酸カリウム、5mM MgCl2、pH 7.4)を加えて調製する。酵素濃度は、一酸化炭素/ジチオネートスペクトルアッセイ法19によって決定することができる。
  2. 溶液が撹拌している間、反応バッファーに溶解したNADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元、テトラナトリウム塩、0.808g、0.940mmol)を1等物を添加して反応を開始する。注射器と針に取り付けられた空気で満たされたバルーンと反応混合物を通して空気を泡立てながら、30分間反応をかき混ぜます。
  3. 分光光度計(材料の表を参照)を使用して、NADPHが枯渇しているかどうかを判断するために、340 nmでの反応混合物の吸光度を確認します。NADPHの消費を示す残りの吸光度がない場合、反応は完了です。
    注:通常、反応は30分後に完了します。
  4. 反応混合物を1Mシュウ酸をゆっくりと添加してクエンチし、滴下し、溶液のpHが4に達するまで。

4. EDPの抽出

  1. 2Lのジエチルエーテル(無水、過酸化物を含まない)でクエンチされた緩衝液を3回抽出する。エーテル層(6L)を収集し、無水マグネシウム硫酸マグネシウム(MgSO4)で乾燥させます。
  2. 溶液からMgSO4を濾過し、乾燥エーテル層をロータリーエバポレータに濃縮し、粗EDP残渣を得ます。
  3. フラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を浄化します(40gシリカカートリッジで十分です)。ヘキサンで10%酢酸エチル(EtOAc)から始まり、22分以上ヘキサンで最大60%のEtOAcを上昇させます。
    注:3つの主要なピークが取得され、収集され、1の順序で溶出します。未反応 DHA;2. EDP異体の混合物;そして3。ジエポキシド(通常の過剰酸化製品)。
  4. 分数を組み合わせて、ロータリーエバポレータに集中します。この例から、 0.074 g, (24%)未反応DHAの, 0.151 g (47%)EDP+0.076g(22%)ジエポキシドのが得られた。

5. EDPのエステル化、16(S)、17(R)、19(S)、20(R)-EDP、エステルのサポニゼーション

注意:トリメチルシリルジアジアゾメタン(TMS-ジアゾメタン)は、接触と吸入の両方によって非常に有毒です。適切な個人用保護具を備えたヒュームフードでのみ使用してください。

  1. 無水メタノール(MeOH)の2mLと無水トルエンの3mLで丸底フラスコまたは小バイアルでエポキシド(0.151g、0.435 mmol)を希釈し、攪拌バーを追加し、TMS-ジアゾメタン(1.2モル相当、または0.26mL)を添加する。
  2. 10分待って、淡い黄色の色が残るまで、追加のTMS-ジアゾメタン(0.050 mL)を追加します。
  3. 30分後、ロータリーエバポレーターを使用して混合物を慎重に濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって残渣を浄化します。ヘキサンに4%のEtOAc(40gシリカゲルカラムまたはカートリッジを使用)で22分間溶出します。この例では、19,20-EDPメチルエステル(0.116グラム、74%)16,17-EDP-EDPメチルエステル(0.029g、19%)を、クリアオイル(総収量、93%)として得た。
  4. 精製されたEDPメチルエステルレジオイソーマーを含む分数を収集します。19(S,20(R)-EDP メチルエステルが最初に溶出し、次いで 16(S)、17( R)-EDP メチルエステルが続く。
  5. 混合画分が残っている場合(両方の性同一性を含む;8:1ヘキサン/EtOAcの薄層クロマトグラフィー(TLC)によって評価され、過マンガン酸カリウム(KMnO4)で染色され、以前と同じ溶媒系でクロマトグラフを再クロマトグラフ化する。
  6. 個々のレジオイソーマーを含む分数を濃縮する。
    注: この時点で、同一性と純度は NMR によって評価される場合があります (CDCl3を溶媒として使用し、図 2の凡例を参照)。
  7. 個々のEDPメチルエステルレジオソーマーを酸形態に変換するには、THF:水中(エステルの約0.7 mL/0.1 mmol)でEDPエステルを希釈します。2 M水性LiOH(3モル相当)を加え、一晩かき混ぜる。
    注:反応の完全性は、KMnO 4で染色3:1ヘキサン/EtOAcを使用して、TLCによって評価することができます。製品の保持係数は~0.3です。
  8. ギ酸で反応をゆっくりとクエンチし、混合物のpHが3-4に達するまで。水と酢酸エチル(エステルの1-2 mL/0.100 mmol)を追加し、層を分離します。EtOAc(3 x 5 mL)で水層を抽出し、飽和塩水(NaCl)溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム(Na2 SO4)でEtOAc層を乾燥させます。
  9. ロータリーエバポレーターを用いて酢酸エチル溶液を濃縮し、ヘキサン(10mL)を添加し、再度濃縮する。アゼオトロピカルに2回繰り返し、残留ギ酸を除去する。フラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を浄化し、15分以上10~30%のEtOAcで溶出します。
  10. 所望の分画を濃縮し、精製酸を与えるために真空中で乾燥させます。
    注:この段階では、エナンチオメリック純度が評価されてもよい(キラルHPLCによって、図3の凡例を参照してください - 図4のカラムおよび条件)。化学的純度は、C18(アチラル)HPLCによって評価することができる(材料の表および参照14を参照)。

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結果

酵素エポキシ化から粗混合物を精製する際に得られるフラッシュカラムクロマトグラム(以下に説明するように自動フラッシュ精製システムを用いて行う)を図1に示す。レジジオソーマーのエステル化および分離に続いて、純16(S)、17(R)-EDPおよび19(S)、20(R)-EDPメチルエステルが得られた。通常、それらはおよそ1:4から1:5の比率で存在し、主要な製品は19(S)、20(R)-EDPである。他のEDPレジジオソーマー(例えば、13,14-または10,11-EDP)は得られない。16(S)、17(R)-EDP(図2A)、19(S)、20(R)-EDP(図2B)のメチルエステルの1つのH-NMRスペクトルを以下に示し、これらの高純度を示す。<...

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ディスカッション

ここでは、DHAの2つの最も豊富なエポキシ代謝産物を調製するための運用上のシンプルで費用対効果の高い方法を提示します - 19,20および16,17-EDP。これらのエポキシ脂肪酸は、野生型BM3酵素を用いて高エナンチオプル(S,R-isomersとして)形態で調製することができる。トラブルシューティングに使用できるいくつかの重要なポイントと、AAおよびEPAのエナンチオピュアエポキシ代謝物を調製する方法の拡張について、以下に説明する。

BM3 ストレージに関するガイドライン

精製されたBM3酵素を貯蔵することは、-78°C冷凍庫に貯蔵する前に液体窒素と同量のグリセロールとフラッシュ凍結と同量のタンパク質溶液を混合することによって可能である。酵素が凍結されると、最大1年間保存することができます。酵素は一度だけ解凍することができ、氷の上で解凍する必要があり、再び4時間凍結し、酵素が氷浴なしで解凍できるようにすると、酵素が不活性化されます。

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開示事項

著者は、開示する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、R00 ES024806(国立衛生研究所)、DMS-1761320(国立科学財団)、ミシガン州立大学からのスタートアップファンドによって資金提供されています。著者らは、ジャンジー反応の最適化を支援するジャン・ヤン博士(カリフォルニア大学デイビス校)とラリタ・カルチャラ博士(ミシガン州立大学)とトニー・シルミラー博士(MSU質量分析・メタボロミクス施設)に感謝したいと考えています。HRMSデータ取得の支援のために。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
重炭酸アンモニウムΣ9830NA
アンピシリンGoldBioA30125NA
無水硫酸マグネシウムフィッシャーサイエンティフィックM65-3NA
無水メタノールシグマ・アルドリッチ322515NA
無水硫酸ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS421-500NA
無水トルエンシグマ・アルドリッチ244511NA
アラキドン酸 (AA)Nu-Chek PrepU-71Aエアセンシティブ. 
ジエチルエーテルSigma296082NA
DMSO (分子生物学グレード)Sigma-AldrichD8418NA
ドコサヘキサエン酸 (DHA)Nu-Chek PrepU-84A空気に敏感です。 
EDTA(エチレンジアミン四酢酸)Invitrogen15576028NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)Nu-Chek Prep U-99Aエアセンシティブ 
酢酸エチルSigma 34858NA
フラッシュ カラム カートリッジ 25、40、4、12 g サイズフィッシャー サイエンティフィック145170203、145154064、5170200あるいは、従来のカラム クロマトグラフィーは
ギ酸 (HPLC グレード)J.T. ベイカー0128-01NA
グリセロールシグマG7757NA
ヘキサンVWRBDH24575NA
LB ブロスSigmaL3022NA
水酸化リチウムSigma-Aldrich442410NA
塩化マグネシウムFisher Scientific2444-01NA
メタノール (HPLC グレード)Sigma-Aldrich34860-41-R
NA NADPH 四ナトリウム塩Sigma-Aldrich481973空気に敏感です。 
シュウ酸Sigma-Aldrich194131NA
pBS-BM3 トランスフェクト DH5&α; 大腸菌NANA
NA PMSF (フェニルメタンスルホニルフッ化物)SigmaP7626有毒!
過マンガン酸カリウムSigma-Aldrich223468TLC染色用 
リン酸カリウム二塩基性シグマ795496NA
リン酸カリウム一塩基性シグマ795488NA
Qセファロース高速フロー樹脂(GEヘルスケアライフサイエンス)フィッシャーサイエンティフィック17-0515-01陰イオン交換精製
ナトリウムシグマ71376NA
テトラヒドロフラン、無水シグマアルドリッチ186562NA
TMS-ジアゾメタン (ヘキサン中 2.0 M)Sigma-Aldrich362832非常に毒性が高い。 
Tris-HClGoldBioT-400NA
strong>も必要です:
自動フラッシュ精製装置(Buchi Reveleris X2を使用) Buchi
C18 HPLC カラム (Zorbax Eclipse XDB-C18)Agilent
遠心分離機 10,000 x g
キラル HPLC カラム (Lux セルロース-3)、250 x 4.6 mm、5 µM、1000 Å)Phenomenex
一般化学用品:2 Lのセパリー漏斗、ビーカー、1000-2000 Lの容量の三角フラスコ、20 mLバイアル、HPLCバイアル、小さな丸底フラスコ、攪拌子。
HPLC(島津製作所製LC-20AT分析ポンプ、SPD-20A紫外可視検出器島津
製作所製ナノドロップ2000分光光度計を使用 サーモフィッシャーサイエンティフィック
NMRNMR:Agilent DD2分光計(500 MHz)
ロータリーエバポレーターBuchi
Sonicディスクレーブレーターまたは超音波ホモジナイザーCole-Parmer
酵素塩化ナトリウムの用塩化<、、

参考文献

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