タンパク質間相互作用(PPI)は、生物学的効果の生成の基礎です。多くは病気と密接に関連しており、薬物作用の重要な標的を提供するものとしてますます認識されています1。これらのタンパク質相互作用を研究するために多くの技術が利用可能であり、その一部はこのコレクションまたは他のJoVE記事で説明されています。各手法には独自のメリットと制限があります2;ただし、これらの相互作用はさまざまな細胞内コンパートメントで発生し、親和性が広範囲(ピコモルからミリモル)であり、本質的に一過性にすぎないため、すべてのPPIに対して1つの完璧な技術はありません。
in vitroキナーゼアッセイは、キナーゼがリン酸基をATPから基質に転移するという機能的役割をどのように果たすかを分析するために使用できるPPIを研究するための間接的なアプローチです。Cuiら3は 、この技術をトリプシン消化および質量分析と組み合わせて使用して、ヒトセントロメアタンパク質F(CENP-F)の断片上のサイクリン依存性キナーゼ-1特異的リン酸化部位を特定します。新規リン酸化部位の機能検証のために、著者らは、リン酸化変異を含むCENP-Fと核輸送受容体であるカリオフェリンαを組み合わせた結合アッセイを使用し、交差検証を提供します。
共免疫沈降は、抗体を使用して特定の標的とそれに関連する他のタンパク質分子を捕捉するPPIを研究するために広く使用されている方法です。Zhengら4は 、この手法を適用して、酸素調節されたαサブユニットとARNT3としても知られる構成的に発現するβサブユニットで構成されるヘテロ二量体として機能する低酸素誘導因子(HIF)を研究しています。彼らのプロトコルに関する興味深い点は、細胞が低酸素条件下で誘導および回収され、核画分からの内因性タンパク質が共免疫沈降されることです。著者らが指摘しているように、この方法の1つの制限は、PPIが直接的か間接的かを判断できないことです。
Nolanら5は、タンパク質ホモオリゴマー化の検出に適用できる蛍光顕微鏡画像「数と明るさ」(N&B)における分子の数とその明るさを測定するためのプロトコルを提示しています 。この技術は、in vitro と in vivo の両方で使用でき、二量体化薬の添加前後の mVenus 標識FKBP12F36Vのオリゴマー状態を正確に定量するために適用されています。著者らは、関連技術と比較したこの技術の利点について議論し、漂白と長期的な強度変動を補正することの重要性を強調しています。デジタル検出器を搭載した共焦点顕微鏡は定量を容易にしますが、アナログ検出器でもN&Bが可能です。
マルチタンパク質複合体のアフィニティー精製は、その成分の同定とともに、そのような複合タンパク質の機能を理解するために広く使用されている技術です。Luzarowskiらによるプロトコル6では、この手法は、トランスジェニックシロイヌナズナ植物細胞におけるPPIとタンパク質代謝産物相互作用(PMI)の両方を同時に特徴付けることにより、さらに一歩進んでいます。タグ付きヌクレオシド二リン酸キナーゼは、タンデムアフィニティー精製(TAP)タグ手順によってアフィニティー精製され、捕捉されたタンパク質と小分子はその後質量分析によって同定されます。このプロトコルの独自性は、疎水性リガンドと親水性リガンドの両方を同定できることです。これは、PPIとPMIの両方を研究し、細胞の植え付けにアフィニティー精製を適用するスリーインワン抽出プロトコルです。
近接ライゲーションアッセイには、細胞と組織内の内因性タンパク質間の相互作用を検出するために使用されるという利点があります。Karchugina と Chernoff7 は、この手法を使用して、ヒトシュワン細胞 (HSC) およびヒト胚性腎臓細胞 (HEK-293) におけるキナーゼ MST1 および MST2 のヘテロ二量体の存在を示しています。彼らの記事には、このテクニックをうまく実行する方法に関するいくつかの貴重なヒントが含まれています。相互作用するタンパク質ごとに異なる種で産生された適切な一次抗体が必要であり、抗体の特異性と感度が鍵となるため、抗体濃度を微調整する必要があります。著者らは、ガラスチャンバースライドが複数の細胞株や抗体の組み合わせの分析に便利であることがわかったが、顕微鏡検査中の共焦点距離の違いを避けるために、ウェル間のシリコーンインサートをすべて取り除くことが不可欠であると指摘した。さらに、結果を検証するために、さまざまなポジティブコントロールとネガティブコントロールが使用されます。
核磁気共鳴 (NMR) 分光法は、タンパク質相互作用およびタンパク質とリガンドの相互作用に関する原子レベルの分解能と定量的情報を提供するために使用できる高感度アッセイです。今回、Winkelaarら8は 、この技術を用いて、デスモソーム(細胞間接着に関与する細胞構造)に見られる2つのタンパク質(ビメンチンとエンボプラキン)の相互作用を研究し、通常、強い機械的ストレスを受ける組織に見られる。著者らは、 15N 標識ビメンチン ドメインを使用し、異核単一量子相関 (HSQC) を使用して 2D スペクトルを取得します。エンボプラキンからのドメインの存在下では、タンパク質相互作用と一致して、広範な線の広がりとピークの消失が観察されます。著者らはさらに、変異誘発とマイクロスケール熱泳動(MST)を使用して相互作用の基礎を調査し、定量的な情報を提供します。
小角X線散乱(SAXS)は、溶液中の高分子のサイズとコンフォメーションに関する情報を提供し、大きなマルチドメイン複合体またはタンパク質複合体の分子エンベロープを低分解能で生成するために使用できる技術です。Mrozowich et al.9 によるプロトコルでは、この技術を使用して、ニドゲン-1 とラミニン γ-1 の複合体の低分解能構造を生成します。この手法は、NMR分光法では大きすぎ、X線結晶学では結晶化が困難な複数の球状ドメインを持つ大きなタンパク質のPPIを研究する研究者にとって興味深いかもしれません。
人間の相互作用10には約650,000の相互作用があると推定されており、この分野の研究者は今後しばらく忙しく過ごすのに十分です。顕微鏡、質量分析、機械学習の進歩によって可能になった最近の開発は、将来的にこの分野で大きな洞察を提供する可能性のある空間プロテオミクスです11。この PPI メソッドのコレクションは、研究者が潜在的な落とし穴を回避しながらこの重要な課題に取り組むのに役立ちます。