オートトレーナーを用いてマウスの熟練した予感を評価する

サマリー

トレーニングが運動能力に与える影響を評価する方法は有用なツールです。残念ながら、ほとんどの行動評価は労働集約的で高価な場合があります。ここでは、マウスの先入観(リーチツー把握)スキルを評価するロボット的な方法について述べる。

要約

我々は、ナイーブマウスを新しい予感(到達到達)タスクに導入する方法について説明する。マウスは、マウスがケージから手を伸ばし、食物ペレットを取り出すことを可能にする正面スロットを持つケージに単独で収容されています。最小限の食物制限は、マウスがスロットから食物検索を行うことを奨励するために採用されています。マウスが食べ物のスロットに来て関連付け始めると、ペレットは手動で引き離され、足の伸びと発散を刺激し、前部スロットを通してペレットを把握し、取り出します。マウスがスロットに到着するとペレットに到達し始めると、目的のペレットを正常に把握して取り出す速度を測定することによって行動アッセイを行うことができます。その後、マウスが把握するための食品ペレットを提供するプロセスと、成功した試行と到達と把握の試行の記録の両方を自動化するオートトレーナーに導入されます。これにより、最小限の労力で複数のマウスの到達データを収集し、必要に応じて実験分析に使用することができます。

概要

運動能力の前・後の損傷を実験的にテストする方法と、運動トレーニングのタイミング、量、タイプを調節する方法は、翻訳研究にとって重要です。過去10年間にわたり、マウスは、遺伝子操作の付随的な容易さのために、運動学習の前および後の傷害のメカニズムを解明する人気のモデルシステムとなっている。しかし、マウスの行動アッセイは、他の哺乳動物(特にラット)のアッセイと同じ方法で最適化されていません。また、マウスとラットの挙動には、異なる方法で2種の訓練を強く示唆する重要な違い^{がある1,2.}

熟練した先入観的な動きは、手/足を使用して食べ物を口に入れたり、物体を操作したり、道具を使ったりします。確かに、日常生活の中で様々な物体をつかむことは上肢の基本的な機能であり、食べ手の多い行為は、多くの哺乳類が使用する予感の一形態です。遺伝的、生理学的、および解剖学的変化の多くは、先入観的スキル獲得を支えており、^{フィールド3}で十分に定義されている。前臨床所見を臨床結果に翻訳する場合、効率的で再現性のある関連する検査が必要です。げっ歯類とヒトの到達に関する研究は、妊娠行動がヒトと動物で類似していることを示^{している4.}したがって、これらの類似点は、先入観検査が、ヒト疾患の障害および治療と同様に運動学習を調査するための翻訳モデルとして役立つことを示唆している。したがって、マウスの妊娠を評価することは、健康と疾患状態の両方を研究する翻訳研究の強力なツールを提供することができます^4.

残念ながら、マウスの予感タスクは、小規模な実験室の設定であっても、手間と時間がかかる可能性があります。この問題を軽減するために、ここでは、先入観タスクの自動化されたバージョンについて説明します。説明されたタスクでは、マウスのホームケージ前部スロットを通して片足を伸ばし、延長された足を陽化し、食物ペレットの報酬をつかみ、ペレットをケージ内部に引き戻して消費する必要があります。結果のデータは、成功または失敗の前駆として表示されます。この自動化はデータを正常に記録し、研究者がタスクに従事する必要がある負担と時間を削減します。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、ジョンズホプキンス大学のACUC(動物のケアと使用委員会)によって承認されています.

1. マウスケージの使用準備

1. 図 1 に示すように、各ケージの前端のベースから幅 0.8 cm、高さ 7 cm の寸法でスロット開口部を作成します。このスロットは、動物が到達する開口部として機能します。
   注:オートトレーナーは、ほとんどの動物研究用品ベンダーが提供する標準的なマウスケージ寸法(図1に示すように)で使用するために設計されました。さらに、オートトレーナーは他のケージタイプを容易にサポートする。
2. 各ケージ内に、スロットに隣接するプラットフォームを追加して、マウスが立って提示されたペレットに到達できるようにします。プラットフォームがケージのゴミの床の上に位置していることを確認します, 高さ約3 cm.スーパーグルーを貼り付け、約10cm x 15cmの金属シートで覆ったペトリ皿を使用しますが、マウスが手を伸ばすのに十分な大きさの平らな面があれば十分です。
3. ケージの前面の中央を通して垂直ノッチを作成し、横0.8センチメートル、高さ7cmで、マウスがケージから足に手を伸ばします。
4. 薄い金属板(約2mmの厚さ)から、ケージゲートを5cm x 10cmの長方形に切り、動物が届く均一な開口部として機能します。
   注:マウスは、開口部のサイズを変更するプラスチックケージを噛むことがあります。テープを使用してテスト中に、メタリックケージゲートがケージのスロットの開口部の上に置かれると、マウスはこの0.8 cmスロットを通って到達し、ケージ間のスロットの有効な幅を維持します。
5. マウスがケージからゴミが排出されないようにテストされていない場合は、各ケージのスロットをテープで覆います。

2. 到達運動にマウスを導入する

1. 各マウスの開始ウェイトを記録し、その値の 85% を計算して目標の重みを見つけ、結果が小さい場合は 20 g まで切り上げます。彼らにそれらを持参し、この目標重量を維持するための供給体制を与えます。
   1. 各マウスに最初の日に2.5gのペレットを与え、24時間後に体重の変化に注意してください。
      注:マウスを1日1回計量し、1日あたり0.25-1gの体重減少を期待する。
   2. 徐々に体重減少(1日あたり0.8g未満)を誘発し、結果として得られる目標体重を維持するために、この最初の変化と各マウスの体重の継続的な変化に基づいて、必要に応じて各マウスの毎日のフィードを変更します。効果を発揮するために1日あたり3〜6 500 mgのペレット(1.5〜3.0 g)の間で変化します。
      注:マウスは、プロトコル全体を通じて目標体重を維持するために、この食事療法に残ります。
2. マウスが目標体重に達したら、補足的な食品ペレットのゲートスロットに来るという概念に各マウスを紹介します。スロットの真正面に45mgのペレットを置き、各マウスがそれを取り出せるようにして、トレーニングセッションを開始します。ほとんどのマウスは、1〜2日以内にこの摂食配置に取るでしょう。
3. マウスが開いたスロットを餌付けと関連付けたら、口ではなく足で手を伸ばすように促します。
   注:これは最も複雑なステップで、1~2日を取り、誤ってマウスに逆効果の行動を植え付けるのはとても簡単です。詳細およびアドバイスについては、ディスカッションセクションを参照してください。
   1. ピンセットのペアを使用して、マウスが以前にペレットを取得したのと同じ位置にペレットを保持します。マウスがペレットに噛み付き始めると、約半分のセンチメートル離れて、ペレットが口の手の届かないところに出るようにします。
      注: 目標の重みでマウスが手の届かないペレットを取得しようとします。マウスがスロットを通して足を伸ばすたびに、ペレットを食べさせることによって、その動作を強化します。一部のマウスは、食べ物を伸ばす際に片方の足を優先して、もう一方の足の方を好むことがある。
   2. 実験には役立たないが、左足と右足のどちらが好ましいかを記録する。これにより、行動アッセイにおける全体的な成功率が高くなる可能性があります。または、各マウスを同じ足で強制的に到達させることで、変数を削除します。
      注:マウスが好みの足を使用する場合、より良い結果が得られます。
   3. 各マウスがペレットを食べることで足を伸ばすように、口と舌でペレットを取り出そうとする試みに応じてペレットを差し控えることによって、その行動をさらに強化する。マウスは2~3日にわたってこの取り決めに従い始める。
   4. ケージゲートの外縁からわずか1cm以下に45mgのペレットを置き、ペレットの左端または右端のポイント(調査者からケージスロットの右または左のいずれであっても)を配置することにより、所望の足到達動作の導入を確定するのパース)は、それぞれケージゲートのスロットの端からまっすぐ伸びるラインに接しています。マウスがペレットを取り出すことを許可し、ペレットを取り除き、マウスが足の延長以外の方法で試みる必要がある場合は、その消費を防ぎます。
      注:マウスが一貫して足を伸ばしてつかむ際に、提供されたペレットに触れることができる場合は、以下に説明するオートトレーナーと関連する行動アッセイを使用してテストする準備が整います。素朴な紹介から準備までの時間は、マウスによって異なります。理解するのに 2 週間以上かかるストラグラーがある場合は、データ セットから除外する必要があります。

3. オートトレーナーの使用

注: オートトレーナーのハードウェア、ソフトウェア、および物理的なアクションの詳細については、図 1-3および「ディスカッション」セクションを参照してください。

1. トレーニング セッションの準備をします。
   1. 餌ペレットセンサーを校正します。LabVIEWインターフェイスの[実行]矢印をクリックし、ペレットの有無にかかわらずベイトペレットセンサーが読み取り中のことに注意してください。[停止]ボタンをクリックしてこのテストの実行を停止し、ベイト ペレット センサー ターゲットをこれら 2 つの読み取り値の間の値に変更します (図 3と表 2)。ほとんどの照明条件は、1と4の間の読書を提供します。
   2. 変更したマウスケージをオートトレーナーの上に置きます(図2)。ケージゲート(図1)を貼り付け、手動手順のようにペレットをスロットの端に合わせます。
2. LabVIEWインターフェイスを使用して、マウスのトレーニングセッションを実行します。
   1. トレーニングセッションに関するデータを記録するために必要な情報を入力します (図 3および表 2)。
      1. [マウス ID]フィールドをクリックし、コンピュータのキーボードを使用して各トレーニング セッションのファイル名を入力します。
      2. [ルーチン中に分配する合計ペレット]フィールドをクリックして、1 回の実験に分配されるペレットの数 (通常は 20 ~ 30) を制御します。これを行うには、上下矢印をクリックするか、コンピュータのキーボードを使用して番号を入力します。
      3. 指定されたペレットがダイビングボードから取り外された後に、[ペレット番号の後に一時停止]フィールドをクリックして、5sの一時停止を設定します。これを行うには、上下矢印をクリックするか、コンピュータのキーボードを使用して番号を入力します。
      4. [長さの一時停止]フィールドをクリックして、ペレットがダイビング ボードから取り外された時点と、新しいペレットが分配されるまでの間に一時停止を設定します。これを行うには、上下矢印をクリックするか、コンピュータのキーボードを使用して番号を入力します。
         注: 通常は 1 s が適切な一時停止時間です。各ペレットを分配した後にマウスが不安な場合は、[長さの一時停止]フィールドを使用して一時停止の長さを 5 s に増やすことをお勧めします。
      5. ペレットが [到達距離]フィールドに配置される距離を手動で記録します。これを行うには、上下矢印をクリックするか、コンピュータのキーボードを使用して番号を入力します。
         注:アクセラレーションと時間配列のサイズはデバッグ目的で公開され、無視される場合があります。
      6. [ログを含めるフォルダ]フィールドをクリックして、収集したデータを保存するファイルの場所を選択します。
      7. 情報フィールドに入力したら、[実行]ボタンをクリックしてトレーニング セッションを開始します。オートトレーナーは、個々のペレットを分配し、ペレットの総数が分配されるまで漏斗を通って落ちるかどうかを追跡し、最後のペレットはマウスによって取り出されるか、または落とされた。この時点でプログラムは自動的に停止します。必要に応じて、[停止]ボタンをクリックして途中で停止することもできます。
   2. ソフトウェアをセットアップしたら、テストするマウスのホームケージを台座に置き、マウスが実際に必要な新しい到達動作を試みることを学んだかどうかを測定できるように、マウスを観察します。[実行]ボタンをクリックした後、マウスがスロットとその新しい、見慣れない環境を調べることができます。
      注:到達の概念にマウスを導入する場合と同様に、一部のマウスは他のマウスよりも準拠していると予想されます。概念を把握したマウスは、5-10分以内に到達しようとし、オートトレーナーの動きを提示されたペレットに関連付けるべきです。

結果

一般に、各トレーニング セッションは約 20 ~ 30 回のトライアルで構成され、ユーザーが自動トレーナーによって自動的に実行され、セッションとマウスごとに 1 つのログ ファイルに保存されることをお勧めします。各トライアルは、2~5回の一時停止で、直後に連続して実行できます。オートトレーナーで訓練されたマウスは、10回のトレーニングセッションでスキルが向上します。

オートトレーナーの有用性を手動トレーニング(ゴールドスタンダードと考えられる)と比較するために、100~140歳の成人男性C57bl/6マウスを手動で、オートトレーナーを使用してトレーニングを行いました。すべての動物の取り扱いと使用は、ジョンズ・ホプキンス大学動物ケア・使用委員会の承認を得て行われました。オートトレーナーで訓練を受けたマウスは、先入観タスクを学び、運動能力の明らかな増加を示す(図4)。このスキルの増加は、動物がオー...

ディスカッション

当社のオートトレーナーは、前肢のリーチツー把握(プリエンション)を自動化された方法で評価します。このエンドポイントを達成するために、ペレットの配置、ペレットサイズ、トレーニング基準など、マウスの先入観タスク用に設計されたパラメータの多くは、数年にわたって繰り返され、以前の^{プロトコル2、5から適応されています。、6}.ここでの進歩は、家庭用ケージハウジングを可能にするロボットを使用したタスクの自動化です。ホームケージハウジングは、マウスが落ち着いて、より少ない不安でタスクを実行することができます。非ホームケージトレーニングは、増加した時間と減少した精度7、8、9につながる可能性のあるストレスの増加に関連付けられています。ここでは、手動ホームケージ^{トレーニング5、...}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ABSフィラメント	カスタム3Dプリント	N / A	は、ペレットホルダー、フレーム、アーム、漏斗ABS
シート	McMaster-Carr	8586K581	3/8 "厚さに利用;プラットフォームコンポーネント、位置決めスタンドガイドとベース
Adruinoミニ	Adruino	A000087	ナノバージョンにも互換性があり、他の同様のマイクロコントローラ
トップ調整可能高さに使用されますポジショニングスタンド	マクマスター・カー	9967T43	35ポンド 耐荷重
透明アクリル丸管	マクマスター・カー	8532K14	ID 3/8インチ
低炭素 鋼線	McMaster-Carr	8855K14	0.148" 直径
ペレットディスペンサー	ラファイエット 機器: 神経科学	80209-45	45 (45 mg の交換可能なペレット サイズ ホイールとオプションのスタンド
フォトインタラプター ブレイクアウト ボード付き)	SparkFun	BOB-09322 ROHS	シャープGP1A57HRJ00F
反射オブジェクトセンサー	用に設計されています フェアチャイルドセミコンダクター	QRD1113	フォトトランジスタ出力
サーボモーター	SparkFun	S8213	汎用メタルギア (マイクロサイズ)
透過型フォトインタラプタ	シャープ	GP1A57HRJ00F	ギャップ: 10 mm、スリット: 1.8 mm