エレベーター垂直運動と観覧車回転を用いたラットにおける受動運動の自律性と行動の影響の評価

サマリー

プロトコルは、エレベーターの垂直運動と観覧車回転を使用してげっ歯類における受動運動の自律的および行動的影響を評価するために提示される。

要約

本研究の全体的な目標は、エレベータ垂直運動装置と観覧車回転装置を用いて、げっ歯類における受動運動の自律性および行動効果を評価することです。これらのアッセイは、自律神経系の完全性および正常な機能を確認するのに役立ちます。排便カウント、オープンフィールド検査、バランスビーム交差に基づく定量的測定に連結されています。これらのアッセイの利点は、その簡素さ、再現性、および定量的行動の尺度です。これらのアッセイの限界は、自律神経反応が非前庭障害のエピフェノフェノであり得、機能する前庭系が必要であるということである。乗り物酔いなどの疾患の検査は、これらのアッセイの詳細な手順によって大いに助けられます。

概要

外見前庭刺激の異常による乗り物酔い(MS)は自律神経反応を引き起こし、上胃不快感、吐き気および/または嘔吐などの症状を引き起こす^1。現在の理論によれば、乗り物酔いは、あくび船^4,5で起こるように環境^2,3または姿勢不安定の予想される内部モデルとは異なる統合運動情報を受信することから感覚的な衝突または神経不一致によって引き起こされる可能性がある。乗り物酔いおよび前庭自律機能^{6、7,8,9、10},^11,12の分野で大きな進歩を遂げたにもかかわらず^、将来の研究は標準化された評価プロトコルによって支援することができる。標準的な受動運動の自律神経効果を評価することは、乗り物酔いの原因と予防に関する調査に大きな利益をもたらす。本研究の全体的な目標は、げっ歯類における受動運動の自律性および行動効果を評価することです。げっ歯類などの動物モデルは、簡単な実験操作(例えば、受動運動および製薬)および行動評価を可能にし、乗り物酔いの病因を研究するために使用することができる。ここでは、受動運動の効果と前庭機能の完全性をテストするための詳細な電池を紹介します。

本研究では、受動運動に自律神経反応を誘発する2つのアッセイ、エレベータ垂直運動(EVM)および観覧車回転(FWR)を詳述する。アッセイは、バランスビーム(マウス¹³およびラット^{14、15、16、17)、}オープンフィールド検査^、排便計の3つの定量的行動測定に連結される。EVM(波に遭遇する船のピッチとロールに似ている)は、直線加速度をコードするオトリス感覚器官(すなわち、垂直面の動きに応答する嚢子⁾¹⁸を刺激することによって前庭機能を評価する。FWR(遠心回転または正弦運動)装置は、角加速度^19、20によって線状加速度および半規管によって耳ラス器官を刺激する。観覧車/遠心回転装置は、その自律的な評価において独特である。現在までに、文献中の唯一の類似したデバイスは、外垂直軸回転(OVAR)ターンテーブルであり、これは前庭眼反射(VOR)18、21、22、条件回避23、24、および超重力25、26、27の影響を調べるために使用される。EVMアッセイとFWR装置アッセイは、自律神経反応を引き起こす前庭刺激を誘導する。EVMとFWRをバランスビーム、排便計数、オープンフィールド解析^28、29、30などの定量測定に組み合わせることで、堅牢で再現性のある結果を得ることができます。マウス¹³およびラット^{14、15、16、17}で前述したものと同様に、バランスビームアッセイは、ゴールエンドで簡単なブラックボックス修飾を用いて2つの木製スツール間の地面から0.75mの長いビームを吊り下げた長さ1.0mのビームである(仕上げ)。バランスビームは、不安(不明瞭なブラックボックス^)14、17、外傷性傷害15、16、17を評価するために使用されており、ここで、バランスに影響を与える自律神経反応。我々は、以前に乗り物酔いモデルにおける自律神経応答を評価するための排便カウントを行っており^{、6、8、9、11}を容易に評価してかつ明確に評価される信頼性の高い定量測定である。オープンフィールド解析では、モーションなどの動作を定量化するために、エトビジョン^28、盆栽^30、またはMatlab²⁹のシンプルなビデオ解析を使用したシンプルなブラックボックスのオープンフィールド行動評価を採用しています。現在のプロトコルでは、移動距離の合計を使用しますが、いくつかの異なるパラダイム(例えば、伸び、移動のゾーン、速度など)が存在します。^28、29、30.集合的に、これらの手順は、例えば乗り物酔い^{6、7、8、9、10、11}で、受動動に対する自律神経反応の検査および評価のための評価の短い電池を形成する。本アッセイは、様々な動物モデルに適合させることができる。

プロトコル

本研究と手順は、実験動物の治療と使用のためのガイド(米国国立研究評議会)に従って第二軍医科大学(上海、中国)の動物実験のための倫理委員会によって承認されました。1996).

1. 動物

1. 2ヶ月(200〜250g)のスプレイグ・ドーリー(SD)ラットを使用します。行動アッセイごとに、別々のラット群を使用してください。常に別々の制御グループと実験グループを使用します。
   注: 2 つのオートノミック テストがありました: EVM と FWR。EVMは、対照群(=4)に加えて3つの条件を有し、3つの行動アッセイ(バランスビーム、排便カウントおよびオープンフィールド=3)を有し、それぞれ8匹のラットを合計96匹のラット(4 x 3 x 8)にした。FWRは、3つの行動アッセイ(バランスビーム、排便計数およびオープンフィールド=3)を有する対照群(=2)に加えて1つの条件を有し、それぞれに8匹のラットが合計48匹(2 x 3 x 8)を有した。合計で、144匹のラットを報告しています。
2. ケージげっ歯類は、一定の25°C温度と60%~70%の湿度下で行います。
3. 家のげっ歯類 12時間/12時間の光/暗いサイクルで、食べ物と飲料水アドリビタムにアクセスできます。
   注: 以下のプロトコルは行動実験であるため、ラットは穏やかに扱われるべきです。動物を扱う不安を誘発しないように、体と後部のサポートを持つ両手でする必要があります。
4. 暗闇の中で実験(EVMおよびFWR)と評価アッセイ(バランスビームとオープンフィールド評価)を実行し、視覚的な手掛かりを最小限に抑えます。

2. エレベータ縦型運動装置

1. 完全な暗闇の中でエレベーターの垂直モーション手順を実行して、視覚的な手がかりを最小限に抑えます。
2. げっ歯類をプレキシグラスボックス(22.5 cm x 26 cm x 20 cm)に入れます。ここでは、プレキシグラスボックスは4つのげっ歯類(カスタムメイドのデバイス)を収容することができます。
3. げっ歯類が脱落しないように、ボックスを閉じてしっかりと閉じておきます。プレキシガラスボックスを、エレベータ垂直運動装置(カスタムメイドデバイス)のエレベーターパッド上に置きます。
4. 昇順化のための最も低い設定にエレベータ垂直運動装置をオンにします。
5. 振幅を22cm上に、ニュートラルから22cm下に設定します。次のように、昇降垂直方向の動きを段階的に変更します。
   1. 初期期間は、5 分で 2,500 ミリ秒、5 分で 2,000 ミリ秒、5 分間で 1,500 ミリ秒に設定します。
   2. 2 時間 1000 ミリ秒のテスト期間を使用します。
   3. 5 分で 1500 ミリ秒、5 分で 2000 ミリ秒、5 分間 2500 ミリ秒の期間を使用して、デバイスを逆方向に遅くします。

3. 観覧車回転装置

1. 観覧車回転装置の設定
   1. プレキシガラス容器(22.5 cm x 26 cm x 20 cm)を木製のベンチ(カスタムメイドの装置)に置きます。
   2. 歯類を、観覧車(カスタムメイドの装置)の水平回転棒に垂直な長い軸を持つプレキシガラス容器に置きます。
      注:水平ロッドに垂直なボディを持つ配置は、回転中に耳ラス器官(前-後部および垂直方向)の刺激を保証します。
   3. プレキシガラスボックスをしっかりと閉じます。
   4. 2番目のセットのげっ歯類を、観覧車回転装置の2番目のアームの水平回転ロッドに垂直な長軸のプレキシガラス容器に置きます。観覧車のバランスをとるために、類似した質量を持つげっ歯類の2番目のセットを使用してください。
   5. プレキシガラスボックスをしっかりと閉め、観覧車回転装置に置きます。
2. 観覧車回転手順
   1. 完全な暗闇の中で観覧車の回転手順を実行して、視覚的な手がかりを最小限に抑えます。
   2. 16°/s²で時計回りに回転する観覧車を開始し、角速度120°/sに達し、48°/s²で減速して0°/sに達します。1 回の休止後、容器を上記と同じ方法で反時計回りに回転させ続けます(16°/s²で加速度が 120°/s の角速度に達し、48°/s²で減速して 0°/s に達します)。時計回り-反時計回り周期は、最初の位置に達するためにおよそ10sを必要とする。
   3. 約 720 回転のセッションごとに 2 時間、時計回り、反時計回りの回転を続けます。

4. EVMおよびFWRの評価

注:観覧車回転装置とエレベータ垂直運動の評価は、バランスビーム試験、排便計数、およびオープンフィールド検査の3つの手順で行われます。同一の手順は、エレベータの垂直運動を評価するために使用されます。これらの評価手順は、観覧車回転またはエレベーター垂直運動の後、できるだけ早く行う必要があります。

1. バランスビーム
   1. バランス梁の設定
      1. バランスビーム10,11,12は、約^110cm離れた実験場に木のスツール(高さ約0.75m)を2本設置して設置します。
      2. 黒いプラスチック製の箱(15 cm x 15 cm x 8 cm)を仕上げのスツールに置きます。
      3. 2つのスツールの間に狭い木製の梁(2.5cm x 130 cm)を置き、開始スツールから仕上がり便までの便の端の間に100cmの距離を残します。
         注:黒いプラスチック製のボックスへの入り口は、100 cmのフィニッシュラインにする必要があります。
      4. スタートスツールにランプを置きます。ランプをオンにします。
      5. 部屋の照明を消し、部屋ができるだけ暗くしていることを確認してください。これにより、げっ歯類は、照明された領域から隠れた領域へのバランスビームの方向に従うことを保証します。
   2. バランスビーム手順
      注:バランスビームのモーター調整アッセイは、高架の木梁を横断するのに要する時間を測定することによって評価されます。
      1. バランスビーム¹⁰で安定した性能を達成するために、検査期間の前に、3日間連続して毎日各げっ歯類を訓練する。照らされたコーナーのビームにラットを導入し、ビームを横切るように促すことによって訓練する。最終的にネズミはそれ自身の意志を横切ります。本プロトコルのラットは3.6±0.9秒を要した。
         注:一部のげっ歯類はトレーニング中に安定したパフォーマンスを達成できず、除外する必要があります。げっ歯類の中には、ビームを横切る動機がないものもありますが、タスクを実行しないものもあります。安定した性能は、4秒未満の交差時間の2連続試行期間であった。ラットが訓練や評価中に落ちた場合、ラットを「落下」と分類し、それ以上評価すべきではありません。
      2. 実際の手順では、訓練されたげっ歯類をライトの近くの開始スツールに置き、同時にストップウォッチでスタートを押します。げっ歯類は、バランスビームを急速に横断し、仕上げのスツールのブラックボックスに入る必要があります。
      3. げっ歯類が所定の位置に入ったらストップウォッチのスタートボタンを押し、鼻がフィニッシュスツールのダークボックスに入ったら停止ボタンを押します。ビームを横断する時間は、開始スツールから終了スツールまでです。
         注意: げっ歯類のトレーニングを受けたら、評価前に乗り物酔いを誘発するなどの操作や操作を行うことができます。また、最後のトレーニング セッションを通過する時間を使用して、介入の前にベースラインの測定値を取得することもできます。
2. 排便カウント
   1. 観覧車試験期間後、4つのげっ歯類を含むプレキシガラス容器をベンチに置きます。
   2. げっ歯類を取り除き、個々のオープンフィールドボックス(以下)に入れてください。
   3. 各げっ歯類に起因するプレキシガラスボックス内の便出ペレットの数をカウントします。
      注:エレベータの動き後の評価と比較するために、エレベータ垂直運動を行う前にフェクスペレットを数えることで、ベースライン測定を得ることができます。
3. オープンフィールド試験
   1. げっ歯類をオープンフィールドボックス(40 cm×40cm)に入れます。
   2. 3分^28、29、30のためのIRビデオカメラを使用して、オープンフィールドの動作を記録します。
   3. 移動距離の合計を決定します。
      注:エレベーターの垂直運動の前に、オープンフィールドボックスにげっ歯類を置かないように非常に重要です。環境はげっ歯類には斬新でなければならない。したがって、ベースライン測定はオープンフィールドの検査に使用しないでください。

結果

図2は、横にかかった時間の代表的なバランスビーム結果を示しています。ラットは、バランスビーム¹⁰で安定した性能を達成するために3日間連続して訓練された。その後の日、ラットはバランスビーム性能について評価した。図のy軸では、げっ歯類が観覧車のバランスビームを横切るのにかかった秒数、エレベータの垂直運動、および実証目的の制御グループを持っています。

図 3は、代表的な排便数の結果を示しています。エレベーターの垂直運動の場合、ラットは、静的グループと呼ばれる対照群に加えて、0.8 Hz、0.4 Hz、および 0.2 Hz の垂直方向の運動の 3 つの異なる回転グループの 1 つに入っていました。モーションの期間に対する等価性は次のとおりです: 周波数 = 0.8Hz = 1/0.8 = 0.1250s = 1250 ms, 周波数 = 0.4Hz = 1/0.4 = 0.2500s = 2500 ms、周波数 = 0.2H...

ディスカッション

本研究では、エレベータ垂直運動と観覧車回転を用いたげっ歯類における受動運動に対する自律的応答の評価について述べている。これらの装置および処置は他のげっ歯類に容易に採用することができ、薬理学的挑戦または外科的介入の間のような異なった状況で前庭の機能を確認するために、アッセイのいくつかの変更が存在する。前庭刺激によって引き出されるMSの研究は、環境²の予想される内部モデルとは異なる視覚情報を受け取ることによって引き起こされる感覚的衝突または神経不一致が、心膜不快感、吐き気および/または嘔吐などの症状を引き起こす自律神経^{反応につながるという}理論を導いた^。さらに理論は、発毛船^4、5に起こるように姿勢不安定性が、自律神経反応を惹起することを概説している。これらの大きな進歩にもかかわらず、エレベーターの垂直運動や観覧車回転などの評価プロトコルによって助けることができる疑...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エレベーター垂直運動装置	カスタム		メイド エレベーター垂直運動装置 希望の仕様
Ethovision	Noldus 情報技術		ビデオ追跡ソフトウェア
観覧車回転装置	カスタム		メイド 希望の仕様の観覧車回転装置
ラテックス、ポリビニル、ニトリル手袋	AMMEX		パウダーなしの手袋を使用 8ミル
オープンフィールドボックス	IR		ダークプレキシガラスボックス
ラットまたはマウス	JAXラボ		任意の小さなげっ歯類
小さなげっ歯類ケージ	Tecniplast	1284L
木製の梁とスツール	カスタム		メイドの木製の梁とスツール 示された仕様に