安定したヒト様腸内微生物叢とヒト免疫系を特徴とする二重ヒト化BLTマウスモデル

サマリー

機能的なヒト免疫系と安定なヒト様腸内微生物叢を特徴とする二重ヒト化BLTマウスを生成する新しい方法について述べた。このプロトコルは、無菌マウスまたはグノトバイオティック施設を必要とせずに従うことができる。

要約

機能的なヒト免疫系を特徴とするヒト化マウス(hu-mice)は、ヒト病原体および疾患の研究を根本的に変えた。彼らは、人間や他の動物モデルで研究することが困難または不可能である疾患をモデル化するために使用することができます。腸内微生物叢は、人間の健康と病気に深刻な影響を与えることができます。しかし、マウス腸の微生物叢は、ヒトに見られるものとは非常に異なっています。 ヒト腸内微生物叢を生着させた改良された前臨床hu-マウスモデルの必要性がある。そこで、ヒト免疫系と安定したヒト様腸内微生物叢の両方を特徴とする二重hu-マウスを作成しました。うなずく。Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG)マウスは、免疫不全の高レベルによるヒト化のための最良の動物の一つです。しかしながら、無菌NSGマウス、および他の種々の重要な無菌マウスモデルは、現在市販されていない。さらに、多くの研究設定は、グノトバイオティクス施設へのアクセスを持っていない、とグノトバイオティクス条件下で作業すると、多くの場合、高価で時間がかかることができます。重要なことに、無菌マウスは、微生物の生着後も存在するいくつかの免疫不全を有する。そこで、無菌動物やグノトバイオティクス施設を必要としないプロトコルを開発しました。二重hu-マウスを生成するために、NSGマウスは、骨髄、肝臓、胸腺ヒト化(hu-BLT)マウスを作成するために手術前に放射線で治療した。その後、マウスを広範囲の抗生物質で治療し、既存のマウス腸内微生物叢を枯渇させた。抗生物質治療の後、マウスは、経口ガビジを介して健康なヒトドナーサンプルを用いた胎児移植を与えられた。二重hu-BLTマウスは、移植された個々のヒトドナーサンプルに基づいてユニークな16S rRNA遺伝子プロファイルを有した。重要なことに、移植されたヒト様マイクロバイオームは、移植後14.5週間までの研究期間中、二重hu-BLTマウスにおいて安定であった。

概要

ヒト化マウス(hu-mice)は、ヘマトポイシス、免疫、癌、自己免疫疾患、感染症1、2、3、4を含むヒトの健康および疾患の多くの側面の研究を変えた ^,5,6,7,^8,9.これらのhu-マウスは、機能的なヒト免疫系を有し、ヒト特異的病原体に感染することができるというという利点を他のマウスモデルに比べて明確に有する。それにもかかわらず、腸内微生物叢の重要性は、肥満、メタボリックシンドローム、炎症性疾患、および癌10、11、12、および癌のような多くのヒト疾患におけるその役割によって実証されている。 ¹³.粘膜免疫系と腸内微生物叢は、腸および全身恒常性を維持するために相互に調節される。免疫系は腸内微生物叢によって提示される抗原によって形成され、相互に免疫系は、同時腸内細菌を促進し、病原体を排除する上で重要な調節的役割を果たしている^14,15,16.しかし、hu-マウスの腸内微生物叢は十分に特徴付けされておらず、マウス腸内微生物叢は^ヒト17と組成および機能において実質的に異なる。これは、マウスとヒト腸の間の進化的、生理学的、および解剖学的な違い、ならびに食事などの他の重要な要因によるもので、これはhu-mice疾患^モデル18の実験結果に影響を与える可能性がある。そこで、マウスのマウスのマウス腸微生物叢の分類を超えて、ヒト免疫系とヒト腸内微生物叢の両方を特徴とする動物モデルが、生体内におけるヒト疾患の複雑な相互作用を研究するために必要とされる。

ヒトの被験者における直接のヒト疾患の研究は、多くの場合、非現実的または非倫理的である。多くの動物モデルは、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)のようなヒト病原体の研究に使用できない。非ヒト霊長類モデルは遺伝的に繁殖し、非常に高価であり、多くのヒト病原体の影響を受けにくい。生殖細胞フリー(GF)として誘導され、ヒト様腸内微生物叢で再構成されたマウスは、ヒトの健康および疾患を研究するために広く使用されている19,20。しかし、これらの動物は人間の免疫システムを持っていないし、GF動物と協力するには、専門的な施設、手順、および専門知識が必要です。したがって、腸内微生物叢とヒト免疫系の複雑な関係を研究するために、改善された前臨床モデルが必要である。NODなどのマウスの多くの株。Cg-Prkdc^sdIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG)は、GFとして市販されていない。GF動物はまた、^微生物21の生着によって完全に逆転しない長期的な免疫欠乏に苦しむことがある。そこで、特定病原体フリー(SPF)条件下で、機能的なヒト免疫系と安定したヒト様腸内微生物叢の両方を特徴とする二重hu-miceを作成した。二重hu-マウスを生成するために、NSGマウスに対して骨髄、肝臓、胸腺ヒト化マウス(hu-BLT)を作成する手術を行った。その後、hu-BLTマウスを広範囲の抗生物質で治療し、健康なヒトドナーサンプルで胎児移植を行った。45匹の二重hu-BLTマウスと4つのヒトfecalドナーサンプルから173のfecalサンプルの細菌性腸内微生物叢を特徴付けた。二重hu-BLTマウスは、移植される個々のヒトドナーサンプルに基づいてユニークな16S rRNA遺伝子プロファイルを有する。重要なことに、移植されたヒト様マイクロバイオームは、移植後14.5週間までの研究期間中、マウスにおいて安定であった。さらに、予測されたメタゲノムは、二重hu-BLTマウスがヒトドナーサンプルに類似したhu-マウスとは異なる予測機能能を有することを示した。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、ネブラスカ大学リンカーン校(UNL)で機関動物ケア研究委員会(IACUC)承認されたプロトコルに従って行われました。UNLのIACUCは、二重hu-マウスを含むhu-BLTマウスの生成および使用に関連する2つのプロトコルを承認した。さらに、UNLの科学研究監視委員会(SROC)は、ヒト胚性幹細胞および胎児組織の使用を承認しており、これはヒト化マウス研究のための先端生物科学資源から調達される(SROC# 2016-1-002)。

1. マウスのハウジングとメンテナンス

1. 6-8週齢のNSGマウスを購入する(NOD.Cg-Prkdc^sdIl2rg^tm1Wjl/SzJ)。
2. 制御された温度、湿度、および圧力の部屋で空気交換、プレフィルター、およびHEPAフィルター(0.22 μm)を使用してSPF条件下でマウスを収容します。
   1. プレフィルターおよびHEPAフィルター(0.22 μm)との空気交換を管理することができるラックシステムのオートクレーブされた個々のマイクロアイソレータケージのマウスを家にし、維持する。
3. 70%エタノールで前処理されたクラスIIタイプA2生物学的安全ヒュームフード内のマウスのすべての手順および操作を行う。動物室で働く前に、シャワーを浴びて、きれいなスクラブ、タイベックスーツ、ブーツカバー、ヘアキャップ、フェイスマスク、手袋に変更してください。外科手術中にタイベックスーツの上に外科ガウンを着用してください。
   注:紫外線(UV)光除染も手順の前に好ましいです。
   1. 可能であれば、すべての機器と試薬をオートクレーブし、ヒュームフードに移す前に消毒してください。
   2. 処置の間、動物の個々に換気されたケージをラックから取り外し、ヒュームフードに移す前に消毒する。
4. 照射された食事をマウスに与え、オートクレーブ水を提供する。照射された食品ab libitumを提供し、必要に応じて追加の照射食品を補足する。オートクレーブ水を毎週、または必要に応じて変更します。
   注:オートクレーブ酸水も使用できます。提供される照射された食事は、製造後6ヶ月の貯蔵寿命を有していた。

2. ヒト化BLTマウスの生成

注:hu-BLTマウスの生成は、前述の22、23、24である。

1. 手術の日に、体重の12 cGy/gの用量でマウスに全身照射を与える。
2. 手術のためにマウスを準備します。
   1. 各照射マウスに100mg/kgの作業濃度でケタミンとキシラジンの混合物を与え、12mg/kgの濃度で、麻酔のための経周炎(IP)注射による体重に基づいてマウス当たり130〜170 μLの範囲であった。ケタミンとキシラジン混合物の3ミリリットルを調出すには、無菌生理生殖塩水の100mg/mLから2.7mLの濃度で100mg/mLのストック濃度でケタミンの0.27 mLと0.03 mLのキシラジンを加え、よく混ぜます。注射前に70%イソプロパノールで皮膚を消毒する。
   2. 長続きする疼痛管理のための皮下注射により、各照射マウスブプレノルフィン1mg/kgの体重(ハーフライブ72h、SR-LAB)を与える。
   3. 術前抗生物質予防のためのIP注射により、セファゾリンの照射マウス100μL(858 μg)を各照射したマウスに与える。
   4. 左腎臓を露出するために使用される後の外科的部位でマウスの左横および中間側の周りに電気ヘアバリカンを使用してマウスの毛を剃る。
   5. ペダル反射(しっかりしたつま先のピンチ)によって麻酔の適切なレベルを確認します。
   6. 手術中の任意の時点で追加の麻酔が必要な場合は、3-5%でイソファランガスを与えます。
   7. 角膜乾燥を防ぐために、両眼に眼科の塞ぎを適用します。必要に応じて耳札を適用します。
3. 肝臓と胸腺組織を左腎臓カプセルに移植する手術を行う。
   1. 手術部位の中心から始まり、円形に外側に向かって移動することにより、手術部位の皮膚を消毒する。70% イソプロパノールとヨウ素で 3 回目のこのプロセスを繰り返します。.
   2. 鉗子を使用して、最初に1人のヒト胎児肝組織断片をトロカールにロードする。次に鉗子を使用して、1人のヒト胎児胸腺組織断片をトロカールにロードする。その後、鉗子を使用して、別のヒト胎児肝組織断片をトロカールにロードする。組織はトロカールの内部の次元に合うように1-1.6 mm³に切断する必要があります。
   3. 鉗子を使用して皮膚を持ち上げ、ハサミを使用して縦方向に小さなカットを行います。マウスの左側の切り口を 1.5~2 cm に伸ばします。
   4. 鉗子を使用して筋肉層を持ち上げ、ハサミを使用して縦方向に小さなカットを行います。腎臓を露出させるために必要に応じてカットを拡張します。
   5. 腎臓を取り巻く脂肪組織をやさしくつかんで腎臓を露出させる。腎臓のアレンキマに直接触れないでください。
   6. メスを使用して腎臓カプセルの後端に1-2ミリメートルの切開を行います。
   7. 腎臓の長軸に平行な切開部を通してプリロードされたトロカールをゆっくりと挿入し、腎臓カプセルと腎臓の間の組織を放出する。
   8. 慎重に腎臓と腸を正常な位置に戻します。吸収性5/0 P-3(P-13)縫合糸を13mm 3/8円針で使用し、筋肉層と外科的ステープルを閉じて皮膚を閉じます。
4. 手術後、回復のためにきれいなオートクレーブされたマイクロアイゾレーターケージにマウスを入れてください。
   1. 手術後の回復時の熱損失を最小限に抑えるには、水を温め、循環するウォーターポンプに接続された加熱パッドにマウスを含むケージを置きます。
   2. 彼らは胸骨の回復を維持するために十分な意識を取り戻すまで、マウスを監視します。
5. 手術完了の6時間以内に、尾静脈を介して、ヒト胎児肝組織から単離されたCD34+造血幹細胞を注入する。
   1. ヒートランプでマウスを温めます。70%イソプロパノールで尾を消毒し、尾静脈に1.5~5×10×10⁵幹細胞/200μLを注入します。
   2. 注射からの出血を止め、マウスをマイクロアイソレーターケージとマイクロアイソレータケージに戻します。
      注:手術後のマウスは、通常、回復中および回復後に、マイクロイソレーターケージあたり5個、一緒に収容される。しかし、マウスは、すべて同じ日に手術を受けた場合にのみ一緒に収容されます。
6. 毎日マウスをチェックしてください。慎重に外科用ステープルを監視し、必要に応じて交換してください。感染や不快感の兆候がないかマウスを注意深く監視します。手術後数日間、マイクロアイソレーターケージの床にオートクレーブ食品を供給します。
7. 手術後7-10日後に外科ステープルを取り除きます。マウスを麻酔するために3-5%でイソファランガスを与える。慎重に主食を削除し、サイトに抗生物質と痛みを和らげるの化土を適用します。
8. ヒト免疫細胞の再構成のために9〜12週間を許可し、次いで、ヒト化マウスのそれぞれから中間のサフェノース静脈から末梢血を収集する。
   1. 適切なサイズのプラスチックコーン拘束を使用して意識のあるマウスを拘束し、呼吸のためにマウスの頭部付近に開口部を開き、マウスの背面付近に開口部を開いて片足を分離する。最初に拘束コーンヘッドにマウスを入れ、脚の開口部を通して片足をそっと引っ張ります。
   2. 70%イソプロパノールで単離された脚の中間側をスプレーし、その後、同じ部位に抗生物質と痛みを和らげる麦膏を広げます。
      注:軟膏は、脱毛を必要とせずに静脈の位置を明らかにするのに役立ち、また、血滴の形成を支援します。
   3. 90°の角度で25ゲージの針を使用して、静脈を穿刺し、EDTAコーティングされた血液採取管を使用して50-100 μLの血液を集める。滅菌ガーゼで部位に圧力をかけることで出血を止める。出血が止まったら、マウスをケージに戻します。
      注:収集される最大血液量は、通常、1週間あたり50 μLまたは2週間ごとに100 μLです。
   4. 収集した末梢血を使用して、hCD45、mCD45、hCD3、hCD4、hCD8、hCD19の抗体を用いたフローサイトメトリーを用いてヒト免疫細胞再構成のレベルを試験する。

3. 抗生物質治療

1. 抗生物質治療の前に、前処理の胎児サンプルを収集します。マウスを新しいオートクレーブ化マイクロアイゾレーターケージに移動します。
2. 毎日広域抗生物質の新鮮なカクテルを準備します。
   1. 作りたてのメトロニダゾール(1g/L)、ネオマイシン(1g/L)、バンコマイシン(0.5g/L)、アンピシリン(1g/L)を含む水を250mLの水に用意し、マウスの各ミクロイソレーターケージに分けて準備します。
      注:抗生物質補充飲料水には、オートクレーブまたは滅菌水を使用してください。
   2. 250 mLの抗生物質補給水にブドウ糖甘味飲料ミックスの9.2gを加えます。
      注:ブドウ糖甘味飲料ミックスの使用は、抗生物質の苦味をマスクし、マウスの脱水を防ぐのに役立ちます。
   3. 抗生物質とブドウ糖甘味飲料ミックス補充水を変更し、毎日新しいオートクレーブケージにマウスを置きます。
      注:マウスは同調であり、ケージを毎日変更すると、マウスが腸内細菌で再接種するのを防ぐことができます。
   4. ヒト様腸内微生物叢の最大生着については、14日間抗生物質を提供する。抗生物質治療中に、マウスの体重減少と脱水を監視します。体重減少は、治療の期間中、最初の3-4日とその後の高原の間に予想されます。脱水が発生した場合は、経皮注射を介してマウスに生理生理理生理理知またはリンガー溶液を与える。
      注:他の腸内微生物叢ヒト化プロトコルは、抗生物質の経口ゲージを必要とします。マウスの腸内細菌を枯渇させるのに効果的である一方で、飲料水に抗生物質を添加する侵襲性の低い方法は、ヒト化したマウスにストレスを与え、より良い結果につながることがわかりました。

4. ドナーサンプルと大腿骨移植

1. ヒトドナーの卵子サンプルを調調します。
   1. ヒト化マウスへの胎児移植のためのfecal微生物叢移植(FMT)材料の適切に調製されたソースを使用してください。
   2. FMT製剤を解凍し、嫌気性チャンバー内の嫌気性条件下でそれらをアリコートします。
   3. 必要に応じて、このステップで、このステップで一緒にフェカルサンプルの等しい部分を混合し、公平な「ヒト」サンプルを作成します。
   4. サンプルのアリコートまたは混合が必要ない場合は、手順の直前に解凍するだけで、FMT材料の凍結と解凍を最小限に抑えてください。
2. ヒトの胎児移植
   1. 14日間の抗生物質治療が完了した後、飲料水をオートクレーブ水に変更し、マウスを新しいオートクレーブケージに移動します。毎日のケージの変更を停止し、1-2週間に1回ケージ変更スケジュールを実装します。
   2. 抗生物質の24と48時間の停止で2つの偽の移植を与える。
   3. 抗生物質治療後24時間、必要量のFMT材料を解凍し、経口ガベージを介して各マウスに200μLのFMT材料を与える。48時間後抗生物質で再び手順を繰り返す。
   4. 人間化されたマウスの毛皮またはケージの寝具の上に残っているか、または残った解凍されたFMT材料を広げる。

5. 新鮮なフェカルサンプルコレクション

1. ヒュームフードに移す前に、個々の紙袋をオートクレーブします。
2. ヒュームフードで、個々の紙袋に1匹のマウスを入れ、マウスが排便できるようにします。
3. 生殖不能鉗子を使用して、1.5 mLのプラスチック管にfecalサンプルを集め、-80°Cで凍結する。マウスをマイクロアイソレーターケージに戻します。
   注:fecalサンプルを収集するこの方法は、ストレス誘導操作なしで個々のマウスから新鮮なfecalサンプルコレクションを可能にします。

結果

図1は、二重hu-BLTマウスを作成するために使用される方法の概要を示し、NSGマウスに機能的なヒト免疫系および安定なヒト様腸内微生物叢を加えるプロセスを簡単に説明する。図2は、ヒト化BLTマウスからの末梢血のフローサイトメトリー分析の例を示す。.図3は、腸内微生物叢を転写して二重hu-マウスを作成するために使用されるヒトfecalドナーサンプルの相対的な存在量を示す。図4は、無菌動物で観察されるのと同様に、脾臓および盲液に対する抗生物質治療によって誘発されるフェトイピック変化を示す。図5は、2重hu-マウスがヒトドナーサンプルに特有のヒト様腸内微生物叢を有することを明らかにする16S rRNAシーケンシングデータの主成分分析(PCA)プロットを示す。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、機能的なヒト免疫系と安定したヒト様腸内微生物叢の両方を特徴とする二重hu-BLTマウスの作成用である。このプロトコルは、GF動物およびグノトバイオティック施設を必要とせずに、他のヒト化または非ヒト化マウスモデルに適合させることができる。ここで説明する方法は比較的単純ですが、二重hu-BLTマウスの作成を成功させるには重要な重要な詳細がいくつかあります。NSGマウスは非常に免疫不不十分であり、感染を予防することはマウスの長期生存の鍵である。感染予防に向けた対策を講じています。まず、動物は、専用スイートで空気交換レート管理を備えたラックシステムにHEPAフィルター(0.22 μm)を備えた個々のマイクロアイソレータケージに収容されました。ラックのエアハンドラには、HEPAフィルタリング(0.22 μm)の供給と排気量のほか、ケージの排気温度と相対湿度のリアルタイムのオンライン監視と共に、プレフィルターが含まれていました。第二に、動物室に入ったすべての人は、シャワーを浴びて、きれいなスクラブと靴を着用するだけでなく、手袋、使い捨てのタイベックスーツ、ブーツ、ヘアボンネット、フェイスマスクを着用しなければなりませんで...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動物給餌針18G	ケイデンス科学	9928B
クリドックス-sアクチベーター	薬理研究所	95120F
クリドックス-sベース	薬理研究所	96125F
DGM 108ケージラック	テクニプラスト
フラットブラウン食料品袋3-5 / 8 "D x 6" W x 11-1 / 16 "L	グレイン	ジャー12R063FMT
上部送達微生物叢製剤	OpenBiome	FMP30
Grape Kool-Aid	クラフトフーズ株式会社
hCD19-PE/Cy5	Biolegend	302209
hCD3-PE	Biolegend	300408
hCD4-Alexa 700	Biolegend	300526
hCD45-FITC	Biolegend	304006
hCD8-APC/Cy7	Biolegend	301016
Lactate Buffered Ringer's Solution	Boston BioProducts Inc	PY-906-500
mCD45-APC	Biolegend	103111
Microvette 100 K3E	Microvette	20.1278.100
ネオスポリン応急処置 抗生物質/鎮痛軟膏	ネオスポリン
NSG マウス (NOD.CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)	ジャクソン研究所	005557
PrecisionGlide 25 G ニードル	BD	305127
RS200 X 線照射器	RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 マイクロアイソレーターケージ	Techniplast
滅菌不織布ガーゼ	フィッシャーブランド	22-028-558
Teklad global 16% protein irpliated mouse chow	Teklad	2916