方法論記事

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

DOI：

10.3791/59823

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2019年6月16日

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1Center for iPS cell research and application (CiRA)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト多能性幹細胞(PSC)から機能的造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を導出することは、血液学的および悪性疾患を治療するための自家移植の難解な目標であった。ヘモゲン内皮(HE)は、転写因子によって機能的なHSPCを産生したり、強牢な方法でリンパ球を誘導したりするのに適したプラットフォームです。しかし、HEを導出する現在の方法は、高価であるか、または収率で可変である。このプロトコルでは、フィーダーおよびゼノフリーの定義された条件で4日以内にHEを導出する費用対効果の高い正確な方法を確立した。その結果、HEは内皮から造血に転移し、CD34+CD45+クロノジェニック造血前駆術を産生した。機能的なHSPCを生成するための当社のプラットフォームの潜在的な能力は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広いアプリケーションを持つことになります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血液学的および免疫学的疾患に対する新しい治療法の開発は、疾患モデリングのための堅牢なプラットフォームの欠如と、患者由来の自家造血幹細胞(HSC)による高スループット薬物スクリーニングの欠如によって妨げられている。多能性幹細胞(PSC)。誘導(i)PSC技術のブレークスルーは、患者の細胞から疾患をモデル化するという約束を果たしているが、患者iPSCからの機能的HSCの確立は困難であった。ヒトPSCからHSCを導き出すために、胚パターンおよび転写プログラムの適切な誘導は、キー1、2、3、4、5、6、 7,8.ヘマトポエティック開発の最近の進歩は、HSC開発9におけるヘモゲン内皮(HE)の役割を実証している。HEはPSCから誘導することができ、遺伝子導入10、11、12、13などの下流介入に適しています。HEをプラットフォームとして使用し、5つの転写因子(ERG、HOXA5、HOXA9、LCOR、RUNX1)の組み合わせにより、長期的に生着し、複数の系統に分化する機能的HSCを誘導することに成功しました14。しかし、PSCからのHEの可変的かつ非効率的な生成は、市販の生産と臨床使用のための血行細胞の大規模な誘導と共に細胞の系統的な操作と分析を妨げている。

ここでは、フィーダーとゼノフリーの定義条件で4日間でHEを導出する費用対効果が高く正確な方法について説明する。この方法では、iMarix-511上のスフェロイド形成および自発的な再平坦化は、HE細胞の効率的な誘導に不可欠であるPSCコロニーの一貫した密度を保証する。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 試薬

  1. 細胞株(ヒトPSC):胚性幹細胞(ESC)またはiPSC線409B2および201B7(317-9))およびCBA11のいずれかを得る。
  2. 試薬の調製
    1. PSCめっき媒体:10 μM Y-27632とPSCメンテナンス培地を混合し、4°Cで保存します。
    2. PSCスフェロイドタイリング培地:使用直前にPSCメンテナンス培地を625-1,250 ng/mLヒト組換えラミニンラミニン-511 E8フラグメント(LM511-E8)と混合します。
      注:LM511-E8は、メディア15で混合することができる。フルレングスラミニン-511のような他のマトリックスは、事前にコーティングする必要があり、そうしたとしても、彼らは分化プロセス中に付着した中皮オルガノイドを維持しません。
    3. 0日目分化培地:2 μM CHIR99021、80 ng/mL骨形態形成タンパク質4(BMP4)および80 ng/mL血管内皮成長因子(VEGF)とメソダーマル基底培地を混合する。
    4. 2日目分化培地:1 μM SB431542、80 ng/mL VEGFおよび100 ng/mL幹細胞因子(SCF)とヘモジェニック基底培地を混合する。
    5. カルシウムやマグネシウムを使用せずにリン酸緩衝食塩水(PBS)を調べてください(材料の表を参照)。
    6. 1 mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)バッファー:PBSの500 mLに0.5 M EDTAの1 mLを追加します。
    7. EHT培地:50 ng/mL SCF、20 ng/mLトロンボポエチン(TPO)、50 ng/mL Fms関連チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、20 ng/mLインターロイキン-6/インターレウキン-6/インターレウキン-α(IL-6)を混合インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン、L-グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB.
    8. FACSバッファー:2%の胎児子牛血清および1 mM EDTAとPBSを混合する。
    9. 磁気分離バッファーを準備する(「材料の表」を参照)。
    10. メチルセルロースベースのメディアを準備する(「材料の表」を参照)。

2. PSCコロニー形成

  1. 0.5 μg cm-2 LM511-E8コーティングされた6ウェルプレートを37°Cのインキュベーターで5%CO2で70~80%の合流に成長させます。
  2. PSC解離(日 -4)
    1. 培地を吸引し、PBSで2回細胞を洗浄します。解離液で細胞をすすいで下します。37°Cで15分間インキュベートします(この時間では細胞は乾燥しません)。
    2. PSC維持培地で細胞を懸濁し、懸濁液を適宜大きさのチューブに移し、200×gで3分間遠心分離する。
  3. PSC懸濁液を48,000~70,000セルcm-2(細胞株に応じて)の密度でマイクロ加工プラスチック容器にプレートし、5%CO2で37°Cインキュベーターで一晩インキュベートします。
    注:96ウェルのマイクロ製造プラスチック容器に100 μLウェル-1の細胞懸濁液を推奨します。通常、20,000細胞を96ウェルプレートに-1でシードし、約100のスフェロイドを得ます。
  4. PSC スフェロイドをタイリングするLM511-E8(日 -3)
    1. P1000マイクロピペッターを使用して穏やかにピペッティングすることにより、15 mL円錐形チューブにPSCスフェロイドを収集し、重力によって沈殿するために2分間室温に立つようにスフェロイドを残します。上清を吸引する。
    2. スフェロイドめっき媒体で懸濁液を、4-スフェロイドcm-2の密度で非コーティングされた6ウェル培養プレートに懸濁液を分配し、37°Cインキュベーターで培養し、3日間5%CO2で培養する。

3. ヘモジェニック誘導(0日目)

  1. 培地を吸引し、5%O2及び5%CO2(低酸素インキュベーター)で37°CインキュベーターにDay0分化培地および培養剤を加加える。
  2. Day0分化培地で2日間培養した後、培地を吸引し、次いで低酸素化インキュベーターにDay2分化培地および培養を加える。

4. ヘモゲン内皮の分離(4日目)

  1. 2日後、培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄する。解離液で細胞をすすいで下します。37°Cインキュベーターで30分間5%CO2でインキュベートします。
  2. 1 mM EDTAで細胞を静かに懸濁して単一細胞レベルに解離し、懸濁液を50mL円錐管に移し、200 x gで細胞を遠心分離し、上清を3分間吸引し、300μLの磁気分離で細胞ペレットを懸濁する。バッファー。
  3. CD34+マイクロビーズと穏やかなピペを100 μLを追加します。室温で30分間インキュベートします。100 μL CD34+ビーズあたり最大2,000万個の細胞を使用できます。
  4. 40 μmセルストレーナーを通して懸濁液をろ過します。
  5. 磁気セパレータを使用してCD34+セルを分離します。

5. 内皮から平行性への転移(EHT)

  1. フィブロネクチンコーティング
    1. PBSで1mg/mLフィブロネクチンを希釈して5μg/mLフィブロネクチンコーティング溶液の必要量を調製します。
    2. コーティング溶液の0.5 mLを24ウェル培養プレートの各ウェルに分配します。プレートを室温で30分間インキュベートします。
  2. 選別されたCD34+細胞を200xgで3分間遠心分離し、EHT培地の1mLで細胞ペレットを再ステースする。
  3. セル カウンタを使用して、実行可能なセル密度を決定します。EHT培地を添加して細胞密度を200,000セルmL-1に調整します。
  4. フィブロネクチンコーティングからコーティング溶液を吸引し、廃棄します。各フィブロネクチンコーティングによくCD34+セル懸濁液の0.5 mLを分配します。
  5. 低酸素インキュベーターで1週間インキュベートします。

6. 血化細胞のフローサイトメトリー解析

  1. フローティング セル コレクション:培養培地を15mL円錐管に移します。上清を吸引する場合は、200 x gで3分間遠心分離します。
  2. 付着細胞コレクション
    1. 0.5 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。
    2. 溶解溶液で細胞をすすいで、余剰液体を吸引します。
    3. プレートを37°Cインキュベーターで5分間インキュベートします。
    4. FACS バッファーの 1 mL でセルを再中断します。
  3. 浮動細胞と付着細胞を混ぜます。
  4. 細胞を200 x gで3分間遠心分離し、上清を吸引する。FACSバッファの50 μLで再中断します。暗闇の中で室温で1時間抗CD34および抗CD45抗体で細胞をインキュベートする。
  5. PBSで2回、遠心分離機を200 x gで3分間洗浄し、0.5 μg/mL 4'、6-ダイアミド-2-フェニリンドールでFACSバッファーの0.5 mLで再中断します。
  6. フローサイトメーターでCD34およびCD45発現を測定します。

7. 血化細胞のコロニー形成ユニット(CFU)アッセイ

  1. 血化細胞コレクション:培養物から15mL円錐管に培地を移します。PBSで2回、井戸をゆっくりとすすいで下ろします。
  2. 細胞を200 x gで3分間遠心分離し、上清を吸引する。EHT培地の1mLで再中断する。セル カウンタを使用してセル番号を決定します。
  3. 抗生物質を添加したメチルセルロース系培体3mLに10,000細胞相当の懸濁量を加え、16Gまたは18G注射器で5回よく混ぜます。
  4. メチルセルロースベースのメディアサスペンション全体を6ウェルプレートの各ウェルに分配します。
  5. しっとりとした状態を保ちながら、2週間CO2を5%で37°Cインキュベーターでインキュベートします。料理の邪魔をしないでください。コロニーはモーションセンシティブです。
  6. 2週間後、顕微鏡下でコロニーを数えます。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PSCコロニーの形成の概略図を図1Aに示す。PSCスフェロイドは、1日の微細加工プラスチック容器上に形成される。代表的な結果として、20,000 409B2細胞は、微細加工プラスチック容器の96ウェル当たり処理することができましたが、他の細胞株は、より高密度(マイクロ製造プラスチック容器の96ウェル当たり30,000-40,000セル)を必要とする可能性があります。これらの球は、LM511-E8の存在下で培養皿にめっきすると、ほぼ2次元の培養物に自発的に平坦化される。

ヘモゲン誘導の概略図を図1Bに示す。PSCコロニーが直径750μmに成長すると、中皮オルガノイドを誘導するために培地が順次変化する。PSCコロニーは、4日目までの順次培地変化により中間筋オルガノイドとの分化中に徐々に日当たりの良い側アップ構造となる。4日目に、血原性内皮は磁気ソートによって中皮オルガノイドから指定され、その後EHT培地でフィブロネクチンにメッキされる。5-1000万CD34 +CD45-細胞は100万PSCを含むスフェロイドから期待される(図1C)。

細胞が内皮から血統細胞に形態的に変化することが観察される(補足ビデオ1)。7日目の造血カクテルによる刺激時の造血前駆細胞の代表的な位相対照画像を図2Aに示す。血化細胞コロニーが培養中に出現した。

代表的なフローサイトメトリープロットを図2Bに示す。全培養は無毛カクテルで刺激され、7日目には流量細胞メトリーによりCD34およびCD45の発現について分析する。血化前駆細胞はCD34およびCD45を発現する。

CFUアッセイは、CD34+CD45+造血前駆細胞からの顆粒球/マクロファージコロニーの生成を示した(図2C)。推定コロニー数は10,000セルあたり38 CFU-G/M (図 2D)

figure-results-1
図1:前記項PSCコロニーの概略図及びその後の無毛内皮による平隔化分化。(A) PSCコロニーを形成する概略プロセス。PSCはPSCの維持媒体のLM511-E8コーティングされた6ウェル版で維持される。4日目に、細胞を剥離し、解離溶液を使用して単一細胞レベルに解離し、その後、PSCメンテナンス培地の微細加工プラスチック容器にY-27632を用いてメッキし、一晩培養してスフェロイドを形成する。3日目に、スフェロイドはLM511-E8でPSCメンテナンス培地でメッキされ、3日間培養されます。0日目までに、スフェロイドはほぼ2次元の培養物に自発的に平坦化される。スケールバー = 200 μm. (B) 0日目に、培地をDay0分化培地に置き換え、低酸素インキュベーターで培養する。分化の2日目に、培地はDay2分化媒体に置き換えられます。血原性内皮濃縮の4日目に、CD34+細胞を磁気的に選別し、EHT培地中のフィブロネクチン被覆12ウェルプレート上で6日間培養する。(C)CD34でソートした4日目細胞のCD45及びCD34発現の代表的な流血量プロット。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:無毛性固定資産の解析(A) 7日目に造血カクテルで刺激した後の造血前駆細胞の代表的な相対照画像。スケールバー= 200 μm. (B) 7日目の造来カクテルによる刺激時のCD45およびCD34発現の代表的なフローサイトメトリープロット。(C)11日目造血前駆細胞から生成された顆粒球/マクロファージコロニーの代表的な位相対照画像。スケール バー = 500μm ( D) 10,000 セルあたりの CFU の数。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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補足ビデオ 1: EHT ビデオ.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

当社のフィーダーおよびゼノフリー定義誘導方法は、スケーラブルな方法でHE細胞を誘導するための正確で費用対効果の高いプラットフォームを提供します。従来のプロトコル10、11、12、13、14におけるヘモゲン内皮の忠実な形成は、PSCコロニー密度およびサイズの正確な制御の欠如によって妨げられている、モルフォゲン/サイトカインベースの指向分化の効率に影響を与えます。我々は、従来のプロトコルから各独立バッチにおけるヘモゲン内皮誘導の不整合を経験した。新しいプロトコルは、PSCコロニー密度とサイズの厳しい調節を可能にし、したがって、ヘモゲン内皮誘導の不整合を克服する。

我々は、スフェロイドの均一な形成を利用し、その後、合計4日間でHEを形成するためにフィーダーとゼノフリーの定義された状態を伝えた。我々は、スフェロイド形成がHE細胞の一貫した形成を保証する3つの独立した細胞株を用いて確認した。代表的な結果として、409B2細胞株は、3つの独立した実験に基づいて12.7%-23.6%CD34+細胞効率を得た。PSCスフェロイドをタイル化する重要な要因はLM511-E8です。私たちの経験では、マトリゲルやフルレングスラミニン製品などの他のマトリックスでこれを置き換えすることはお勧めしません。私たちは、中皮オルガノイドがマトリゲルから容易に切り離され、分化プロセス中に失われたことを経験しました。そして、マトリゲルまたはフルレングスラミニンのいずれも、事前コーティングなしで細胞を固定しません。

このプロトコルの潜在的な制限は、PSC を維持するために PSC メンテナンス 媒体に依存している場合です。StemFitなどの他のメディアをテストしましたが、造来誘導を危険にさらしました。おそらく細胞は、我々の短時間(4日間)誘導プロトコルで多能状態から出るのに耐性であった。他の培地でPSCを維持する場合は、PSC維持培地で細胞を適応させ、分化前にいくつかの通路を行うことをお勧めします。このプラットフォームは、細胞の系統的な操作と分析、および潜在的な臨床使用のための市販の生産と血化細胞の大規模な誘導を可能にします。このシステムの長期的な目標は、ヒト化マウスモデルにおける免疫不全疾患をモデル化し、責任ある細胞および分子機構を調査し、薬物スクリーニングを行うことです。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、彼らの技術支援に対して、有麗リーとセイコー・ベンノに感謝しています。また、渡辺晴美さん、行政支援を行ってくださったことに感謝します。本研究は、難治性疾患研究プログラム「ME.K.S.」の再生医療の実現に向けたiPS細胞研究センターネットワークの中核センターの支援を受けたものです。利用。AMED(17935423)の疾患特異的iPS細胞[M.K.S.]と科学技術振興機構(JST)イノベーションセンター[R.O.およびM.K.S.]。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィック155750.5 M EDTA
40 μmセルストレーナーCorning35234040μM細胞ストレーナー
6ウェルプレートコーニング3530466ウェルプレート
抗生物質-抗真菌剤サーモフィッシャーサイエンティフィック15240-112ペニシリン/ストレプトマイシン/アムホテリシン B
抗CD34抗体ベックマン・コールターA07776抗CD34抗体
抗CD45抗体バイオレジェンド304012抗CD45抗体
BMP4R&D Systems314-BP-010BMP4
CD34 マイクロビーズMiltenyi130-046-703CD34 マイクロビーズ
CHIR99021和光038-23101CHIR99021
エッセンシャル 6サーモフィッシャーサイエンティフィックA15165-01血行性基礎培地
エッセンシャル 8サーモフィッシャーサイエンティフィックA15169-01中胚葉基礎培地
エズスフィア SPマイクロプレート 96wellAGC4860-900SP微細加工プラスチック容器 
FCSBioseraFB-1365/500FCS
フィブロネクチンミリポアFC010-100MGフィブロネクチン
FLT-3LR&Dシステムズ308-FK-005FLT-3L
グルタマックスサーモフィッシャーサイエンティフィック35050-061L-グルタミン
IL-6 / IL-6R&α;R&Dシステムズ8954-SRIL-6 / IL-6Rα
iMatrix-511Matrixome892 001LM511-E8
ITS-XThermo Fisher Scientific51500-056インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン
MACS バッファーMiltenyi130-091-221磁気分離バッファー
Methocult 4435MethoCult™H4435 EnrichedSTEMCELL TECHNOLOGIES04435メチルセルロース系培地
mTeSR1STEMCELL TECHNOLOGIES85850PSC メンテナンス培地
PBSnacalai tesque14249-24PBS
SB431542和光031-24291SB431542
SCFR&Dシステムズ255-SC-010SCF
ステムラインII造血幹細胞増殖培地グマアルドリッチS0192-500ML造血基礎培地
TPOR&D Systems288-TPN TPO
TrypLE Expressサーモフィッシャーサイエンティフィック12604-021解離ソリューション
VEGFR&Dシステム293-VE-010VEGF
Y-27632和光253-00513Y-27632
シズ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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CD34 LM511 E8 EHT

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