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方法論記事

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

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DOI：

10.3791/59831

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2019年6月28日

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1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

この記事について

サマリー

ここに提示されるペプチドベースの小さなユニラメラ小胞の作成のためのプロトコルは、成長することができる。膜ペプチドのベシキュロ産生を容易にするために、これらの小胞は転写翻訳システムおよびペプチドコードプラスミドが装備されている。

要約

生化学反応の区分化は、合成細胞の中心的な側面である。この目的のために、ペプチドベースの反応コンパートメントは、リポソームまたは脂肪酸ベースの小胞に対する魅力的な代替手段として機能する。外部または小胞内では、ペプチドを容易に発現し、膜前駆体の合成を簡素化することができる。ここで提供されるのは、ガラスビーズからの脱水水分補給を利用した両生血球エラスチン様ポリペプチド(ELP)に基づいて、直径約200nmの小胞を作成するためのプロトコルである。また、逆温度サイクリングによる細菌ELP発現および精製のためのプロトコル、ならびに蛍光色素によるその共生機能化についても提示する。さらに、本報告では、生化学反応の非複雑な例として、ELP小胞内のRNAアプタマーdBroccoliの転写を可能にするプロトコルについて説明する。最後に、蛍光タンパク質および膜ペプチドのベシキュロ発現を可能にするプロトコルが提供され、後者の合成は小胞の増殖をもたらす。

概要

合成生細胞系の作成は、通常、2つの異なる方向からアプローチされます。トップダウン法では、細菌のゲノムは必須成分に還元され、最終的には最小限の細胞につながります。ボトムアップアプローチでは、人工細胞は分子成分または細胞サブシステムからde novoを組み立てられ、一貫した細胞様システムに機能的に統合される必要があります。

de novoアプローチでは、必要な生化学成分の区分化は、通常、リン脂質または脂肪酸1、2、3、4から作られた膜を使用して達成される。これは、「現代」細胞膜は主にリン脂質から成り、脂肪酸はプレバイオティクス膜エンクロージャ5、6のもっともらしい候補と考えられているからである。新しい膜の形成、または膜の成長を促進するために、両友病のビルディングブロックは、対応する同化プロセス4を使用して膜区画内の生産を通じて、外側7から、または理想的には提供されなければならない。 、8.

脂質合成は比較的複雑な代謝過程であるが、ペプチドは無細胞遺伝子発現反応9、10を用いて非常に容易に産生することができる。したがって、親質ペプチドによって形成されたペプチド膜は、11を成長させることができる人工細胞模倣のためのエンクロージャとして脂質膜に対する興味深い代替手段を表す。

親水性エラスチン様二重合体(ELP)は、このような膜12のビルディングブロックとして機能することができるペプチドの魅力的なクラスである。ELPの基本アミノ酸配列モチーフは(GaGVP)nであり、「a」はプロリンを除く任意のアミノ酸であり、「n」は繰り返されるモチーフの数13、14、15、16、17である。.ELPは、主にフェニルアラニンを含む疎水性ブロックと、グルタミン酸11からなる親水性ブロックを用いて作成されている。pHおよび塩濃度などの溶液パラメータに応じて、ELPは温度Ttでいわゆる逆温度遷移を示し、ペプチドは親水性から疎水性への完全に可逆的な相転移を受ける状態。ペプチドの合成は、細菌細胞抽出物「TX-TL」を用いて小胞内で容易に実施することができる。結合転写および翻訳反応に必要なすべてのコンポーネント。

TX-TLシステムは、ガラスビーズからの脱水水分補給を固体サポートとして利用してELP小胞にELPをコードするDNAテンプレートを併用して一緒にカプセル化しました。小胞の形成は、ビーズ表面11からの乾燥ペプチドの水分補給を通じて起こる。小胞形成のための他の方法22は、潜在的に低い多分散性およびより大きな小胞サイズ(例えば、電気形成、エマルジョン相移動、またはマイクロ流体ベースの方法)を示す。封入法の生存率を試験するために、フッ素性アプタマーdBroccoli23の転写を代わりに11を用いることができ、これはTX-TL系を用いた遺伝子発現よりも複雑ではない。

ベシキュロにおける膜ビルディングブロックの発現とその後の膜への組み込みにより、小胞は11に成長し始める。ELPの膜組み込みは、FRETアッセイを介して実証することができる。この目的のために、初期小胞集団の形成に使用されるELPは、FRET対を構成する等しい分株で蛍光色素と結合される。ベシキュロにおける非標識ELPの発現および膜への組み込み時に、膜内の標識されたELPが希釈され、その結果、FRET信号は11減少する。共役のための汎用性と一般的な方法として、銅触媒アジドアルキネシクロ添加が使用される。トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)-アミンなどの安定化リガンドを使用すると、反応は、共振反応に適した反応剤11の加水分解なしで生理学的pHで水溶液中で行うことができる。ペプチドを含む。

以下のプロトコルは、ELPベースのペプチドソームを成長するための製剤の詳細な説明を提示する。ガラスビーズ法を用いたペプチドおよび小胞形成の発現について説明する。さらに、ELP小胞内のタンパク質発現に対するフッ素性dBroccoliアプタマーおよび転写転写転写反応の転写を実施する方法について説明する。最後に、提供されるのは、蛍風素を有するELPの結合のための手順であり、これはFRETアッセイ11を介して小胞の成長を証明するために使用することができる。

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プロトコル

1. エラスチン様ポリペプチドの発現

  1. 1日目:ペプチド発現のためのスターター培養と供給の準備
    1. LB培地のフラスコ(4 x 2.5L)及び3LのLB培養フラスコを調修及びオートクレーブ。LB培地の1Lの場合は、1Lの超純水に25gのLB粉末を加えます。
    2. LB培地の100 mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)クロラムフェニコール溶液(EtOHでは25mg/mL)、50μLの滅菌フィルター(0.22μmフィルター)カルベニシリン溶液(50%EtOHおよび50%のEtOHおよび50%の水)でスターター培養を行います。
    3. ポリペプチド配列MGHGVGVP((GEGVP) 4(GVGVP)4(GFGVP)4(GFGVP)4(GVGVP)3を含む大腸菌株BL21(DE3)pLysSを含む予備の細菌ストックから小さな筋を追加します。(GFGVP)4GWP(EFと略記)を予め温めた100 mLスターター培養物にし、振盪インキュベーターで250rpmで16時間37°Cでインキュベートする(大腸菌株およびベクターは要求あり)。
    4. 発現培養フラスコとLB培養を一晩37°Cで予め温め、翌日に備える。
  2. 2日目:タンパク質発現
    1. 各発現培養フラスコにLB培地の750mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)クロラムフェニコールストック(EtOHでは25mg/mL)、無菌フィルター(0.22μmフィルター)カルベニシリンストック(100mg/mL)の375μLを50%、50%の水当性を添加する。
    2. 抗生物質を分配するために攪拌した後、600nm(OD 600)での光学密度測定のための基準サンプルとして培媒の2mLを取る。
    3. 発現フラスコに開始培養の7.5 mLを追加し、250rpmで37°Cで1時間インキュベートします。
    4. このステップの後、各フラスコのOD600は20分ごとにチェックされます。
    5. 光学密度が約0.8°Cに達すると、温度を16°Cに下げ、1M無菌濾過β-イソプロピルチオガラクシド(IPTG)の750μLを各発現フラスコに超純水に添加してペプチド発現を誘導する。
    6. 誘導細菌で発現フラスコを16°Cで250rpmで16°Cでインキュベートする。
  3. 3日目:発現ポリペプチドの抽出
    1. 収穫後の細胞ペレットの質量の決定を可能にするために遠心フラスコを予計する。
    2. 4,000 x gおよび4°Cで予冷した遠心分離機を用いて20分間遠心分離によって発現フラスコからすべての細菌を収穫する。
    3. 上清を注ぎ、無菌のペーパータオルに遠心ボトルをブロットします。
    4. 遠心フラスコの重量を量り、セルペレット質量を計算します。
    5. 元の細胞培養物の750 mLからペレットダウンした細胞を、ピペッティングによりリン酸緩衝生理食べ物(PBS、pH 7.4)の15mLで、遠心分離機を4°Cで20分間4,000xgで再中断する。上清を注ぎ、無菌のペーパータオルに遠心ボトルをブロットします。
    6. リゾザイム(1mg/mL)、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)、1mMベンザミジン、および0.5UのDNase Iを用いて、PBS(pH 7.4)を用いた細胞ペレット1グラム当たり2mLの緩衝液ステップに対する細胞ペレットを再ステージングする。
    7. 10s超音波処理と20sの一時停止ステップを交互に8 Wで8 Wで氷上でさらなるライシスのために細胞を超音波処理し、その後、サンプルが氷上で冷却されるべき9分間の休止が続きます。もう一度9分の超音波処理ステップを繰り返します。
    8. 核酸沈殿のための元の細胞培養の1L当たり10%(w/v)ポリエチレンアイミン(PEI)の2mLを添加する。
    9. サンプルを2mL遠心チューブに分配し、60°Cで10分間インキュベートし、その後4°Cで10分間インキュベーションを行います。
    10. 溶液を4°Cで10分間16,000xgで遠心分離し、ELPを含む上清を回収する。
  4. 逆温度サイクリングによるタンパク質精製:
    1. 上清を2のpHに調整し、ペプチドの親水性部分を疎水性に切り替え、凝集を誘導する。pHを調整するために、リン酸と水酸化ナトリウムが使用される。pHストライプは、pHレベルを決定するのに十分です。
    2. 試料の精製の収率を向上させるには、試料を60°Cに加熱し、塩化ナトリウムを2Mまで添加する。
    3. 続いて、室温(RT)で10分間16,000xgで試料を遠心分離する。
    4. 上清を破棄し、PBSでペレットを再溶解します(ただし、前のステップと比較して初期体積の半分しか使用されています)。
    5. リン酸と水酸化ナトリウムでpHを7に調整します。pHストライプは、pHを決定するのに十分に正確です。
    6. その後、サンプルを16,000 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
    7. 上清を収集し、ステップ1.4.4の最後の繰り返しでは、PBSの代わりに水のみが追加される場合を除き、合計1.4.1~1.4.6を合計3倍まで繰り返します。
    8. 吸収分光計でペプチドの濃度を測定します。280 nm で 5500/M/cm の消滅係数を使用します。
    9. ELPの濃度を700 μMに調整します。

2. ガラスビーズ法を用いたベシクル製造

  1. 遠心真空濃縮器を使用してELP溶液を1.1mMに濃縮します。
  2. 濃縮ELP溶液の200 μLを2:1クロロホルム/メタノール混合物の1,250 μLと混合し、その後に渦を混ぜます。
  3. 球状ガラスビーズ(サイズ212~300μm)を10mLの丸底フラスコに1.5g加えます。
  4. ELPとクロロホルム/メタノール混合物を含む溶液を丸底フラスコに加え、穏やかな振盪で混ぜます。
  5. フラスコをロータリーエバポレータに接続します。速度を 150 rpm に調整し、液体が室温で蒸発するまで約 4 分間-0.2 x 105 Pa (-200 mbar) に圧力を調整します。
  6. 丸い底のフラスコを少なくとも1時間デシケータに入れ、残りのクロロホルムとメタノールが蒸発することを確認します。ガラスビーズの損失を避けるために、緩く取り付けられたアルミ箔は、丸い底のフラスコ開口部の周りにラップする必要があります。
  7. 単一の実験では、ペプチド覆われたガラスビーズの100mgをPBSなどの膨潤溶液の60 μLと混合する。このサンプルを25°Cで5分間インキュベートします。
  8. ガラスビーズを堆積させるために、テーブルトップ遠心分離機でサンプルを素早く遠心分離します。
  9. 小胞を含む上清を収集するためにピペットを使用してください。

3. 大胞内のRNAアプタマーdBroccoliの転写

  1. RNaseの除染液を含むワイプでラボベンチを清掃し、RNaseフリーの作業環境を作成します。
  2. T7プロモーターとdブロッコリー配列を含むssDNA(5μM)を混合する(GAGACGCGCGGGTCCCTGAGACGGGGTCGGGTCCATTCTTCTTGTGTGTGGTGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCGCGCTTC)を含む、核不全水水で満たします。RNAPol反応バッファー[40 mMトリス-HCl(pH=7.9)、6 mMMgCl 2、1 mMジチオスレイトール(DTT)、および2mMスペルミジン)、転写反応のためのDNAテンプレートを調製する。
  3. 溶液を90°Cで5分間インキュベートし、その後30分間20°Cまでゆっくりと温度を下げます。
  4. 1 mM(5Z)-5-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-2,3-ジメチル-3,5-ジヒドロ-4H-イミダゾール-4-1(DFHBI)溶液をDMSOの5mLで1.26mgのDFHBIを溶解することにした。
  5. RNAPol反応バッファー[40 mMトリス-HCl(pH=7.9)、6mM MgCl 2、1mMジチオスレイトール(DTT)、および2mMスペルミジンを125mM KClと混合して転写反応を調製する。 15 mM MgCl2,4 mM rNTP, 10 μM DFHBI, 200 nM DNA テンプレート, 0.5 U/μL RNase抑制剤のマウス、および水。
  6. 反応が始まる直前に、4 U/μL T7ポリメラーゼを加えます。
  7. この反応ミックスをステップ2.7の膨潤液として使用し、実験期間中37°Cでインキュベートし、通常は1時間である。

4. 転写翻訳(TX-TL)反応

注:転写翻訳反応には、反応バッファーおよびDNAと同様に粗細胞抽出物が必要である。粗細胞抽出物は、Sun et al.18に記載されているように調製される。TX-TL反応の場合は、粗大腸菌抽出物の33%(v/v)、42%(v/v)反応バッファー、25%(v/v)フェノールクロロホルム精製DNAプラス添加剤を使用します。最終濃度は約9mg/mLタンパク質、50mM HEPES(pH=8)、1.5mM ATP、1.5mM GTP、0.9mM CTP、0.9mM UTP、0.2 mg/mL tRNA、26mMコエンザイムA、0.33mM NADM、0.75mM,30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13.3 mM マルトース, T7 RNA ポリメラーゼの 1 U, および 50 nM プラスミド DNA を超純水中.

  1. DNAテンプレートのフェノールクロロホルム精製
    1. LB培地5mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)カルベニシリン溶液(50%EtOHで100mg/mL、50%超純水)で6つの一晩培養を行います。
    2. pET20b(+)発現ベクターを含むDH5α大腸菌を含むあらかじめ作られた細菌ストックから小さなストリークを各予め温めた5 mLの一晩培養に加え、250rpmで16時間37°Cでインキュベートします。どのペプチド(EF)またはタンパク質(YPetまたはmVenus)が発現されるかに応じて、特異的なエンコードプラスミドが使用される。
    3. ユーザーマニュアルに記載されているミニプレップキットでプラスミドを抽出するか、Zhang et al.24によって提供されるプロトコルに従います。
    4. 精製前プラスミドDNAの100 μL(濃度は200~600ng/μLの範囲)を調製し、微小遠心管内のロチフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールの100μL(pH =7.5~8.0)と混合して、より良い相分離を可能にします。
    5. RTでチューブを6倍までゆっくりと反転させ、遠心分離機をRTで16,000 x gで5分間反転させます。
    6. チューブの上相に200μLのクロロホルムを追加し、チューブを6倍まで反転させます。
    7. RTで5分間16,000 x gでサンプルを遠心分離します。
    8. 上清を別のチューブにピプテし、エタノール沈殿用に酢酸ナトリウムの10 μLを加えます。
    9. -80 °Cコールドエタノールの1 mLを追加し、1時間-80°Cでサンプルを保存します。
    10. 4°Cで15分間16,000 x gでサンプルを遠心分離します。
    11. 上清をデカントし、-20 °Cコールド70%(v/v)エタノールの1 mLを追加します。
    12. 4 °Cで5分間16,000 x gの遠心分離機。
    13. ピペッティングで液体を取り除きます。DNAペレットの邪魔にならないように注意してください。
    14. 残りのエタノールを蒸発させるために約15分間RTでサンプルを保存します。
    15. サンプルに超純水を加え、サンプル濃度を約300nMに調整し、260nmで吸収して測定します。
  2. TX-TL反応の調製
    1. 調製した粗細胞抽出物と氷上の反応バッファーを解凍する。
    2. 60 μL反応ミックスの場合、プラスミドDNA(フェノールクロロホルム精製)を反応バッファーの37.5 μLに加え[50 mM HEPES(pH=8)]、1.5mM ATP、1.5mM GTP、0.9mM CTP、0.9 mM UTP、0.2 mM/ML tRNA、m3,0.75 mM cAMP, 68 mM フォリン酸, 1 mM スペルミジン, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, および 13.3 mM マルトース), 続いて粗細胞抽出物の 28.7 μL を添加.58.8 μLに超純水で最終容積に充填します。
    3. 反応が始まる直前に、T7 RNAポリメラーゼ溶液の1.2 μLを加え、上下にピペッティングしてサンプルを混合します。
    4. この反応ミックスをステップ2.7の腫脹溶液として使用し、実験の持続時間(通常は4〜8時間)の29°Cでインキュベートする。

5. 銅触媒アジドアルキネ・ホイスゲン・サイクロ添加によるフラオロフォアとのエラスチン様ポリペプチドの結合

  1. DMSOに20mM NHS-アジドブチル酸N-ヒドロキシスチニミドエステル溶液を調製する。
  2. PBS(8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.42 g/L Na2HPO 4、0.27 g/L K2HPO4、pH= 7.2)およびNHS-アジド(1.2 mM)と12hでインキュベートするELP溶液(600 μM)を混合し、12 hでインキュベートします。
  3. 10 kDa透析カセットにサンプルをロードし、塩と残留NHS-azideを除去するために、超純水の1Lで12時間4°Cで保存します。
  4. 活性ELP(500 μM)をアルキン結合色素(500μM)、Cy5-アルキン、またはCy3-アルキンと混合します。
  5. このサンプルを1mM TBTA(トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン)、10mM TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)-塩酸リン)と10mM CuSO4と混合し、12時間4°Cでインキュベートします。
  6. 10 kDa透析カセットにサンプルをロードし、1Lの超純水で12時間4°Cに保存し、塩と残留アルキン結合染料を除去します。
  7. これらの色素修飾ELPは、Cy3標識ELPとCy5標識ELPの1:1混合物で使用され、第2部のペプチドに類似したElPを標識する。

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結果

ベシクル生産
図1は、異なる膨潤溶液およびガラスビーズ法で調製された小胞の透過電子顕微鏡(TEM)画像を示す(Vogele etal.11も参照)。図1Aの試料については、小胞の形成を証明し、その大きさを決定するために、腫脹溶液としてPBSのみを使用した。TX-TLを膨潤液(図1B)として用いた場合、小胞も形成した。動的光散乱(DLS)測定は、ガラスビーズ法が小胞形成に影響を及ぼすことを示すために行われた。図2は、PBS(青色)にガラスビーズを含まずに調製したEF試料の測定強度自己相関曲線と、膨潤液(赤色)としてPBSを用いたガラスビーズ法で調製したEF試料を示す。サイズは、クミュラントフィット25から計算され、ガラスビーズ法なしで小胞を調製した場合、25%の多分散性...

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ディスカッション

フィルムの水分補給は、小さなユニラメラ小胞の作成のための一般的な手順です。故障の主な原因は、手順で使用される材料の誤った取り扱いです。

当初、ELPは大腸菌細胞によって産生される。ELP精製後の収率は、重要なステップの間にプロトコルがどの程度慎重に行われるかに応じて大きく異なる場合があります。これらは逆温度サイクリング(ITC)ステップと降水後のELPの再サスペンションです。精製のために、我々は、pHを酸性に変え、親水性ブロック内のグルタミン酸側鎖のプロトネーションにつながるリン酸の添加を通じてペプチドの疎水性崩壊を引き起こした。このステップの後、両方のブロックはRTで疎水性である。イオン強度を一定に保つために塩分が既に溶液中にある酸を用いることを好ましいが、塩酸などの他の酸も使用できる。ELP産生の収率を高めるために、塩は遷移温度Ttを減少させ、ELPをより疎水性にするので、コーセレーションプロセスを強化す...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

DFG TRR 235(生命の出現、プロジェクトP15)、欧州研究評議会(交付契約第694410 AEDNA)、およびTUM国際科学技術研究科(プロジェクトNo.9.05)を通じた財政支援に感謝します。.私たちは、サンプルの準備で彼女の助けをE.ファルゲンハウアーに感謝します。我々は、TX-TLシステムと有用な議論に対する彼らの助けに対して、A.デュビンとM.シュワルツ・シリングに感謝します。我々は、有益な議論のためにN.B.オランダに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2xYTMP biomedicals3012-032
3-PGASigma-AldrichP8877
5PRIME Phase Lock GelTM tubeVWR733-2478
アルキン結合 Cy3Sigma-Aldrich777331
アルキン結合 Cy5Sigma-Aldrich777358
ATPSigma-AldrichA8937
ベンザミジンカールロスCN38.2
BL21 ロゼッタ 2 大腸菌株ノバゲン71402
ブラッドフォード BSA タンパク質アッセイキットバイオ・ラッド500-0201
cAMPシグマ・アルドリッチA9501
カルベニシリンカール・ロス6344.2
クロラムフェニコールSigma-AldrichC1919
ChloramphenicolCarl Roth3886.3
ChloroformCarl Roth4432.1
CoASigma-AldrichC4282
CTPUSB14121
CuSO4Carl RothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
DMSOカール・ロスA994.1
DNase INEBM0303S
DTTSigma-AldrichD0632
エタノールCarl Roth9065.2
フォリン酸Sigma-AldrichF7878
ガラスビーズ、酸洗浄Sigma-AldrichG1277
GTPUSB16800
HEPESSigma-AldrichH6147
IPTG (β-イソプロピルチオガラクトシド)Sigma-AldrichI6758
KClCarl RothP017.1
K-グルタミン酸Sigma-AldrichG1149
LB BrothCarl RothX968.2
リゾチームSigma-AldrichL6876
メタノールCarl Roth82.2
MgCl2Carl RothKK36.3
Mg-グルタミン酸Sigma-Aldrich49605
マイクロバイオスピンクロマトグラフィーカラムBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
NHS-アジドリンカー(y-アジド酪酸オキシスクシンイミドエステル)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Carl Roth263.2
pH stripesCarl Roth549.2
Phenylmethylsulfonyl fluorideCarl Roth6367.2
Phosphate-buffered salineVWR76180-684
リン酸Sigma-AldrichW290017
ポリエチレンイミンSigma-Aldrich408727
リン酸カリウム二塩基性溶液Sigma-AldrichP8584
リン酸カリウム一塩基性溶液Sigma-AldrichP8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
RNAPol 反応バッファーNEBB9012
RNase inhibitor murineNEBM0314S
RNaseZap WipesThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcoholCarlrothA156.1
RTS Amino Acid Sampler5 Prime2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (キット)Thermo-Scientific66382
塩化ナトリウムCarl Roth9265.1
水酸化ナトリウムCarl Roth8655.1
スペルミジンSigma-Aldrich85558
滅菌ろ過 (0.22 µm filter)Carl RothXH76.1
T7 polymeraseNEBM0251S
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)Sigma-Aldrich678937
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)Sigma-AldrichC4706
Tris baseFischerBP1521
tRNA (from E. coli)Roche AppliedサイエンスMRE600
UTPUSB23160

参考文献

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
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