方法論記事

明確に定義されたせん断応力下の単一細胞イオン電流の電気生理学的記録

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DOI：

10.3791/59776

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2019年8月2日

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, University of Illinois at Chicago

この記事について

サマリー

このプロトコルの目的は、せん断応力によるメカノ感受性イオンチャネルのリアルタイム活性化を調査する上で使用する改変並列プレートフローチャンバを記述することです。

要約

流体せん断応力は、内皮機能において大きな役割を果たすることがよく知られている。ほとんどの血管床では、血流の急激な増加によるせん断ストレスの上昇は、血管拡張を引き起こし、それによって血管壁の機械的ストレスを緩和するシグナル伝達カスケードを引き起こす。せん断ストレスのパターンは、層せん断ストレスがアテローム保護および乱れたせん断ストレスがプロアトロジェニックであるアテローム性動脈硬化症の発症の重要な要因であることもよく知られている。様々な中間細胞シグナル伝達経路を詳しく理解していますが、最初に機械的刺激を化学メディエーターに変換する受容体は完全には理解されていません。メカノ感受性イオンチャネルは、せん断に対する応答に不可欠であり、それによって血管活性メディエーターの産生を制御するせん断誘発細胞シグナル伝達を調節する。これらのチャネルは、せん断する最も初期の活性化シグナル伝達成分の一部であり、一酸化窒素産生を促進することによりせん断誘発性血管拡張にリンクされている(例えば、内側に整流K +[Kir]および一過性受容体電位[TRP]チャネル)および内皮過分極因子(例えば、Kirおよびカルシウム活性化K+[KCa]チャネル)およびピエゾチャネルを含む未決定のメカニズムを介してせん断誘発血管収縮。これらのチャネルがせん断力(すなわち、直接または一次メカノ受容体を介して)によって活性化される生物物理学的メカニズムを理解することは、内皮機能障害に関連する病態生理学を解決するための潜在的な新しい標的を提供する可能性があるそしてアテロジェネシス。電気生理学を用いて、イオンチャネルの流れ誘発活性化をリアルタイムで記録することは、依然として大きな課題です。円盤とプレートレオメータや閉じた平行プレートフローチャンバなど、明確に定義されたせん断応力に細胞をさらす標準的な方法では、イオンチャネル活性化のリアルタイム調査はできません。このプロトコルの目的は、明確に定義されたせん断応力の下でメカノセンシティブイオンチャネルのリアルタイム電気生理学的記録を可能にする修正された並列プレートフローチャンバを記述することです。

概要

血流によって発生する血行力は、内皮および血管機能1、2において主要な役割を果たすることがよく知られている。また、いくつかのタイプのイオンチャネルがせん断応力3、4、5の変化に鋭く反応し、イオンチャネルが一次せん断応力センサになりうするという仮説を導くこともよく知られている。最近では、我々と他の人は、メカノ感受性イオンチャネルがせん断ストレス6、7、8に対する血管活性応答を含むいくつかのせん断ストレス感受性血管機能において重要な役割を果たすことを示した。、および発達血管新生9.しかし、イオンチャネルのせん断応力感受性のメカニズムはほとんど全く知られていない。この知識のギャップは、明確に定義されたせん断応力の下で電気生理学的記録を行うことの技術的な困難に起因する可能性が高い。したがって、この記事では、この目標6、7、10、11を達成するためにラボで日常的に実行される詳細なプロトコルを段階的に提供します。

この方法の全体的な目標は、生理学的範囲で明確に定義されたせん断ストレスの下でイオンチャネルメカノ活性化のリアルタイム調査を可能にすることです。これは、標準的な並列プレートフローチャンバを変更して、電気生理学的ピペットをチャンバ内に下げ、リアルタイムの流量の間に底板上で成長した細胞にアクセスできるようにすることで達成され、これを達成するためのユニークなアプローチを提供します。ゴール6,7,11.対照的に、以前の出版物に記載されている標準的な並列板流れ室は、せん断力12または他の非侵襲的アプローチ13、14に曝露された細胞のリアルタイムイメージング分析に使用することができるが、以下の場合には使用できない。電気 生理 学。同様に、コーン及び板装置は、せん断応力15、16に細胞を露出させる別の強力なアプローチも電気生理学的記録には適していない。したがって、これらの流れ装置は、イオンチャネルのせん断応力感度の調査を可能にしない。流れの下で電気生理学的記録を行うことの難しさは、これらの重要な効果を担当するメカニズムに関する情報の貧弱さの主な理由です。

同じ目標を達成するための代替アプローチに関しては、正確または制御されているものはありません。いくつかの以前の研究は、17、18の上から細胞の近くに持って来た別のピペットから来る液体の流れに細胞を露出することによって、流れの下でイオンチャネル活性を記録しようとしました。これらの条件下で発生する機械的力は、血管内のせん断ストレスの生理学的プロファイルとほとんど共通点を持たないため、これは非常に非生理学的である。同様の懸念は、開いているチャンバーの灌流によって生理的せん断ストレスをシミュレートする試みに適用されます。我々の以前の研究10で詳しく説明したように、開いた液体空気界面は、非生理学的である複数の妨害および再循環を作成する。これらすべての懸念に対処するために、我々は、我々の以前の研究6、7、10、11で「最小限に侵略的な流れ装置」とも呼ばれる修正された平行板(MPP)フローチャンバーを設計しました。アクリルから、私たちの研究室で広く使用されています。しかし、設計の元の説明はほぼ20年前に公開されており、明確に定義されたせん断応力の下で電気生理学的記録を行うことを可能にする唯一のフローデバイスであるという事実にもかかわらず、この方法論は行われていなかった。他のラボで採用され、流れの下で電流を記録しようとする研究はごくわずかです。したがって、MPPフローチャンバーを使用するための詳細な説明を提供することは、メカノ感受性イオンチャネルおよび血管生物学に興味を持っている研究に大きな助けになると信じています。

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プロトコル

私たちの研究で動物の使用は、シカゴ動物ケア委員会(#16-183)でイリノイ大学によって承認されています。

1. 修正平行板フローチャンバーの組み立て

注:MPP フローチャンバピースの図1および図 1を参照してください。組み立て用チャンバーピースの向きを詳述した回路図については、図1を参照してください。

  1. 長方形のカバーガラスに付着するには、ピースD、ピースCの底部に、まず500μLシリコーンエラストマー硬化剤を5mLのシリコーンエラストマーベースに完全に混合してシリコーンエラストマー溶液を作る。
  2. ピースCの長方形空間の縁の周りにシリコーンエラストマー溶液の薄い層を適用し、長方形のカバーガラス片Dをエラストマー溶液上に静かに配置し、そのピースDがピースCの開いた長方形の空間を完全に覆うようにします。余分なシリコーンエラストマー溶液を慎重に拭き取ります。
  3. 長方形のカバーガラス、ピースFをピースEの底部に付着させ、シリコーンエラストマー溶液を室温で一晩硬化させる手順1.2を繰り返します。
    注:硬化すると、長方形のカバーガラスは、交換する必要がある前に、最大6ヶ月間付着したままになります。
  4. 底部チャンバピースから始まり、ピースEは、各ピースを順番に前の上に置いてMPPフローチャンバを組み立てます:ピースE(下)、ピースC、ピースB、ピースA(上)。
  5. 各部分のネジ穴をコーナーに揃え、MPPフローチャンバへの流れを管理しながら漏れが発生しないように、ピースをしっかりとねじ込みます。

2. MPPフローチャンバーへの細胞調製と播種

注:培養した内皮細胞については、手順2.1−2.7に従ってください。マウス腸間膜動脈アーケードから内皮細胞を分離し、新たに単離された内皮細胞を調製するための手順2.8−2.14に詳述された方法に従ってください。

  1. 6ウェルプレートに、4~5個の12mmカバーガラス円/ウェルとシード細胞を10%~30%の合流性の間に置き、単一の細胞に電気生理学的記録のためにアクセスできるようにします。
  2. 標準的な培養条件下で細胞をインキュベート(5%CO2、37°C)を2時間以上、細胞が付着し、著者の経験の内皮細胞が24時間を超えると非常に平坦になり、24以上のサブコンフルエンスで播種するとパッチを適用することが困難になります。H。
  3. 6ウェルプレートのウェルから付着した細胞を含むカバーガラスを取り出し、リン酸緩衝生理食液(PBS)で素早くすすり、MPPフローに移す前に2mL電気生理学的浴液(表2)を含む35mmペトリ皿に移す。室。
  4. カバーガラス円を長方形のカバーガラスに移し、MPPフローチャンバのピースCに付着したピースDは、細胞が空気にさらされないように十分な溶液がカバーガラス上に留まることを確実にする。カバーガラスの円と細胞が溶液中に完全に沈み込むように、目的の浴液(〜250 μL)を細胞に追加します。
  5. カバーガラス円を真空貯留部側に最も近い半分に置き、セルがピースBのスリット開口部に沿うように配置します。チャンバーへの流れはカバーガラス円の位置を妨げない。
  6. ステップ 1.4 および 1.5 に記載されているように、図 1に示すように、適切な順序でピースをねじ込んで MPP フロー チャンバを組み立てます。チャンバーを顕微鏡段階に移し、溶液が吸引用の真空貯留槽に到達するように、すぐに浴液でチャンバーを浸透させる(〜10 mL)。
  7. 暗い境界線と明らかな核を持つ細胞を識別することにより、実験のための健全な細胞を識別します。ブリーブしているように見えるセルや、他のセルと接触しているセルは避けてください。
    注:著者の研究室では、培養中のヒト大動脈内皮細胞および一次マウス腸間膜内皮細胞が用いられる。しかし、特定の研究ニーズに関心のある他のタイプの付着細胞も同じ方法で使用できます。
  8. 分離液で隔離された動脈アーケードを洗浄する(表2)。アーケードを2mLの温め(37°C)解離液(表2に示す解離液のレシピ)を含む2mL遠心管に移し、中性プロテアーゼ(0.5mg/mL)とエラスターゼ(0.5mg/mL)を含む。10分ごとに穏やかな振盪で37 °Cで1時間インキュベートします。
  9. 中性プロテアーゼ/エラスターゼ解離液の1 mLを除去し、1mg/mLコラゲナーゼタイプ1を追加します。最終的なコラゲナーゼタイプ1濃度0.5mg/mLの動脈を含む溶液にコラゲナーゼ溶液を戻す。37 °Cで2-3分のインキュベート。
  10. 5つの等級の鉗子を使用して、すぐに新鮮な、冷やされた解離液の750 μLの滴を含む35のmmの直径のペトリ皿にアーケードを動かす。さらに、2本の20G注射針を用いて組織を解離し、酵素的に消化された動脈から内皮細胞を機械的に解放する。
  11. 9"使い捨てパスツールガラスピペを使用して、ガラスピペを使用して新しい1.5 mL遠心管に細胞を移す前に、セル溶液を10xトリビュートします。
  12. 別の750 μLの解離液でペトリ皿を洗い、同じチューブに移します。ガラスピペットを用いて、さらに少なくとも10倍のピペッティングによって細胞を機械的に分散させ、内皮細胞の完全性を損なう可能性のある気泡を導入しないように注意して単一の細胞懸濁液を作成する。
  13. 内皮細胞懸濁液(約500−1,000細胞)の750 μLを、貯留真空側に最も近い半分のMPP流れ室のピースDに直接加える。内皮細胞が室温で45分から1時間の間に付着するようにします。
  14. ステップ 1.4 および 1.5 に記載されているように、および図 1に示すように、適切な順序でピースをねじ込んで MPP フロー チャンバを組み立てます。チャンバを顕微鏡段階に移し、溶液が真空吸引(〜10 mL)に達するように、すぐに浴液でチャンバーを浸透させる。その粗く、丸い表現型19、20によってアクセス可能な内皮細胞を同定する。
    注:様々な消化方法と酵素カクテルは、異なる動脈床から内皮細胞を分離するために使用されています。メカノ感受性イオンチャネルのパッチクランプ電気生理学のために内皮細胞を単離するために様々な研究者によって使用されているプロトコルの詳細については、表3を参照してください。これらの方法は、MPPフローチャンバと組み合わせて使用するのに適している可能性が高い。

3. せん断活性化メカノ感受性イオンチャネルの電気生理学的記録のためのMPPフローチャンバーへのせん断応力の制御

  1. MPPの3mm径インレット穴Aへの挿入に適したマイクロボアチューブ(内径:0.05インチ、外径0.09インチ)を装着した3ウェイルアーロックに30mLの等級シリンジシリンダーを接続して重力灌流システムをセットアップ室。
  2. 両面テープを使用して、電気生理学リグ(図2)を取り囲むファラデーケージの外側の面に、卒業したシリンダーを取り付けます。MPPチャンバーにチューブを挿入する前に、注射器とチューブをバス溶液であらかじめ充填してください(内皮細胞内のK+チャネルを内側に整流するために使用される浴液については表2を参照)。チューブをピースAのMPPフローチャンバー入り穴に挿入します。
  3. MPPフローチャンバを真空貯留で除去する溶液をあらかじめ充填してください。チャンバーへの流れを停止し、トップマークに卒業したシリンダーを補充します。溶液がチャンバ内を流れ、ストップウォッチを使用して所定のシリンジシリンダ高さでmL/sを計算することにより、手動で流量を計算します。
  4. シリンジを上げたり下げたりして流れを変え、チャンバー内でせん断し、望ましいレベルのせん断応力が見つかるまでこのプロセスを続けます。
  5. 次の式21を使用して並列チャンバ内のせん断応力を計算します。
    ○ 6μQ/h2w
    ここで、μ = 流体粘度(g/cm·s)、Q = 流量(mL/s)、平行板チャンバ幅(w = 2.2 cm)および高さ(h = 0.1 cm)。
    注:現在の重力灌流システムでは、顕微鏡ステージの上57cmのシリンジシリンダー高さ(シリンダーの上部から測定)で、流量は0.3 mL/sです。このシリンジシリンダーの高さと流量でチャンバーで計算されたせん断は0.7 dyn/cm2です。また、蠕動ポンプなどの他の灌流システムは、MPPフローチャンバへの流れを制御するために使用することができることに留意すべきである。しかしながら、これらのデバイスは、流れの下での電気生理学的測定の望ましくない乱流を追加し、影響を与える可能性があるため、ここで説明する重力灌流システムを使用することをお勧めします。
  6. 付着した細胞を含む組み立てチャンバを電気生理学リグの顕微鏡段階に移し、あらかじめ入れた浴液で満たされたチューブをピースAの穴に挿入し、同時にチャンバーを充填し、10mLのバス溶液で細胞を洗浄します。溶液がチャンバーに流れ込むように3ウェイルアーロックを回します。
  7. 所望のパッチ構成が正常に得られると、チャネル電流は室温で静電気浴中で安定させることができます。電流が安定したら、せん断を段階的に適用し、せん断応力の次のステップ増加の前に電流の増加を安定させます。
    注:著者らは、内皮細胞におけるメカノ活性化イオンチャネルを研究する際に、穿こパッチ構成で最も成功を収めた。穿止した全細胞パッチ構成を行うには、ジメチルスルホキシド(DMSO)に60mg/mLストックアンホテリシンBの5 μLを0.2μmの無菌濾過ピペット溶液の1mLに加えます。細胞付属構成でギガオームシールを生成した後、2〜5分以内に穿止された全細胞パッチが形成される。
  8. チャンバーへの流れを停止することにより、細胞へのせん断暴露を除去し、メカノ感受性チャネル電流が静電気浴で観察されるベースライン電流に戻ることを可能にする。
  9. 溶液価を変化させることによって目的のメカノ感受性イオンチャネル電流を分離する(例えば、60 mM K+をピペット溶液中の0 Ca2+を有する浴液中の60 mM K+を含む)。表2は、現在の供給源を汚染する可能性のある溶液レシピ)および/または薬理学的阻害の例を示す。

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結果

顕微鏡ステージ上のMPPフローチャンバーの異なるビューを示す複数の写真(上パネル)とMPPフローチャンバー(下パネル)の概略表現を図1に示す。回路図は、デバイス全体とフローチャンバの寸法を詳細にします。図2は、当研究室(上パネル)におけるMPP流れ室への重力灌流システムの写真を示す。また、灌流システムからの溶液のラッシュから、および溶液の真空除去の力からフローチャンバー内の細胞を分離するステップを強調することを意図したフローシステム(下部パネル)の概略表現も示す。

メカノ感受性イオンチャネルの特徴は、機械的刺激3、6、7の停止時にベースラインレベルに突然戻

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ディスカッション

血管系は常に活発な血行力にさらされ、メカノ感受性イオンチャネル3、22を活性化するが、せん断ストレス誘発メカノトランスダクションにおけるこれらのチャネルの生理的役割は、唯一の出現し始める 4,6,8.せん断応力活性化チャネルのメカノ感受性を担うメカニズムは未知のままである。ここで詳述されるプロトコルは、層せん断応力に曝露されたメカノ感受性イオンチャネルをリアルタイムで直接調査する方法について説明する。

このプロトコルの重要かつ本質的なステップは、電気生理学的ピペットがチャンバーに下げられ、流れの下で細胞にアクセスすることを可能にする狭い開口部を有する変更された平行板の流れチャンバの使用である。この装置の一般的な原理は、開口部が十分に狭い場合、生理的せん断応力(最大15dyn/cm<...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、国立心臓、肺、血液研究所(R01 HL073965、IL)および(T32 HL07829-24、ISF)によって資金提供されました。著者らはまた、私たちの最新のMPPフローチャンバーを生成するために、シカゴのイリノイ大学の科学機械ショップを認めたいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 &マイクロ;m 滅菌シリンジフィルターVWR28145-501電気生理学ピペット溶液のろ過に使用
5グレードの鉗子ファインサイエンティフィックツール1252-30消化された動脈を新鮮な溶液に移すために使用
9インチ パスツールピペットフィッシャーサイエンティフ13-678-20D消化された動脈を機械的に破壊し、新たに分離された内膜細胞を移送するために使用されます 
直径12mmのカバーガラスサークルFisher Scientifc12-545-80培養細胞や複数の処理を含む研究に使用します。カバーガラスに接着した細胞をパッチクランプ解析に使用
24 mm x 40 mm 長方形カバーガラスSigma-AldrichCLS2975224MPPフローチャンバーピースに追加するカバーガラス C (図1)
24 mm x 50 mm 長方形カバーガラスSigma-AldrichCLS2975245MPPフローチャンバーに追加するカバーガラスE (図1)
20 G シリンジ針Becton Dickinson and Co305175消化された腸間膜動脈の機械的破壊に使用するため
35 mm ペトリ皿ジェネシー・サイエンティフィック32-103消化された腸間膜動脈の機械的破壊に使用するため
アムホテリシンB 可溶化シグマ・アルドリッチA9528-50MG穿孔全細胞パッチ構成の生成に使用されます。
コラゲナーゼ、I型ワージントン生化学100 mg - LS004194中性プロテアーゼとエラスターゼの最初のカクテルに続く簡単な消化として当研究室で使用される酵素
ジメチルスルホキシド (DMSO)フィッシャー サイエンティフ67-68-5アンホテリシン B 用溶媒 穴あき全細胞パッチクランプ
エラスターゼ、凍結乾燥ワージントン 生化学25 mg - LS002290 当研究室で中性プロテアーゼ/ディスパーゼとのカクテルに使用し、内皮細胞の単離のための動脈の消化を開始する酵素です。
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid(低蒸発蓋付き)コーニング353046培養細胞を含む研究および複数の処理に使用するため
中性プロテアーゼ/ディスパーゼワージントン生化学10 mg- LS02100 50 mg - LS02104内皮細胞単離のための動脈の消化を開始するために、エラスターゼとのカクテルで私たちの研究室で使用される酵素
SylGard World Precision InstrumentsSYLG184MPPフローチャンバーピースCおよびEに長方形のカバースリップを接着するためのシリコーンエラストマー(図1)
Tygon ND 10-80チューブマイクロボアチューブAAQ04133ID:0.05インチ、OD:0.09インチ、チャンバーへの流れを管理するための入口灌流チューブ

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