マウス生殖管自発的運動性を評価するためのEx Vivo法とデータ解析のためのMATLABベースの子宮運動追跡アルゴリズム

主要な女性器官として、子宮は生殖に不可欠であり、胎児1の栄養のために不可欠である。子宮は、ペリメトリウム、ミオメリウム、子宮内膜の3つの層から成っている。筋膜は子宮の主要な収縮層であり、胎児の分娩において重要な役割を果たしている。子宮内膜は子宮腔を裏打ちする最も内側の層であり、胚の移植に不可欠である。生殖年齢の非妊娠女性では、子宮内膜層は月経周期の初めに毎月流される。ミオメリウムは、子宮1から壊死性子宮内膜組織をクリアするために必要な自発的なミオメウチ収縮を維持することによって、この脱落プロセスを助ける。

残念ながら、筋膜収縮の増加は、月経困難症、または痛みを伴う月経困難などの負の副作用をもたらすことができます。これは特に若い女性とnulliparous女性2で見られます.しかし、月経困難は女性ごとに異なり、心膜収縮の強さに依存します。より強い収縮は、多くの場合、重度の^{けいれん3}の感覚に関連付けられています。子宮内膜収縮性は、子宮超音波を使用して可視化することができ、しばしば子宮内膜波として認識される。子宮内膜スラッシングを受けている子宮における月経4の間のプロスタグランジンの放出の増強は、子宮筋の虚血および低酸素症の増加に寄与すると考えられ、子宮筋の虚血および低酸素症を引き起こし、ひいては増加した痛み³.

重度の月経困難は、一部の女性の日の活動を妨げることができ、女性の3〜33%は非常に重度の痛みを持っており、女性は各月経周期5の1〜3日間寝たきりになる可能性があります。月経困難症は、年齢、国籍、経済的地位5にかかわらず、生殖年齢の女性における婦人科罹患率の主な原因である。月経困難の推定有病率は高く、可変であり、生殖^年齢5の女性では45%から93%に及ぶ。 月経困難に関連する痛みは、女性の日常生活に影響を与え、青年期の学業成績の低下、睡眠の質の低下、日常活動の制限、気分の変化5をもたらす可能性がある。

重度の月経困難を経験する多くの女性は、彼らの痛みを和らげるために市販薬にリゾートします。このような市販薬には、プロスタグラン^ジン6の形成を防止するシクロオキシゲナーゼ(COX)阻害剤が含まれている。しかし、COX阻害剤は有害な心血管イベントに関連しており、月経困難を有する女性の約18%がこれらの阻害^剤7に反応しない。したがって、月経のけいれんを軽減するための新しい薬の必要性があります。子宮の過剰収縮は月経困難の病因に寄与するので、可能な戦略の1つは、子宮弛緩剤の使用である可能性がある。

自然発生する自発的なミオメクオート波様収縮のモデルにおける潜在的な緩和剤の効果を定量化することは有益である。しかしながら、これまでのところ、無傷の子宮内で筋肉弛緩薬を試験するための効率的なex vivo法は記載されていない。現在、アイソメ張力測定は、リラックス薬の効果を評価するために使用されます。このような測定の間、子宮筋ストリップは組織浴中のプリロード下で一定の長さで維持され、子宮筋収縮の力はリラックス薬の有無においてオキシトシン刺激の前後に記録される。このアプローチは非常に便利ですが、高価な機器が必要です。さらに、アイソメ収縮は、無傷の子宮で自然に起こる自発的な筋膜波のような収縮に似ていない。一意に、げっ歯類の子宮筋房波は、生殖管全体(卵巣、卵管、子宮、および膣)が緩衝液中に維持されるとき、子宮角運動として視覚化することができる。ここでは、酸素化されたクレブスバッファーを含むペトリ皿に置かれた無傷のマウス子宮の自発的運動性をモニタリングするためのex vivo法を提示する。また、MATLABモーショントラッカーを用いた運動性定量アルゴリズムについても述べた。この新しいアプローチは、自然発生療法や合成化合物の弛緩剤の可能性をテストするための簡単で安価な代替手段を提供します。

動物を用いるすべての手順は、インディアナ大学医学部(インディアナポリス、IN)の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。2-5ヶ月齢のF2-129S-C57BL/6性的に成熟した雌マウスを用いた。

注意:動物や生物危険物を扱う場合は、ラボコート、マスク、手袋を着用して安全を確保してください。

1. ソリューションの準備

1. 含まれるKrebsバッファを準備します: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM NaH₂PO_4,0.56 mM MgCl_2,25 mM NaHCO_3,および 5 mM ブドウ糖, pH 7.4.循環水浴を使用して37°Cで緩衝温度を維持しながら、5%CO₂および95%O2を含む圧縮ガスの混合物でKrebsバッファーを連続的に酸素化します。
2. 2.68 mM KCl、1.47 mM KH₂PO 4、136.89 mM NaCl、および8.1 mM Na₂HPO 4、pH 7.4を含むダルベッコのリン酸バッファーサリン (DPBS) を調製します。

2. 動物の準備

1. イソファランの吸入を用いてマウスを麻酔する(3%)廃ガス清掃で。撤退反射を評価することにより、適切な麻酔を確保します。後ろのつま先をつまんで動きがないことを確認し、反射応答の損失を示します。深い麻酔が達成された後、切断によって動物を安楽死させる。
   注:イソファランは、平滑筋拡張を引き起こす可能性があります。したがって、生殖管製剤は、ex vivo実験を開始する前に、少なくとも15〜30分間Krebsバッファーで広範囲に洗浄およびインキュベートされるべきである。イソフランは皮膚に接触すると刺激や不快感を引き起こすことがありますので、注意して進んでください。
2. ペーパータオルが並ぶ大きな計量ボートに体を置きます。
   注:妊娠中の女性の実験室の職員は、胎児の体重を減少させ、胎児骨格の骨化を減少させ、自然妊娠^中絶のリスクを高めることができるので、イソフランの実験に関与してはならない。_CO2吸入は、マウスを安楽死させる代用として用いることができる。

3. エストロスサイクルステージの決定

1. 小さな鉗子で、クリトリスを持ち上げて膣のオッチにアクセスし、10 μLのDPBSを含むマイクロピペットチップを膣にゆっくりと挿入します。
   1. 膣壁に穴を突かないように、10~30°の角度でオスティウムを通してマイクロピペット先端が挿入されていることを確認します。液体は挿入後も先端に表示される必要があります。液体が見えない場合、先端は膣にあまりにも遠くに挿入され、膣の寄生虫領域が穿起された可能性があります。
   2. マイクロピペットの先端で膣のオッシウムの筋肉を軽く引き下げて、膣から空気が出るようにします。
2. DPBSの10 μLで2~3回上下にピペットをして膣腔をゆっくりと洗い流し、描かれたセル懸濁液をガラススライドに置きます。
3. 反転相コントラスト顕微鏡を使用して、細胞学的解析を通じてエストルースサイクルステージを決定します。手順は、他の場所^で説明されているように 10^,11.細胞学的分析を行う前に、細胞懸濁液が乾燥していないことを確認してください。懸濁液は、必要に応じて、新鮮なDPBSで希釈することができます。

4. マウス生殖管ディディスセクション

1. マウスをスピーヌ位置に配置し、その四肢を広げて腹部を露出させます。
2. 70%エタノールをスプレーして、腹部を湿らせて消毒します。
3. 鉗子を使用して、クリトリスより上に位置する皮膚を慎重に持ち上げます。下腹部の側面に小さな横切開を行い、腹膜を露出させる上肢まで(図1A)。このプロセス中に、外部フラップが形成されます。小さな切開が絶えず行われるように、フラップはサイズが増加します。
4. 腸管を露出させるために、腸管を慎重に切断する(図1B)。子宮角は、しばしば精膜の真下に位置する可能性があるので、切開を慎重に行い、これは子宮の運動に影響を与える可能性があるので、角に触れないでください。
5. 鉗子を使用して、消化管を覆う筋膜および脂肪組織を取り除く。腹腔から次の消化管セグメントを取り除く:十二指腸、精液、回腸、盲腸、上昇および横結腸(図1C)。
6. 生殖器官を見つけるには、まず尿膀胱(図1C、4)を同定し、安楽死後の空虚化による脱膨張した外観を有する可能性がある。膣は尿膀胱のすぐ下にあります。
7. 陰部の骨の合流点で陰部の交体を見つける(膀胱に口頭で)。
8. はさみを用いて、陰部性線維軟骨組織を通して両側に切開を慎重に行い、膣抽出の経路を提供することにより、陰部性交体を除去する(図1D)。
9. 外陰部の動脈と下部の間にある陰部を切り取る。
10. 鉗子を使用して、膣を持ち上げ、ゆっくりと直腸を取り除きます。
11. 分岐に分岐する2つの子宮角を識別し、膣に大動脈を張る。残りの消化管セグメントの下に隠されている可能性がある各ホーンの端に複雑な卵管と卵巣を見つけます。小さな解剖はさみを使用して、腹腔内の角、卵管、卵巣に接続し、サポートする靭帯を取り除きます。
12. 腹腔から膣、子宮、卵管、卵巣を含む生殖管を取り除く。
13. 単離された生殖管(図1E)をDPBSの10 mLで満たされた100 mmペトリ皿に移す。子宮角を圧縮してミオメリウムを損傷しないようにしてください。
14. 鉗子と外科はさみを使用して、子宮角と膣を囲む結合組織と脂肪組織、ならびに画像品質を妨げる可能性のある陰部領域の毛皮を除去する。広い靭帯を取り外して、子宮角の運動性を可能にする。
15. 新鮮なDPBSで2回分離された生殖管を洗浄し、酸素化クレブス溶液の3 mLで満たされた35ミリメートルペトリ皿にそれを転送します。

5. 組織イメージング

1. 生殖管を含むペトリ皿を酸素化クレブスバッファーに黒い表面に置きます。室温で皿を維持します。
   注:赤外線ウォーミングパッドを使用して、37°Cで組織を維持することが可能です。
2. 自発的な収縮が始まるのに15-30分を許可します。任意のタイプのデジタルビデオ機器を使用して軸面から10分間自発的な子宮運動を記録します。
3. 試験化合物を補充した酸素化クレブスバッファーを含むペトリ皿に調製物を移す。任意のタイプのデジタルビデオ機器を使用して、軸面から約10分間自発的な子宮運動を記録します。
4. DPBSの10 mLで100mmペトリ皿で生殖管全体を洗浄し、治療の可逆性を評価します。
5. 新鮮な酸素化されたクレブスバッファーでペトリ皿に準備を転送します。任意のタイプのデジタルビデオ機器を使用して、軸面から約10分間自発的な子宮運動を記録します。
6. 試験化合物の車両を補充した酸素化されたクレブスバッファーで満たされた別の35mmペトリ皿に調製物を移し、自発的な子宮運動に機械的に誘発された変化がないことを確認する。これは重要なコントロールです。
7. ビデオ映像をコンピュータのハードドライブに転送します。

6. データ分析

1. コントロール、処理、およびウォッシュエピソードを含む元のビデオフッテージから任意のビデオ編集ソフトウェアを使用してクリップを作成します。
2. MATLAB ソフトウェアと提供されたスクリプト(オンライン補足資料を参照)を使用して、自発的な子宮運動を定量化します。
   注:スクリプトを完全に機能させるには、MATLAB 用のコンピュータ ビジョン ツールボックス アドオンをインストールする必要があります。
   1. MATLAB スクリプトを開き、[エディタ]タブに移動し、[実行] をクリックします。
   2. 最初のビデオ ファイルを選択し、[開く]をクリックします。
   3. ポップアップ ダイアログ ボックスにビデオ ファイルのラベルを入力し、[OK] をクリックします。
   4. ホーンの動きの速度を計算するために必要な時間間隔(Δユークリッド距離/Δ)を入力します。
   5. マウス カーソルを使用して、ビデオの最初のフレームの 2 つのポイントを選択します。ポップアップ ウィンドウで、選択したポイントを追跡に使用する必要があることを確認するメッセージが表示されます。[開始]をクリックして、ポップアップ ウィンドウに表示されるリアルタイム トラッキング プロセスを開始します。または、[ポイントの再選択]をクリックして、2 つのポイントを再選択します。
   6. ポップアップ ウィンドウで追跡プロセスの精度を監視します。
   7. 新しいポップアップ ウィンドウで、レートと時間散布図と距離の散布図を確認します。[ファイル] を選択して 2 つの図を保存する|データを文書化するには、同じウィンドウに [名前を付けて保存] を表示します。
   8. MATLAB スクリプトが配置されている同じディレクトリ内で、MATLAB によって自動的に作成されるPointTrackerDataという名前のフォルダを検索します。2 つの別々のワークシート タブで、ビデオから収集されたデータ ポイントを含むlabel_Dataという名前の Excel ファイルを識別します。
      注:任意の代替モーショントラッキングソフトウェアは、自発的な子宮運動性を定量するために使用することができます。
3. 適切なソフトウェア(ExcelやSigmaPlot 13など)を使用して統計分析を実行します。

図1は、このプロトコルに記載されている生殖管分離手順全体の間に撮影された代表的な画像を示す。ビデオ品質を低下させる毛皮でバッファーを汚染しないように、マウス本体を70%エタノールで湿らせた。プロトコルの解剖セクションの主なベンチマークは、尿膀胱を見つけることです。子宮および膣は尿膀胱より劣って位置する。

プロトコルをテストするために、我々はエピネフリンで生殖管全体を治療した。エピネフリンは、子宮平滑筋弛緩を引き起こすことがよく知られています。このホルモンは内因性副腎髄質で生産され、哺乳類のストレス ホルモンとして機能します。.実験では1μMのエピネフリンを用きました。これは、最大応答12を引き起こすことが知られている飽和濃度である。一連の4つの実験を行った。全ての試験において、1μMエピネフリンは可逆的に子宮運動性を可意に阻害した(図2)。

生殖管の自発的な運動性を定量化するために、マウス生殖管上の2つの選択された点間のユークリッド距離の平均変化率を評価できるアルゴリズムを設計した。ポイント位置はMATLABソフトウェアのモーショントラッキングモジュールを使用して追跡されます。ユークリッド距離の計算に使用した MATLAB の対応するスクリプトは、補足資料にオンラインで提供されます。ポイントの位置は、モーション トラッキング手順を成功させるには非常に重要です。ペトリ皿の壁からの光反射はモーショントラッカーの注意をそらす可能性があり、ポイントをライトの1つに再割り当てしている間にホーンの動きを追跡しなくなる可能性があるため、ビデオの品質に関しては慎重に考慮する必要があります。反射。私たちは、それがペトリ皿の壁の反射から十分に遠いことを確認するために、ホーンの真ん中にポイントの1つを配置することを選択しました。第2の点は、通常、自発的な運動性を示さなかったので、膣上で選択された。図 3はデータ分析のサンプルを示し、補足図 1はモーション トラッキング中に取得した代表的な画像を示しています。

図 1: 生殖管の分離全体のステップ。(A)皮膚に切開を行い、腹膜領域を腹膜の上に露出させた(1)。(B)漿液膜をゆっくりと開いて消化管(2)を露出させる。(C) 消化管が動かされ、子宮角が露出する(3)。尿膀胱(4)は角の結合の近くで視覚化することができる。(D) 子宮角が解放され、陰部交体(5)の側面に切り傷がなされ、膣(6)が露出している。(E) 単離された生殖管の除去およびDPBS溶液への配置。余分な毛皮または結合組織を除去した。(F) 直腸を取り除いた後、膣(右)に深い凹みが見られる(左、7)。(G) 周囲の結合組織が除去される。デジタルカメラとアプリケーションスイートソフトウェア(バージョン3.7.0)を使用して、解剖中にリアルタイム画像を取得しました(カメラ設定:色相20/彩度80)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: 単離された生殖管全体を示す代表的な実験を示す。画像は、(A)の前、(B)の間、および(C)1 μMエピネフリンの適用の後に15s離れて撮影した。生殖管製剤は、エピネフリンの不在時にパネルA及びCにおいて高い運動性を示したが、1μMエピネフリンの存在を伴うパネルBでは静止している。未編集のビデオ映像は、補足ビデオ1-3として提供されています.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: ex vivo実験におけるデータ分析図 2.(A) ユークリッド距離変化率のタイムコースを示す。自発的な子宮運動中に距離が決定された基準点は、インセットに緑色の点として示される。ポイントは、膣の近位部分と描かれた子宮角の中央セグメントで選択された。青い塗りつぶされた円は、エピネフリンを添加する前に自発的な運動率の値を示し、赤い円は1 μMエピネフリンの存在下で自発的な運動率を示し、緑色の塗りつぶされた円は洗い流された後の自発的な運動率を示す。(B) エピネフリン(青い棒)を添加する前の平均ユークリッド距離変化率(ピクセル/s)、1μMエピネフリン(赤い棒)の存在下、および洗い流し後(緑色のバー)の比較。MATLABソフトウェアは、子宮の運動性を定量するために使用されました。Δt間隔を5秒に設定した「ΔDistance」は、初期フレーム距離とフレーム距離5秒後の差として算出される。統計分析は、SigmaPlot 13を用いたダンの方法に従って、ランク上の分散の一方向分析を使用して行われ、その後、すべてのペアワイズ多重比較手順が行われました。アスタリスクは、他の実験データセットと有意に異なるデータ・セットを示します (P = <0.001)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ムービー1:1 μMエピネフリンを添加する前に自発的な子宮運動性を示すタイムラプスビデオクリップ。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。

補足ムービー2:クレブスバッファーが1μMエピネフリンで補充された場合の自発的な子宮運動を示すタイムラプスビデオクリップ。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。

補足ムービー3:洗い流した後の自発的な子宮運動を示すタイムラプスビデオクリップ。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。

補足図1:モーショントラッキング中に15sごとに撮影された代表的な画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足資料: MATLAB ベースの追跡アルゴリズム スクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は何も開示していない。