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方法論記事

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

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⸱

DOI:

10.3791/59795

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2019年7月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

この記事について

サマリー

本稿では、インビトロキナーゼアッセイ、RAF共活性化アッセイ、および相補的なスプリットルシフェラーゼアッセイを含む、RAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けるための実用的かつ実行可能な方法のセットを提示した。

要約

急速に加速した線維全腫(RAF)ファミリーキナーゼは細胞生物学において中心的な役割を果たし、その機能不全は癌および発達障害につながる。疾患関連のRAF変異体の特徴付けは、これらの疾患を治療するための適切な治療戦略を選択するのに役立ちます。最近の研究では、RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、これは二層化によって厳しく規制されている。ここでは、触媒およびアロステリック活性とRAFファミリーキナーゼとその変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を決定するための実用的かつ実行可能な方法のセットを構築した。まず、バッファー内の洗剤濃度を低減し、緩やかなクイックウォッシュ手順を利用し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合を採用して、RAFダイマーの解離を防ぐことで、古典的なインビトロキナーゼアッセイを修正しました。浄化。これにより、構成的に活性なRAF変異体の触媒活性を適切に測定することができる。第二に、N末端切り捨てられたRAFタンパク質を用いてキナーゼ死死性RAF変異体のアロステリック活性を評価する新規RAF共活性化アッセイを開発し、現在のプロトコルにおける活性Rasの要件を排除し、より高いレベルを達成した。感度。最後に、我々は、従来の共免疫沈殿アッセイと比較して、より信頼性が高く、敏感である様々なRAF変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を定量的に測定するために、ユニークな相補的な分割ルシフェラーゼアッセイを生成しました。要約すると、これらの方法には、(1) ユーザーフレンドリーな利点があります。(2)高度な機器なしで効果的に行うことができる。(3) 費用対効果が高い。(4)高感度で再現性が高い。

概要

RAFファミリーキナーゼは、RAS/RAF/MEK/ERKシグナル伝達カスケードの重要な構成要素であり、RASからのシグナルを伝達してミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MEK)1、2、3、4を活性化します。キナーゼのこのファミリーは、細胞の増殖、生存および分化に重要な役割を果たし、その変化は多くの疾患、特に癌5、6、7、8を誘発する。近年、ゲノムシーケンシングは、RAS/RAF/MEK/ERKカスケード9、10、11のシグナル伝達において異なる特性を示す多くの疾患関連RAF変異体を同定した。RAF変異体の慎重な特徴付けは、RAF変異体がRAS/RAF/MEK/ERKカスケードの信号出力を変化する方法の分子メカニズムを理解するのに役立ち、最終的には様々なRAF変異体駆動疾患を治療するための適切なアプローチを選択する。

RAFファミリーキナーゼは、CRAF、BRAF、およびARAFの3つのメンバーを含み、同様の分子構造を有するが、下流シグナル伝達1、2、3、4を活性化する能力が異なる。これらのパラログの中で、BRAFは、その構成的にリン酸化されたNtA(N -t erminal acidic)モチーフ12、13、14、ARAFが最も低いのに対して、最も高い活性を有する。その非正規APEモチーフ15から生じる活動.これは、疾患におけるRAFパラログの異なる突然変異周波数を説明するかもしれません: BRAF>CRAF>ARAF.さらに、同じRAFパラログ内で、異なる部位の突然変異が異なる方法で下流シグナリングを引き起こす可能性があり、これはRAFファミリーキナーゼの調節に複雑さの別の層を追加します。最近の研究は、すべてのRAFキナーゼが触媒およびアロステリック活性の両方を持っていることを実証しています13,14,16,17,18.構成的にアクティブなRAF変異体は、MEKをリン酸化することによって下流シグナリングを直接オンにするのに対し、キナーゼ死んだRAF変異体は、左右のダイマライゼーションを通じて野生型の変異体を転移させ、MEK-ERKシグナリング16を活性化することができます。 、19、20.ダイマーアフィニティ/安定性は、キナーゼ死んだRAF変異体のアロステリック活性を決定するだけでなく、構成的に活性なRAF変異体15、21の触媒活性に影響を与える重要なパラメータです。22.ダイマー親和性/安定性の高いキナーゼ死血RAF変異体は、内因性野生型AFを直接15をトランス活性化することができ、中間ダイマー親和性/安定性を有するものは、活性Rasまたは機能する野生型RAF分子の上昇レベル13,15,20,21,23.同様に、構成的に活性なRAF変異体は、ダイマー依存的な方法でMEKをリン酸化し、弱いRAFダイマー15を破壊する免疫沈殿時にインビトロでの触媒活性を失う。 21、22。ダイマーアフィニティ/安定性はまた、それらの阻害剤に対するRAF変異体の感受性を決定し、そしてRAF阻害剤24の耐性に正に相関する。したがって、疾患関連のRAF変異体を特徴付けるためには、触媒およびアロステリック活性、およびダイマー親和性/安定性を測定する必要がある。

近年、当研究室等では、RAFファミリーキナーゼとその変異体を特徴付ける様々な方法を開発しています。当研究室や他者の経験によると、以下の3つのアッセイは、疾患関連のRAF変異体を定義する上で有利であると考えています:(1)構成的に触媒活性を容易に検出できるインビトロキナーゼアッセイアクティブRAF変異体15;(2)キナーゼ死存RAF変異体13、15、21、22、23のアロステリック活性を測定するための信頼性が高く便利な方法であるRAF共活性化アッセイ25;(3)従来の共免疫沈殿アッセイとは対照的に、RAF変異体の相対的な薄暗い親和性/安定性を測定する上ではるかに高い感度を有し、かつ高度な装置なしで行うことができる無料のスプリットルシフェラーゼアッセイSPR(Surface PラスモンRエソナンス)分析15、22などの定量分析方法とは対照的である。 これら3つのアッセイを組み合わせることで、疾患関連のRAF変異体が下流シグナル伝達をどのように変化させるかを容易に理解し、このRAF変異によって引き起こされる疾患を治療するための適切な治療戦略を利用することができます。

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プロトコル

RAF変異体の触媒活性を測定するためのインビトロキナーゼアッセイ

  1. ギブソンアセンブリまたは従来の分子クローニング法を用いて、C終産でFLAG(DYKDDK)タグを用いてRAF変異体(図1A)をコードするベクターを構築する。
    1. FLAGタグと変異をPCRによるRAFコード配列に導入し、ギブソンアセンブリまたはT4 DNAライゲーションを使用してpCDNA3.1(+)ベクターに配列全体を挿入し、製造プロトコルに従います。PCR反応には以下の条件を使用してください: (1) 95 °C, 2 分;(2) 95 °C, 30 s;(3) 59 °C, 30 s;(4) 68 °C、3分;(5) 20サイクル(2~4);。(6)4°Cホールド。
      注:クローニング用PCRプライマー:5-AAATTAACGACTCACTATAGGCCCCCCCCCCCCCC-3および5-CAGCGGGTッタACGCGCCCTCTA-3。
    2. RAF 変異型コーディング シーケンスの上流に GST コード シーケンスを挿入し、ステップ 1.1.1 で説明したのと同じ方法を使用して、GST 融合 RAF 変異体をエンコードするベクトルを生成します。
    3. トランスフェクションの前にDNAシーケンシングによってすべてのベクターを検証します。
  2. 5 x 105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレート中のプレート293T細胞/ウェルトランスフェクションの前日。細胞密度が2日目に80〜90%の合流点に達すると、トランスフェクション試薬(材料表)の製造プロトコルに従って、STEP 1.1からステップ1.1からFLAGタグ付きRAFキナーゼまたはその変異体をコードするベクターでトランスフェクトする。
  3. トランスフェクション後24時間培養培地を交換してください。
  4. トランスフェクション後48時間培養培地を吸引し、400 μL/ウェルのリシスバッファーを追加します(25 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl, 1 mM エチレンディアミンテトラセチン酸 (EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補味し、氷上の細胞を溶解する。
    注:溶解バッファー中のNP-40の濃度は、インビトロで適度なダイマー親和性/安定性を有するRAF変異体の触媒活性を検出するために重要である。リシスバッファーに高濃度の洗剤または強い洗剤が入ると、RAFダイマーが壊れ、RAFキナーゼまたはその変異体の触媒活性が殺される可能性があります。
  5. 細胞を1.5mLチューブに移し、4°Cで10分間12,000xgでスピンダウンして細胞の破片を枯渇させます。
  6. クリーンな全細胞のサンプル1サンプルにつき300μLを1.5mLチューブに移し、抗FLAGアフィニティビーズのサンプル1個につき20μLを加え、1時間冷たい部屋(4°C)で回転させます。また、以下に説明するように免疫ブロットによるRAF変異体の発現および活性(ホスホ-ERK1/2)を検出するために、クリーンな全細胞リサートの試料当たり40μLを取り除く。
  7. 抗FLAGビーズをライシスバッファーで一度洗浄し、キナーゼ反応バッファー(20 mM HEPES、10 mM MgCl2、0.5 mM Na3VO 4、0.5 mM DTT、pH 7.2)を加え、20 μLのキナーゼ反応混合物(MEK1(K97A)および10μMの2μGを加える。アクション バッファ)をサンプルごと使用します。
    注:ビーズ洗浄は穏やかに迅速に完了する必要があり、残留バッファーはキナーゼ反応混合物を追加する前に完全に吸引する必要があり、このステップでのすべての操作は、コールドルームで4°Cで行われるべきです。
  8. 室温(25°C)でキナーゼ反応を10分間インキュベートし、インキュベーション中に1分おきに指でキナーゼ反応を含むチューブを反転させます。
  9. 5x SDSサンプルバッファの5 μLを追加します(375 mMトリス·HCl、9%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、50%グリセロール、0.03%ブロモフェノールブルー)を試料1枚につきキナーゼ反応を停止し、90°Cで5分間加熱します。
  10. 0.1%SDSで9〜12%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)でサンプルを実行し、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、免疫ブロットによるサンプル中のホスホ-MEKおよびRAF変異体のレベルを検出します。
    注:ホスホ-MEKはまた、γ32 P-ATP組み込みを用いて定量することができる。簡単に言えば、10 μM γ32P-ATP をキナーゼ反応バッファーに添加し、次いで標準的な自動無線撮影、蛍光化、または液体シンチレーションカウント技術を用いてPAGE分離後にリン酸化MEKの量を定量化する。適切。

2. キナーゼ死んだRAF変異体のアロステリック活性を評価するためのRAF共活性化アッセイ

  1. RAF受信機(非リン酸化性NtAモチーフ、AAFFを持つCRAFキナーゼドメイン)またはキナーゼ死死RAF活性化剤(リン酸化模倣NtAモチーフ、SSDD、DDEEまたはDGEEを含むRAFキナーゼドメイン)をコードするベクターを構築する(図1A)手順 1.1 で説明します。
  2. RAF受信機とキナーゼ死死RAF活性化剤またはステップ1.2および1.3に記載されているタンパク質の1つをコードする単一のベクターの両方をコードする2つのベクターを持つトランスフェクト293T細胞。
  3. トランスフェクション後24時間で培養培地を交換し、48時間で293Tトランスフェクタントを収穫し、ステップ1.4および1.5に記載されているように細胞全体のリサテスを調製する。
  4. 清潔な全細胞リサートを室温(25°C)で素早く5x SDSサンプルバッファーで混合し、90°Cで5分間沸騰させます。
  5. 0.1%SDSで9〜12%PAGEで沸騰した全細胞リザートサンプルを実行し、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ホスホ-ERK1/2のレベルを検出し、免疫ブロットによってタンパク質を制御します。

3. RAF変異体の相対ダイナー親和性/安定性を測定するための無料のスプリットルシフェラーゼアッセイ

  1. ステップ1.1に記載されているように、NlucのN終点(ホタルルシフェラーゼのN終点、aa2-416)またはC-終点(ホタルルシフェラーゼのC-終点、aa398-550)に融合したFLAGタグ付きRAF変異体をコードするベクターを構築する。
  2. ステップ1.2で説明するように、異なるNluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体をコードするベクターのペアを持つトランスフェクト293T細胞。
  3. トランスフェクション後24時間で、無色媒体(すなわち、フェノール赤色のないDMEM)を用いてウェル当たり2x105の細胞密度でクリスタルブラック画像プレートに293T細胞トランスフェクトを再プレートする。
  4. 24時間後、D-ルシフェリン(0.2mg/mL)を293T細胞トランスフェクタントに添加し、30分間インキュベートし、マルチ検出システム(材料表)を用いてルシフェラーゼシグナルを測定する。
  5. ルシフェラーゼ信号を測定した後、培地を吸引し、293Tトランスフェクタントをライシスバッファーで吸引し、ステップ1.4および1.5に記載されているように細胞全体のリサテスを調作する。
  6. 0.1%SDSで9〜12%PAGEで全細胞リサートサンプルを実行し、ステップ2.5に記載されている抗FLAG免疫ブロットによるNluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体の発現レベルを検出する。293TトランスフェクタントにおけるNluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体の相対発現レベルは、それらの免疫ブロットからの画像Jを用いて定量される。
  7. Nluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体の発現レベルに従って293T細胞トランスフェクタントのルシフェラーゼ信号を正規化する。簡単に言えば、これは、ステップ3.6からNluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体の相対発現レベルによって生ルシフェラーゼ信号を分割することによって達成される。

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結果

RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、疾患関連変異体が異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達をオンにすることを可能にする 、18.構成的に活性なRAF変異体は基質を直接リン酸化し、キナーゼ死死性RAF変異体は野生型の変異体を通じてその機能を果たす。図1Bに示すように、構成的に活性なRAF変異体(例えば、調節性脊椎(R-spine)変異体(BRAF(L505M)、CRAF(DDEE/L397M)、およびARAF(DGEE/L358M)13、23、25

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ディスカッション

本稿では,インビトロキナーゼアッセイ,RAF共活性化アッセイ,無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを含む疾患関連RAF変異体を特徴付けるための3つの方法を紹介した.RAFキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有するので、様々なRAF変異体は、2つの異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達を活性化することができます。18.構成的に活性なRAF変異体は、下流のエフェクターMEKを直接リン酸化し、キナーゼ死んだRAF変異体は野生型の変異体を通じて下流シグナル伝達を引き起こす。しかし、構成的に活性なRAF変異体とキナーゼ死んだRAF変異体の両方は、その機能15、16、17、19、20、およびダイマーを満たすためにダイマ化を必要とします...

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開示事項

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

謝辞

著者らは、元ジミンの支援のための毛深い細胞白血病フェローシップを認めたい。この研究は、アジアファンドがん研究(AFCR2017/2019-JH)、デューク-NUSクーブリッジファンディングアワード(デューク-NUS-KBrFA/2018/0014)、NCCRFブリッジ助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(N研究助成金(AM/TP011/2018)

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗リン酸化ERK1/2細胞シグナル伝達技術4370
抗リン酸化MEK1/2細胞シグナル伝達技術9154
抗ERK1/2ABクローンA0229
抗MEK1/2細胞シグナル伝達技術9124
抗FLAG(マウス)Sigma-AldrichF3165
抗HANovus BiologicalsMAB6875
anti-FLAG(Rabbit)Cell Signaling Technologies14793
anti-&β;-actinSigma-AldrichA2228
anti-FLAG beads(M2)Sigma-AldrichA4596
HRP-conjugated anti-mouse IgGJackson Laboratories115-035-003
HRP-conjugatedanti-Rabbit IgGJackson Laboratories111-035-144
pcDNA3.1(+)In vitrogenV79020
Gibson Assembly Cloning キットニューイングランド バイオラボE5510
T4 DNA リガーゼニューイングランド バイオラボM0202
リポフェクタミン 2000Invitrogen11668019
Fugene 6Roche11 814 443 001
DMEM w/o フェノール レッドInvitrogen21063-029
D-ルシフェリン GoldBioLUCK-100
6xhisタグ付きMEK1(K97A) 私たちの以前の研究で準備されました NA.参考文献15.
GloMax-マルチ検出システム。プロメガE7041

参考文献

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