インビボ免疫蛍光局在化(IVIL)法は、生体内腫瘍標的化とexvivo免疫染色の組み合わせを用いて、生体内の腫瘍学的目的のための抗体および抗体コンジュゲートの生体内生分解を調べるために使用することができる。メソッド。
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この記事について
サマリー
要約
モノクローナル抗体(mAbs)は、がんの検出、診断、治療において重要なツールです。それらは、腫瘍形成におけるタンパク質の役割を解明するために使用され、腫瘍の検出および特徴付けを可能にする癌バイオマーカーに向けられ、免疫エフェクター細胞を活性化するためにmAbsまたは抗体薬物コンジュゲートとして癌治療に使用することができ、阻害するシグナル伝達経路、または特定の抗原を運ぶ細胞を直接殺す。新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の臨床的進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍微小環境の複雑さおよび不均一性によって損なわれる。したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、生体腫瘍微小環境との抗体ベースコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。ここでは、生体内生理的および病理学的条件における抗体ベースの治療薬および診断の相互作用を研究するための新しいアプローチとして、生体内免疫蛍光局所化(IVIL)について説明する。この技術では、治療または診断抗原特異的抗体を生体内に静脈内注射し、単離腫瘍中の二次抗体を用いて局所的なex vivoを投与する。したがって、IVILは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生体分布を反映する。2つのIVILアプリケーションは、乳癌の分子イメージングのための抗体ベースの造影剤の生体分布およびアクセシビリティを評価する記載されている。このプロトコルは、将来のユーザーが独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を適応することを可能にします。
概要
モノクローナル抗体(mAb)は、B細胞によって分泌され、免疫系の主要な機能を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの大きな糖タンパク質(約150 kDa)であり、生物学的機能を同定し阻害するか、または破壊、細菌またはウイルス病原体、および癌細胞1上の異常なタンパク質発現を認識することができる。抗体は、その特異的なエピトープからフェムトモラー濃度まで非常に高い親和性を有し、生物医学2において非常に有望なツールを作ることができる。ミルシュタインとケーラー(1984年にノーベル賞を受賞)によるハイブリドーマ技術の開発により、mAbsの生産が可能になりました3.その後、ヒトmAbsはファージディスプレイ技術またはトランスジェニックマウス株を用いて生成され、新規研究ツールおよび治療薬としての使用に革命を起こし、4,5.
がんは世界的な健康問題であり、予防、検出、治療のための新しいアプローチの必要性を生み出す主な死因6である。現在までに、mAbsは腫瘍形成における遺伝子およびそのタンパク質の役割の駆除を可能にし、癌バイオマーカーに対して指示された場合、患者の層形成のための腫瘍検出およ....
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プロトコル
ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の実験室動物ケア(APLAC)に関する機関行政委員会によって承認されています。
乳癌発症のトランスジェニックマウスモデル
- 先に進む前に触診またはキャリパー測定を介して適切な腫瘍増殖のための所望の癌モデルからマウスを観察する。
注:ここでは、乳癌発症のトランスジェニックマウスモデル(FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J)(MMTV-PyMT)を用いた。これらの動物は、各乳腺20の生後6~12週の間に自発的に浸潤性乳癌を発症する。正常な乳腺は、トランスジーン陰性、年齢に一致したリターメイトからのコントロールとして使用された。
2. 特異的および非特異的抗体剤の静脈内注射
- 脱塩カラム(例えば、PD-10)上のウサギの抗マウスB7-H3およびウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を精製し、製造元の指示に従って防腐剤および貯蔵バッファーを除去する。
注:一部の抗体は、タンパク質Aアガロースビーズベースのプロトコル21でさらなる精製を必要とする場合があります。 - 個々のマイクロ遠心管における各抗体共重ゲートの33μgのアリコト用量。
注:投与剤の投与量は、用途に応じて変化し、抗体....
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結果
IVIL法は、B7-H3-ICGおよびIso-ICGの生体内生体分布および組織相互作用を調べるためにここで使用され、薬剤が生体動物に静脈内注射した後、96時間の標的組織と相互作用し、その後組織が一旦収穫され、排生免疫染色中に一次抗体として作用する。IVIL法はまた、B7-H3マーカーに対する組織の標準的なex vivo IF染色と比較した。正常なマウス乳腺はB7-H3マーカーを発現せず、ex vivoで確認され、標準的なIF染色、および他の受動機構を介して抗体を蓄積せず、したがって、B7-H3-ICGまたはIso-ICGの蓄積は検出されなかった、代表的な負の結果 (図 1、一番上の行) の。しかし、マウス乳腫瘍は血管系と上皮の両方でB7-H3を発現し(標準的なIF染色で確認)、IVILは血管系に強く蓄積し、部分的に余分に増殖させたB7-H3-ICG剤を強調することができた。血管系から癌細胞自体に結合するが、腫瘍全体のB7-H3マーカーの均一な分布と比較して不均一な方法で、
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ディスカッション
この方法には、いくつかの重要な手順があり、実装を成功させるために潜在的な変更が必要です。まず、抗体/抗体コンジュゲート静脈内注射の投与量およびタイミングは、特定の用途に合わせて調整されなければならない。一般に、抗体コンジュゲートが一般的に使用される方法、すなわち、治療用抗体または抗体ベースの造影剤の一致する用量と一致する用量を使用すべきである。また、標的組織の採取時期も慎重に検討する必要があります。抗体および抗体コンジュゲートは、標準的な薬剤および造影剤よりも長い循環時間を持っていますが、これらは非常に可変であり、所望の用途に最適化されるべきですが、少なくとも24時間の循環時間27を許可することをお勧めします。.第2に、標的組織採取の間に、血液プール19から自由に循環する抗体を除去する心内灌流技術を実施することが必要でありよい。B7-H3-ICGの腫瘍分布を見ていると、十分に長い循環時間(96時間)と薬剤の血管局在化のために不要であることが判明した。しかし、IVIL法のnetrin-1の適用については、心灌流は、ネトリン-1の内皮発現及びその.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
ディスカッションと機器の使用に関して、アンドリュー・オルソン博士(スタンフォード神経科学顕微鏡サービス)に感謝します。ユルゲン・K・ウィルマン博士の指導に感謝します。本研究は、NIH R21EB022214助成金(KEW)、NIH R25CA118681研修助成(KEW)、およびNIH K99EB023279(KEW)によって支援されました。スタンフォード神経科学顕微鏡検査サービスはNIH NS069375によってサポートされました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 動物モデル | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | ジャクソン研究所 | 002374 | 女性、4-6週齢 |
| 動物ハンドリング用品 | |||
| 27G カテーテル | VisualSonics | Vevo MicroMarker 尾静脈アクセスカニューレ挿入キット | |
| をご注文くださいアルコールワイプフィ | ッシャーサイエンティフィ | 22-246073 | |
| ガーゼスポンジ(4 "x 4" 16プライ) | カーディナルヘルス | 2913 | |
| ヒートランプモー | ガンビルサイエンティフィック | HL0100 | |
| イソフルラン | ヘンリーシャイン動物の健康 | 29404 | |
| 眼科軟膏 | フィッシャー科学NC0490117 | ||
| 外科テープ | 3M | 1530-1 | |
| Tissueコレクション | |||
| 使い捨てベースモールド | フィッシャーサイエンティフィック | 22-363-556 | |
| 最適な切断温度(OCT)ミディア | フィッシャーサイエンティフィック | 23-730-571 | |
| 外科用ロンドン鉗子 | ファインサイエンスツール | 11080-02 | |
| 用ハサミ | ファインサイエンスツール | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488ヤギ抗ラットIgG | ライフ | テクノロジーA-11006 | |
| AlexaFluor-546 ヤギ抗ウサギ IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 ヤギ抗ヒト IgG | Life Technologies | A11014 | |
| ヒト IgG アイソタイプコントロール | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| ヒト化抗ネトリン-1抗体 | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| クリアネイルポーランド | 地元のドラッグストア | ||
| インドシアニン グリーン - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS エステル | |
| マウンティング 媒体 | サーモフィッシャー サイエンティフィック | TA-006-FM | |
| ノーマル ヤギ 血清 | フィッシャー サイエンティフィ | ICN19135680 | |
| パラホルムアルデヒド (PFA) | フィッシャー サイエンティフィ | ||
| 滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 14190250 | |
| トリトン-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| <ストロング>サプライ/ | |||
| 接着ガラススライド | VWR | 48311-703 | |
| 脱塩カラム | フィッシャーサイエンティフィ | 45-000-148 | |
| ガラスカバースリップ | フィッシャー科学 | 12-544G | |
| 疎水性障壁ペン | テッドペラ | 22311 | |
| マイクロ遠心分離管フィ | ッシャーサイエンティフィック | 05-402-25 | |
| スライド染色トレイ | |||
| Software | |||
| FIJI | LOCI、UW-Madison。 | バージョン4.0 | https://fiji.sc/ |
参考文献
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.
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再版と許可
