このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

9.6K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/59836

⸱

2019年8月9日

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

この記事について

サマリー

ここでは、4つの骨髄系統に対する臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞の免疫発食特性特性およびサイトカイン誘導分化のためのプロトコルを提示する。このプロトコルの応用には、CD34+細胞の骨髄性分化に対する骨髄疾患変異または小分子の影響に関する調査が含まれる。

要約

ヒト造血幹細胞の外生分化は造血症を研究するために広く使用されているモデルである。ここで説明するプロトコルは、4つの骨髄系統細胞に対するCD34+造血幹細胞および前駆細胞のサイトカイン誘導分化を用いる。CD34+細胞は、ヒト臍帯血から単離され、サイトカインの存在下でMS-5間質細胞と共培養される。幹細胞および前駆細胞の免疫表現型特性、および分化した骨髄系統細胞について記載されている。このプロトコルを使用して、CD34+細胞は、ミエロイド分化への影響を調べるために、小分子またはレンチウイルスでトランスベートして骨髄疾患変異を発現させ得る。

概要

造血幹細胞(HSC)の正常な分化は、すべての血球系統の生理学的レベルの維持に重要である。分化の間、成長因子およびサイトカインを含む細胞外手がかりに対する協調的な応答において、HSCは最初にリンパ浮腫電位1、2、3を有する多能性前駆体(MPP)細胞を生じる 、4 (図1)MMPは、一般的な骨髄前駆体(CMP)および系統制限されている一般的なリンパ前駆体(CLP)を生み出す。CLPは、B、T、およびナチュラルキラー細胞からなるリンパ系系統に分化する。CCMは、さらに2つの制限された前駆体集団、巨核球赤血球前駆体(MEP)、および顆粒球単球前駆体(GGP)を介して骨髄系統を生成する。MEPは巨核球と赤血球を生み出すのに対し、GGPは顆粒球と単球を生じる。CMPを介して生じるだけでなく、巨核球はまた、非正規経路5、6を介してHSCまたは初期のPMPから直接生じることが報告されている。

造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)は、表面マーカーCD34および系統特異的マーカーの欠如(Lin−)によって特徴付げられる。HSCと骨髄前駆体を区別するために一般的に使用される他の表面マーカーには、CD38、CD45RA、およびCD1232(図1)が含まれる。HPC と MMP はそれぞれ Lin-/CD34+/CD38-と Lin-/CD34+/CD38+です。骨髄性前駆体集団は、CD45RAおよびCD123の有無によって区別される。CCMはリン-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo、GGP は Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo、 MEP は Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123-.

CD34+幹および前駆細胞の総集団は、ヒト臍帯血(UCB)、骨髄、および末梢血から得ることができる。CD34+細胞はヒトUCBにおける全単核細胞(MNC)の0.02%から1.46%を構成するのに対し、その割合は骨髄で0.5%から5.3%の間で変化し、末梢血7、8、9では〜0.01%とはるかに低い。 .UCB由来CD34+細胞の増殖能力および分化電位は、骨髄または末梢血細胞1、10のそれよりも有意に高く、それによって得られる明確な利点を提供する分化中の細胞の免疫発知性および形態学的特徴付けを行うことと組み合わせて分子解析に十分な材料。

臍帯血由来CD34+HSPCの外生分化は、正常な血清症および血統病のメカニズムを調用するための広く適用されたモデルである。適切なサイトカインで培養すると、UCB CD34+ HSPCは、骨髄またはリンパ系系統11、12、13、14、15に沿って分化するように誘導することができる。,16.ここでは、ヒトUCBからのCD34+HSPCの単離および免疫表現性特性、および骨髄系統細胞への分化のためのプロトコルについて説明する。この培養システムは、骨髄の微小環境を模倣するMS-5間質細胞の存在下でのHSPCのサイトカイン誘導分化に基づいている。培養条件は、CD34+細胞の初期増殖を引き起こし、続いて4つの骨髄系統細胞、すなわち顆粒球細胞(CD66b)、単球(CD14)、巨核球(CD41)、および、および4つの骨髄系統細胞のマーカーを発現する細胞への分化を引き起こす。赤血球(CD235a)。CD34+細胞分化プロトコルの応用には、血化を調節する分子機構に関する研究、および自己再生に伴う骨髄性疾患および小分子の影響の調査およびHSPC の差別化。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

実験のためのヒト臍帯血は、フェニックスのマリコパ統合保健システム(MIHS)にインフォームドコンセントの後、健康な個人によって寄付されました。識別されなかったユニットは、MIHSとアリゾナ大学との間の材料移転契約を通じて取得されました。

1. 試薬とバッファー

注:生物学的安全キャビネット内の無菌条件下ですべての試薬およびバッファーを準備する。

  1. 滅菌PBS-BSA-EDTA(PBE)バッファーを調製し、無菌35%ウシ血清アルブミン(BSA;無菌組織培養グレード35%BSA)の7.2mLを添加し、無菌0.5Mエチレン亜酸テトラ酢酸(EDTA)を487.8mLに添加菌のblを添加する。生理理知(DPBS)。フィルターは、少なくとも2時間の生物学的安全キャビネットに真空に取り付けられたフィルタを残すことによってバッファを殺菌し、ガスを脱ガスし、より小さな容積(250 mL)で脱ガスバッファーをアリコートし、4°Cで保存します。
  2. 1xハンクスバランス塩溶液(1x HBSS)を準備します。滅菌蒸留水の900 mLで100mLの100mLを希釈し、1x HBSSの1Lを作り、pHを7.2に調整します。フィルターは使用前に1x HBSSを殺菌する。
  3. 蒸留水の98mLに氷河酢酸の2 mLを添加することにより、2%酢酸溶液を調出します。
  4. 1x PBSで20 ng/mL組換えヒトフィブロネクチン断片溶液を調作する。48ウェルプレートあたり10 mLを作ります。
  5. 2%BSAを準備します。100 mL 1x PBSに、使用前に殺菌するBSA分画V.フィルターの2グラムを追加します。
  6. DMEM粉末、3.7gm重炭酸ナトリウム、100mL胎児ウシ血清(FBS)および5 mLペニシリン連鎖マイシン(PS)を無菌蒸留水の800mLに加えることによって、完全なダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)を作ります。1Lにボリュームを混ぜて構成し、使用前に殺菌をフィルタリングします。
  7. FBSの90 mLと無菌ジメチルスルホキシド(DMSO)の10mLを混合して凍結培地を調作する。
  8. 刺激培地を調調す。血清フリー培地にL-グルタミンを2mMに添加し、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、およびFms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)、およびインターロイキン-3(IL3)の最終濃度50ng/mLにサイトカインを添加する(IL3)材料サイトカインストックソリューションの調製用)。48ウェルプレートあたり5 mLを作ります。
  9. 1x骨髄分化培地を調記する。DMEMを完了するには、SCF、Flt3L、IL3の最終濃度に5 ng/mL、TPOで50 ng/mL、エリスロポエチン(EPO)に4単位/mLを追加します。48ウェルプレートあたり5 mLを作ります。
  10. 2x骨髄分化培地を調記する。DMEM を完了するには、SCF、Flt3L、IL3 の最終濃度 10 ng/mL、TPO の場合は 100 ng/mL、EPO では 8 単位/mL にサイトカインを追加します。48ウェルプレートあたり5 mLを作ります。
  11. フローサイトメトリーバッファを準備します。1x PBSの1Lに、BSA画分Vの10gを加える。
  12. 1x PBSで1%のパラホルムアルデヒドを調調します(詳細は材料表を参照)。
  13. 1x PBSの49.5 mLに10mg/mLポリLリジンの500 μLを添加してポリL-リジン溶液を調製します。

2. 臍帯血からの単核細胞の分離

注:以下に説明するプロトコルでは、90~100mLの臍帯血量が用いられた。CD34+細胞の単離は、生物学的安全キャビネット内の無菌条件下で行われなければならない。

  1. UCBを含む袋に70%エタノールを入れてスプレーし、外表面を殺菌してから、生物学的安全キャビネットに取り込みます。UCBを無菌の250 mLペットボトルに移し、室温(RT)1x HBSSを同量に加えて1:1に希釈します。
  2. チューブあたりのMNC分画媒体(MFM;材料の表を参照)の15 mLを約6つの滅菌50 mL円錐形チューブに分配します。MFMでチューブを傾け、30mLの希釈されたUCBを邪魔することなくMFM層に静かに注ぎます。
  3. ゆっくりと加速し、ブレーキなしでRTで30分間400 x gのチューブを遠心分離します。
  4. 遠心分離後、MNC層上のプラズマの15〜20 mLの間で吸引する。ピペットでMNCをそっと集め、新しい50 mL円錐形チューブに移します。
    注:MNCは、プラズマとMFMの界面に白色バフィー層として堆積し、円錐管の底部に赤血球(RBC)沈水を付着させる。
  5. 2~3本のチューブから集めたプールMNC。コールドPBEバッファで各チューブの体積を50mLにします。
  6. 4 °Cで10分間300 x gでチューブを遠心分離し、ブレーキを低くします。
  7. 上清を吸引し、チューブを軽くタップして細胞ペレットを緩めます。
  8. ペレット化した細胞を5mLの氷冷PBEバッファーで再中断する。同じ5 mLの再懸濁細胞を使用して、他のチューブから細胞を収集します。3~4本のチューブを1本の50mL円錐管にまとめます。
  9. 残りの細胞を回収するには、5 mLの冷たいPBEバッファーですべてのチューブを洗浄し、50 mL円錐管に追加します。
  10. 10 μLの細胞懸濁液を490 μL酢酸溶液に希釈してMNCを数えます。
    注:酢酸は、MNCのカウントを容易にするために、任意の汚染RBCを溶解します。
  11. 氷冷PBEバッファでセルサスペンションの体積を50mLにします。4°Cで10分間300 x gでセルを遠心分離し、ブレーキを低くします。
    注:MNC懸濁液は、CD34+セルの単離のために直ちに処理されるか、または後のアプリケーションのために凍結することができる。
  12. MNCを凍結するには、上清を取り除き、RTで凍結培地で2 x 107セル/mLの密度で再中断します。
  13. 細胞凍結容器で-80°Cで一晩で細胞を凍結し、液体窒素に移します。

3. 単核細胞からのCD34+細胞の分離

  1. 新しく分離された MNC を使用する場合は、手順 3.3 に直接進みます。
  2. 冷凍MNCを使用する場合は、37°Cの水浴で冷凍細胞を素早く解凍し、50mL円錐管に移します。氷冷PBEバッファーの1 mLでバイアル内の残りの細胞を収集し、50 mL円錐管に転送します。
  3. MNCサスペンションの体積を50mLにし、冷たいPBEバッファーと遠心分離機を600 x gで4°Cで5分間作ります。
  4. 上清を取り除き、チューブを軽くタップして細胞ペレットを緩めます。300 μL の氷冷 PBE バッファーで、MNC を 1 x 108セルに再中断します。
  5. 磁気活性化セル選別(MACS)ヒトCD34マイクロビーズキットから100μLのFcRブロッキング試薬を1x108 MNCごとに追加し、穏やかに混合します。
    注:これにより、CD34マイクロビーズへの非特異的結合がブロックされます。
  6. CD34マイクロビーズを1 x 108セルにつき100μLを加えます。穏やかに混ぜ、冷蔵庫で30分間4°Cでインキュベートします。氷の上でインキュベートしないでください。
  7. セルがインキュベーションされている間、LS カラムと分離前フィルターを MACS セパレータ磁場に配置します。分離前フィルタで2 mLをカラムに直接追加し、1mLを追加することで、氷冷PBEバッファでカラムを平衡化します。カラムを15 mLの円錐形のチューブに空にし、流れを破棄します。
  8. 4 °CからMNCを取り外し、氷冷PBEバッファを追加して体積を15mLにし、4°Cで10分間300xgで遠心分離し、ブレーキを低くします。
  9. 上清を吸引し、氷冷PBEバッファーの1 mLで細胞を再中断します。
  10. LS カラムに配置された分離前フィルタにセルサスペンションを追加します。
    注:分離前フィルタは、列をブロックする可能性のある大きなセル集約を削除します。
  11. 3 mLの氷冷PBEバッファーでチューブをすすいで、LSカラムに置かれた分離前フィルターに追加します。この後、分離前フィルタを破棄します。
  12. LSカラムを3 mLの氷冷PBEバッファを追加してLSカラムを4回洗い、毎回カラムを排水できるようにします。
    注:CD34+セルは列にバインドされたままになり、ラベルのないセルは列を通過します。
  13. 最後の洗浄後、MACSセパレータ磁場からカラムを取り外し、磁石から離れた新しい15 mL円錐管に入れます。
  14. カラムに5 mLの氷冷PBEバッファを追加し、プランジャーをしっかりと押してバインドされたCD34+セルを排出します。
  15. 必要に応じて、前述のように分離前フィルタを使用して、最初の列から分離された CD34+セルを別の LS カラムに渡します (手順 3.10−3.13)。
  16. 単離されたCD34+細胞をトリパンブルー(細胞の10μLとトリパンブルーの10 μL)でカウントし、生細胞の総数を決定します。
    注:この段階では、単離されたCD34+細胞は、後で使用するために凍結されてもよいし、フローサイトメトリー(セクション4)によるHSPCの分析のために直接処理されるか、またはミエロイド系統細胞への分化のために処理されてもよい(セクション5)。
  17. RTで5分間600 x gのセルサスペンションを遠心分離し、ブレーキを低くします。
  18. CD34+細胞を凍結させるには、上清を吸引し、上述のように凍結培地の1mLで最大5 x 106細胞を再停止し、上記のように凍結する(ステップ2.13)。それ以外の場合は、セクション 4 または 5 に進みます。

4. フローサイトメトリーによるステムおよび前駆体集団の決定

  1. 新たに単離されたCD34 +HSPCにおける幹細胞および前駆体集団の分画を決定するには、それらを600 x gで5分間遠心分離し、50 μLのフローサイトメトリーバッファーで1 x 106細胞を再定時停止します。
  2. 1 x 106 CD34+細胞に、抗体(希釈のための材料の表を参照)を系統マーカー(CD3、CD7、CD10、CD11b、CD19およびCD235a-すべてのFITCラベル付き)、CD34(APC-Cy7)、CD38(PE-Cy7)、CD45RA(PE-Cy7)、CD123(APC)に追加します。アミノアクチノマイシンD(7-AAD;生きた/死んだ汚れとして)を構成し、総体積を100μLにする。
    注:分析に1 x 106 CD34+細胞未満が用いられる。より少ない細胞を染色する場合は、それに応じて添加された抗体の総体積と体積を減少させるべきである。フローサイトメトリー分析では、染色されていない単一染色されたMNCを、各蛍色素に対して正ゲートと負のゲートを設定するためのコントロールとして使用する必要があります。
  3. インキュベーション後、1mLのフローサイトメトリーバッファーと遠心分離機で細胞を5分間600xgで洗浄します。
  4. 必要に応じて、染色された細胞を1%パラホルムアルデヒド溶液の0.5mLでRTで暗闇の中で10分間固定する。
  5. 5分間600 x gで遠心分離機を吸引します。
  6. 固定/染色された細胞を1 mLのフローサイトメトリーバッファーと遠心分離機で600 x gで4°Cで5分間洗浄します。
  7. 上清を吸引し、500μLのフローサイトメトリーバッファーで細胞を再中断し、フローサイトメーター(材料表)で分析する。

5. CD34+造血幹細胞および前駆細胞の骨髄分化

注:CD34+HSPCを骨髄系統細胞に分化させるために、それらは最初に組換えヒトフィブロネクチン断片コーティングプレートで刺激され、次いで骨髄分化培地におけるMS-5間質細胞の層に播種される。分化は、4つの骨髄系に特異的な細胞表面マーカーの発現に基づいて3週間毎週モニタリングされ得る。刺激および分化の間、すべてのインキュベーションは加湿された部屋の37 °Cおよび5%CO2で行われる。すべてのステップは、生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。

  1. 再生中のヒトフィブロネクチン溶液の200 μL/ウェルをRTで2時間1x PBSに加えて、無菌のコーティングされていない48ウェルプレートのウェルをコーティングします。
  2. 2時間後、組換えヒトフィブロネクチン溶液を慎重に取り出し、廃棄する。
  3. RTで30分間2%BSAの200 μL/ウェルでウェルをブロックします。
  4. BSA溶液を吸引し、無菌1x PBSの500 μLでウェルを2回洗浄します。
    注:フィブロネクチン断片被覆プレートは、最大2週間4°Cで保存することができる。
  5. CD34+HSPCを刺激するために、(ステップ3.17から)1 x 105細胞/200 μLまたは5 x 105細胞/mLの温かい1x刺激媒体の密度で(ステップ3.17から)再中断します。
  6. 凍結CD34+細胞を使用する場合は、迅速に解凍し、暖かい完全なDMEMを含む15 mL円錐管に細胞を転送します。600 x gで5分間遠心分離し、ステップ5.5に記載されているように細胞を再中断する。
  7. CD34+セル懸濁液のプレート200μLをフィブロネクチン断片のウェル当たり48ウェルプレートを被覆し、48時間インキュベートする。
  8. 翌日、48ウェル組織培養処理プレートのウェル当たり200μLの完全なDMEMの25,000 MS-5間質細胞を種子し、24時間37°Cでインキュベートする。
  9. 刺激の48時間後、穏やかなピペッティングによってCD34+細胞を収集する。500 μL の温かい DMEM とプールをセルサスペンションで洗浄します。
  10. トリパンブルーでセルを数えます。懸濁液を600xgで5分間遠心分離し、1x骨髄分化培地の5,000細胞/200μLの密度で再懸濁する。
  11. MS-5間質細胞で播種した48ウェル組織培養プレートから、細胞を乱すことなく培地を静かに吸引する。CD34+細胞懸濁液の層200μL(5,000細胞)をプレートのウェル当たり、37°Cでインキュベートする。
    注:MS-5細胞の培養は、完全なDMEMで維持することができる。CD34+細胞が播種された日に、MS-5細胞は均一な層(80〜90%合流)でなければなりません。MS-5細胞は、CD34+細胞の播種の少なくとも24時間前にめっきすることを推奨する。  MS-5細胞がCD34+細胞を播種する前に48時間または72時間メッキされる場合、細胞密度はそれに応じて調整されるべきである。また、48ウェルプレートの周辺ウェルは、エッジ効果を避けるために、白く残すか、200 μLの滅菌水で満たされることをお勧めします。
  12. 各ウェルの上部から100μLの培地を静かに取り除き、ウェル当たり2倍ミエロイド分化媒体の100 μLに置き換えることで、3~4日ごとに半中変化を行います。
  13. 21日目に、フローサイトメトリーによる骨髄系統マーカー発現の分析のために細胞を採取する。MS-5層を邪魔することなく、培地を優しくピペットし、細胞を5mLチューブに移します。
    注:染色およびフローサイトメトリー分析のために、1-2ウェルからの細胞は十分である。分化は、1日目、7日目、および14日目に監視することもできる。複数の日に免疫表現型を実行する場合は、分析に必要なウェルの数がそれに応じて計算する必要があります。
  14. CD34(APC-Cy7)、CD66b(PE-Cy7)、CD14(PE)、CD41(PerCP-Cy5.5)、CD235a(APC)に対する抗体を持つ5 x 105細胞を合計50μLの総容積で染色し、単一の染色を含む各蛍色素の正と負のゲート、および分析から死んだ細胞を排除するために生きている/死んだ染色として7-AAD。
  15. 上記のように染色した細胞を洗浄して固定する(オプション)(手順4.3-4.6)。
  16. フローサイトメトリーバッファーの500 μLで細胞を再中断し、フローサイトメーターで分析します。

6. 細胞形態の評価

  1. エタノールを噴霧し、きしむまで拭くことによってきれいな顕微鏡スライド。
  2. RTで5分間ポリL-リジン溶液にきれいなスライドを浸し、RTで1時間乾燥させます。
  3. ステップ 3.14 から HSPC を再中断し、フロー サイトメトリー バッファーの 10 μL でステップ 5.13 から分化したセルを再中断します。
  4. セルサスペンションをコーティングされたスライドに移し、エアドライのままにしておきます。
    注:1日目と21日目のスライドはRTで保存し、同時に染色することができます。
  5. スライドにライトギムサ染色の0.5 mLを注ぎ、RTで3分間立たせてください。
  6. 同じ量の脱イオン水を加え、RTでさらに10分間立たせてください。
  7. スライドを脱イオン水で洗います。
  8. 染色した細胞を顕微鏡で60倍または100倍の倍率で可視化します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

上記のプロトコルの適用は、〜100 mLの臍帯血単位から5.6(±0.5)x 108 MNCおよび1(±0.3)x 106 CD34+細胞を生み出す。CD34+セルの合計のパーセンテージは、80 ~ 90% の範囲です (図 2A,B)。Manz et al.5で説明したスキームによる免疫発フェノチピック分析は、CD34+細胞が通常、Lin - /CD34+/CD38-およびLin -/CD34+ である約20%のHSCと約72%のPMPで構成されていることを示しています。/CD38+それぞれ (図 1と図 2A)。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、UCB由来CD34+HSPCの4つの骨髄系統の生体分化に適している。SCF、TPO、Flt3LおよびIL3からなるサイトカインミックスを用いた初期インキュベーションは、CD34+細胞を刺激する。その後、SCF、IL3、Flt3L、EPO、およびTPOのカクテルで差別化が達成されます。この組み合わせでは、SCF、IL3、およびFlt3Lは、CD34+HSC.EPOおよびTPOがそれぞれ赤血球および巨核球に対する分化を促進し、IL3は早期顆粒球-単球の分化を促進する。前駆体および成熟細胞13,17,18.この方法の注意点の 1 つは、分化細胞のパーセンテージの変化が観察された点です。これは、血統細胞を生み出すために異なるドナーから単離されたCD34+HSPCの容量の違いが考えられる。

M...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者らは、ウェンディ・バレット、レイチェル・カバレロ、マリコパ統合医療システムのガブリエラ・ルイスに対して、コード血液ユニットの識別と寄付を行った、Mrinalini Kalaのフローサイトメトリーの支援、ゲイ・クルックスとクリストファー・シートに感謝したいと思います。ex vivo骨髄分化に関するアドバイス。この研究は、国立衛生研究所(R21CA170786およびR01GM127464)と米国癌学会(機関研究助成金74-001-34-IRG)からのS.S.への資金によって支援されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.4% トリパン青色溶液サーモフィッシャーサイエンティフィック15250-061無菌 1x PBS
0.5 M UltraPure エチレンジアミンテトラ酢酸、pH 8.0Gibco 15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen14185052滅菌蒸留水で 1x に希釈し、pH を 7.2
2.5% トリプシン、フェノールレッドなしThermo Fisher Scientific15090046作業ストックを 1x に希釈し、滅菌 1x PBS
30 & マイクロ;m Pre-separation filtersMiltenyi biotech130-041-407
35% sterile ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA7979
7-AADバイオレジェンド420404FACS分析から死んだ細胞を除去するための生/死染色として使用
抗ヒトCD10-FITC 抗体 (クローン HI10a)バイオレジェンド3122071:20
希釈抗ヒト CD11b-FITC (活性化) 抗体 (クローン CBRM1/5)バイオレジェンド3014031:5 希釈
ヒト CD123-APC 抗体 (クローン 6H6)バイオレジェンド3060121:20 希釈
抗ヒト CD14-PE 抗体 (クローン M5E2)レジェン3018061:20 希釈
抗ヒト CD19-FITC 抗体 (クローン 4G7)BD バイオサイエンス3475431:5 希釈
抗ヒト CD235a-APC 抗体 (Clone GA-R2 (HIR2))BD Biosciences5513361:20 希釈
抗ヒト CD235a-FITC 抗体 (Clone HIR2)Biolegend3066091:50 希釈
抗ヒト CD34-APC-Cy7 抗体 (Clone 581)Biolegend3435141:20 希釈
抗ヒト CD38-PE 抗体 (Clone HIT2)Biolegend3035061:20希釈を使用してください
抗ヒト CD3-FITC 抗体 (クローン UCHT1)バイオレジェンド300405使用 1:20 希釈
ヒト CD41a-PerCP-Cy5.5 抗体 (クローン HIP8)バイオレジェンド303720使用 1:20 希釈
抗ヒト CD45Ra-PE-Cy7 抗体 (クローン HI100)バイオレジェン304126:20 希釈抗
ヒト CD66b-PE-Cy7 抗体 (クローン G10F5)バイオレジェンド305116使用1:20
抗ヒトCD7-FITC抗体(クローンCD7-6B7)バイオレジェンド343103使用1:20希釈ジ
メチルスルホキシド(DMSO)フィッシャーサイエンティフィックBP231-100フィルター使用前に滅菌してください
Dulbecco'Modified Eagle Medium(DMEM)粉末とL-グルタミン Gibco121000461 パケットを再構成して 1 L の DMEM 培地を 1 L に 1 L の重炭酸ナトリウム、10% FBS、1% ペニシリン、ストレプトマイシンで
ウシ胎児血清、オーストラリア産、熱不活化オメガサイエンティフィックFB-22ロット#609716
ヒトCD34マイクロビーズキット Miltenyiバイオテクノロジー130-046-702
ヒトトロンボポエチン(TPO)、研究グレードMiltenyiバイオテクノロジー130-094-01111111100µの在庫を作る。g/mL 1x PBS + 0.1% BSA 溶液。骨髄分化と骨髄分化の両方に50 ng/mLを使用してください。刺激媒体
L-グルタミンオメガサイエンティフィックGS-60刺激媒体中の2 mM濃度
LS カラムMiltenyi biotech130-042-401
MACS マルチスタンドMiltenyi biotech130-042-303
MidiMACS 磁気セパレーターMiltenyi biotech130-042-302
MNC分画培地 (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
MS-5 cellsGift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148ビーカーに1x PBS800 mLを化学フードの攪拌板に乗せて~65°Cに加熱します。パラホルムアルデヒド粉末10 gを加えます。パラホルムアルデヒドを完全に溶解するには、1 N NaOHを添加してpHを上げます。溶液を冷却してろ過し、1x PBSで容量を1 Lにします。pHを7.2に調整します。
ペニシリン&ストレプトマイシンSigma-AldrichP4458-100ml
Poly-L リジンSigma-AldrichP2636に 10 mg/mL ストックを添加
。BioBasicRC213-151x PBS + 0.1% BSAで2,000ユニット/mLのストックを行います。骨髄分化に4単位/mLを使用
組換えヒトフィブロネクチンフラグメント(レトロネクチン)宝 T100Bは20µを使用します。g/mLを滅菌済みの1x PBSで希釈し、CD34+ HSCを刺激する前にウェルをコーティングします。
組換えヒトFlt-3リガンド(rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16100 µg/mL 1x PBS + 0.1% BSA 溶液。骨髄分化に5 ng/mLを使用 &刺激媒体中の50 ng / mL
換えヒトインターロイキン-3(rHu IL-3)BioBasicRC212-14100 µg/mL 1x PBS + 0.1% BSA 溶液。骨髄分化に5 ng/mLを使用 &刺激媒体に20 ng / mL
組換えヒト幹細胞因子(rHu SCF)BioBasicRC213-12100 µg/mL 1x PBS + 0.1% BSA 溶液。骨髄分化に5 ng/mLを使用 &50 ng/mL in stimulation
血清培地 (X-Vivo-15)Lonza 04-418Q
重炭酸フィッシャーサイエンティフィックBP328-500
ライト・ギムザ染色、変性シグマ・アルドリッチWG16-500メーカーの指示に従って使用
<ストロング>機器 
BD LSR IIフローサイトメーターBD Biosciences
CentrifugeSorvall Legend RT
光学顕微鏡Olympus
抗バイオド 抗ド 使用 1希釈製造します。 ガラス 1x PBS 組換えヒト エリスロポエチン-アルファ (rHu EPO-&α;) します組 medium 無ナトリウム

参考文献

  1. Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
  2. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
  3. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
  4. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
  5. Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
  6. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  7. Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
  8. Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
  9. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
  10. Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
  11. Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
  12. Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
  13. Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
  14. Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
  15. Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
  16. Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
  17. Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
  18. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
  19. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420(2017).
  20. Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813(2011).
  21. Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
  22. Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
  23. Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789(2016).
  24. Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
  25. Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
  26. Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
  27. Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
  28. Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136(2016).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

CD34
ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。