ラットおよびウサギ動脈瘤モデルにおける動脈瘤灌流および親動脈の知覚の評価のための蛍光血管造影

サマリー

我々は、フルオレセイン系蛍光ビデオ血管造影(FVA)を用いて、ラットおよびウサギにおける側壁動脈瘤の動脈瘤灌流および血管透過性を効率的に評価するためのプロトコルを提示する。92.6%の肯定的な予測値によって、それは特別な装置が必要としないで、簡単だが非常に有効で経済的な方法である。

要約

脳動脈瘤治療は、完全な閉塞を達成するだけでなく、親動脈の血流を維持することに焦点を当てています。フルオレセインナトリウムとインドシアニングリーンは、それぞれ血流と血管灌流状態の観察を可能にするために使用されます。本研究の目的は、ウサギやラットにおける側壁動脈瘤の誘導後のリアルタイム血流、血管灌流状態および動脈瘤の閉塞を検証し、これらの種の手順を検証するためにFVAを適用することです。

20の側壁動脈瘤は、ドナーウサギの頚動脈に脱細胞化動脈血管パウチを縫合することによって10匹のウサギで作成された。さらに、48匹のラットに48個のマイクロ外科的側壁動脈瘤が作成された。作成後1ヶ月のフォローアップ中に親動脈/動脈瘤複合体を解剖し、FVAはウサギの耳静脈カテーテル法およびラットのフェミニル静脈カテーテル法を介して静脈静脈蛍(10%、1mL)注射を用いて行った。その後、動脈瘤を採取し、パテンシーをマクロ的に評価した。

ウサギの動脈瘤16体中14人は、完全に閉塞したルミナを有する残留親動脈灌流を示さなかったが、11(79%)であった。FVA によって検出されました。技術的な問題により、4つの動脈瘤が除外された。ラットでは、残留動脈瘤灌流は48例中25例で大視認された。灌流の大術的証拠のない23人のうち、FVAは22の動脈瘤(96%)の発生率を確認した。FVA に関連する有害事象はありませんでした。フルオレセインは容易に適用可能であり、特別な装置は必要ない。これは、ウサギとラットとの実験環境で親動脈の完全性と動脈瘤の受入/残留灌流を評価するための安全かつ非常に効果的な方法です。対照的な薬剤としてフルオレセインを使用するFVAは、動脈瘤および基礎血管の経度を制御するのに有効であり、バイパス手術にも適応することができる。

概要

完全な動脈瘤の消滅および親動脈の完全性の証拠は動脈瘤の外科において最も重要である。ドップラー超音波検査、従来の脳血管造影(DSA)、コンピュータ断層撮影血管造影(CTA)または磁気共鳴血管造影(MRA)1^{など、親動脈の動脈の痛みと動脈瘤閉塞を確認するためのいくつかのオプションがあります。2.}しかし、これらは多くの場合、実験室の設定では利用できない高価で時間のかかる方法です。さらに、それらは放射線被曝などの関連する副作用を持っているか、動きのアーティファクトを避けるために実験動物の追加の固定の必要性を持っている可能性があります。

新しい血管内デバイスの数が増えるにつれて、このようなデバイスの前臨床試験が連続して必要とされています。しかし、これらの研究はしばしば死後分析(例えば、マクロ病理学および専門学)に依存し、動的灌流に関する情報を欠いている。さらに、研究者にとっては、実験的な外科的処置の間に即時かつ信頼性の高い情報を得ることが重要である。蛍光血管造影は、費用対効果が高く、視覚化技術1、3、4を行いやすいです。

そのように、indocyanine緑(ICG)ビデオ血管造影は、しばしば臨床神経外科的処置で使用され、広範囲に研究されている5、6.フルオレセインビデオ血管造影(FVA)は、人間の視野の波長範囲内にある蛍光信号を作成する追加の利点を持つ代替技術であり、したがって、拡張スペクトル赤外線カメラなしで肉眼で見ることができます^7.フルオレセインビデオ血管造影は、臨床脳血管外科であまり使用され、実験設定でのFVAに関する報告は1、4が不足している。

この報告書の目的は、ラットおよびウサギ前臨床脳血管研究におけるFVAの適用の実現可能性と範囲を実証することです。

プロトコル

げっ歯類は動物介護施設に収容され、実験はスイスのベルン大学動物福祉委員会(BE 108/16)および(BE65/16)によって検討され、承認されました。すべての動物は、食べ物と水への無料アクセスと標準的な実験室の食事で維持されました。すべての動物実験は、3R(置換、削減、改良)を慎重に検討して行われました。10匹の女性ニュージーランド白ウサギと48匹のオスのウィスターラットが含まれていた。ARRIVEのガイドラインは厳密^に8に従いました。

注:ドナーウサギの頸動脈に脱細胞性動脈容器袋を縫合することにより、10匹のウサギで20個の側壁動脈瘤が作成された。さらに、48のマイクロ外科的側壁動脈瘤は、4、9の前に説明したように48匹のラットで作成された。画像化手順および顕微鏡解析は、動脈瘤作成の4週間後に行った。

1. フルオレセインビデオ血管造影に必要な材料の調製

1. 青いバンドパスフィルタ(「材料の表」を参照)をテーピングして懐中電灯を修正します。トーチは青色光のみを放出する必要があります。ろ過されていない光の漏れを避けるために黒いテープを使用してください。
2. カメラ(顕微鏡に取り付けられたものなど)に緑色のバンドパスフィルター(材料の表を参照)を装備し、発光フィルタとして機能します。緑色の光だけが通過できるはずです。

2. 職場・資料の準備

1. 消毒液でワークスペースを消毒します。
2. 汚染を防ぐために生殖不能のドレープでテーブルをカバーする。
3. 手術には滅菌器具を使用してください。

3. 手術のための動物の準備

1. 動物の体重を量る。
2. 麻酔を誘発し、体重に応じて用量を調整します。
   1. ウサギの場合は、バランスのとれた麻酔を開始します。注射中に片手で目をシールドし、恐ろしい反応を減らします。動物を鎮静するのに役立つシートでケージをカバーします。
   2. 注射前に4%のイソファランと96%の酸素を持つガス室でラットを麻酔する。
3. 麻酔の深さを監視します。動物が眠っていることを確認するために、彼らのつま先の間にピンチ。
   1. ウサギを背中に置き直す。彼らは反応してはいけません。
   2. ラットの場合は、尾をつまみ、反応が観察されないようにします。
4. 乾燥を防ぐためにげっ歯類の目に歯類の目に歯色を適用します。飲み込む可能性を避けるために、ネズミの舌を引き出します。
5. 麻酔の保存から始めましょう。
   1. ウサギの場合は、カテーテル化(22GシールドIVカテーテル、射出口付き、材料の表を参照)耳静脈。バランスのとれた麻酔を維持します。3 ウェイ ストップコックを使用して、複数の同時注射を有効にします。
   2. ラットの場合は、塩酸ケタミン50mg/kg、塩酸メデトミジンを経頭に注入してください。手術中に有毒なつま先のピンチで麻酔を監視します。反応の場合は、追加の麻酔薬を投与する。
6. 動物を上の位置でボードにテープを貼り、切開位置を密接に剃ります。ベータ消毒剤で領域を消毒します。
   1. ウサギの場合は、首、特にステルノクレイドマストイドの筋肉の周りを消毒する。
   2. ラットの場合は、膀胱から大腸を横断する領域を消毒する。
7. 手術中にマスクを通して酸素を投与し、加熱パッドで体温を維持します。

4. 動脈の調製

1. 最良の結果を出すには、周囲の組織9、10から選択した血管を徹底的に解剖する。
   1. ラットの場合、尾静脈を同定する(より侵襲性が低く、好ましくは生存動物に用いられる)か、フルオレセイン注射用の大腿静脈を解剖する4、11。
      注:ウサギの場合、耳静脈はすでに麻酔に使用されているので、フロレセイン注射のために血管のさらなる解剖は必要ありません。
2. 選択した容器の下に白いパッドを置き、周囲の組織とのコントラストを高める。
3. 解剖された動脈の顕微鏡に取付けられたカメラに焦点を合わせます。

5. フルオレスチンビデオ血管造影

1. フルオレセインナトリウム(100mg/mL、材料の表を参照)で満たされた5 mLシリンジをアルミニウム箔で覆い、光の暴露から保護します。ライトを消し(可能な限り)、フルオレスチンナトリウムを静脈内に注入します。光漂白を防ぐために暗闇の下で注入します。
   1. ウサギの場合は、3ウェイストップコックを通して0.3mL/kgのフルオレセインナトリウムをカテーテル化された耳静脈に注入します。
   2. ラットの場合は、カテーテルまたは25G針を介して大腿静脈に0.4 mL/kgフルオレセインナトリウムを注入する。
2. 針またはカテーテルを0.5 mLの生理食液で洗い流し、すべての染料が注入されることを確認します。
3. 変更された懐中電灯で外科分野を照らす。
4. 修正されたカメラで撮影を開始します。血流は注射後数秒で見えるはずです(図1)。
   注:ここでは、フレームレート= 50フレーム/秒、焦点距離= 70 mm、およびF3.4を使用しました。

6. マクロ分析

1. 動脈瘤および親動脈複合体を切除し、親動脈をマイクロハサミで開くことによって経度マクロを評価し、親動脈の内気および動脈瘤のオリフィスを評価する(図1、2)9を参照してください。 動脈瘤のサイズを測定します。動脈瘤親動脈複合体は、さらなる分析(例えば、ヒストロジー)のために保存することができる。

結果

手術中に心拍数と血圧をモニターした。平均心拍数はウサギで193/分、ラットで196/分であった。ウサギの体重は3.05-4.18kg、ラットの体重は335〜690gであった。

10匹中8匹のウサギでFVAを行うことができました(図1)。2匹のウサギの4つの動脈瘤検査は、技術的な問題のためにカメラで記録されませんでした。ラットのFVAに関する技術的な問題は報告されなかった。しかし、大腿静脈を穿刺するのが困難なため、FVAは1匹のラットでは行うことができませんでした。

8匹のウサギの16の動脈瘤のうち、2つの動脈瘤は親動脈の持続的な灌流を示した(表1参照)が、FVAは残留灌流を有する5症例を同定した。14匹のウサギ動脈瘤は、残留灌流マクロを示さなかったが、11(79%)であったその後、FVA を使用して検出されました。残留灌流は48匹中25匹(表1)でマクロ的に観察され、他の23匹のラットは残留灌流のマク...

ディスカッション

FVAはげっ歯類の容器を調べる有望で複雑な方法であり、市販の装置および市販の装置と行うことができる。FVAは容器が最初に適切な解剖を必要とするように容器の完全性の術中の評価が必要であるあらゆる外科の間に実施することができる。

著者らは、感染症、虚血およびコンパートメント^症候群12などの不注意な事象のリスクが低いため、動脈注射に対する静脈注射を好んだ。静脈内注射は、信頼性の高い、空間的に制限された、高度に濃縮された染色を可能にし、小さな色素投与量13、14^を必要とする。さらに、静脈注射はフルオラセイン14、15の迅速なクリアランスを可能にする。別の方法は、選択した動脈に直接造影剤を注入することです。この方法は、研究者が血液とフルオラセインで外科場を汚染するのを防ぎたかったので、これらの実験では使用されなか...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
うさぎ用
アルミホイ
ル アニマルシェーバー
ブラックテープ
ブルーフィルター	Thorlabs MF475-35
ボディ ウォームプレート
カメラ	ソニー NEX-5R
カテーテル	22G血管固定
解薬
フルオレセインナトリウム	フルオレセインフォーレ10%
グラスプレート
グリーン	フィルターThorlabsMF539-43
パッド
輸液ポンプ	パフューザーセキュラ
ケタミン塩酸塩			任意のジェネリック製品
ニードル	25G
酸素
リンガーの溶液
滅菌シート
手術器具			マイクロ鉗子、マイクロハサミ、鈍い手術ハサミ
手術用顕微鏡	OPMI、カールツァイスAG、オーバーコッヘン、ドイツ
注射器 2ml、5ml、50ml
テープ
三方活栓
トーチライト
キシラジン			任意のジェネリック製品
<強い>ラット用
アルミホイル
動物シェーバー
ブラックテープ
ブルー	フィルターThorlabsMF475-35
ボディウォームプレート
カメラ	ソニーNEX-5R
ディスインフィクター
フルオレセインナトリウム	フルオレセインフォーレ10%
グリーン	フィルターThorlabs MF539-43
禁パッド
イソフルラン
ケタミン塩酸塩			任意のジェネリック製品
デトミジン塩酸塩			任意のジェネリック製品
ニードル	25G
酸素
プレート
リンガーズソリューション
滅菌シート
手術器具			マイクロ鉗子、マイクロハサミ、鈍い手術用ハサミ
手術顕微鏡	OPMI、カールツァイスAG、オーバーコッヘン、ドイツ
シリンジ2ml、5ml
テープ
トーチライト