このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。
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この記事について
サマリー
要約
イノシトールリン酸塩およびホスホイノシチドは、遺伝子発現、小胞の人身売買、シグナル伝達、代謝、および発達を含む真核生物のいくつかの細胞プロセスを調節する。これらの代謝産物は、タンパク質に結合することによってこの調節活性を実行し、それによってタンパク質の立体構造、触媒活性、および/または相互作用を変化させる。ここで説明する方法は、質量分析またはウェスタンブロッティングに結合されたアフィニティクロマトグラフィーを使用して、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドと相互作用するタンパク質を同定する。イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドは、化学的にビオチンでタグ付けされ、その後、アガロースまたは磁気ビーズに結合したストレプトアビジンを介して捕捉される。タンパク質は、代謝物との結合の親和性によって単離され、次いで、質量分析またはウェスタンブロッティングによってタンパク化され、同定される。この方法は、感度が高く、非放射性、リポソームフリー、カスタマイズ可能なシンプルなワークフローを備えており、タンパク質と代謝産物の相互作用を精度で解析できます。このアプローチは、ラベルフリーまたはアミノ酸標識定量質量分析法で、複雑な生物学的試料中のタンパク質代謝産物相互作用を同定したり、精製されたタンパク質を使用したりするために使用できます。このプロトコルは、トリパノソマブルーサイからのタンパク質の分析のために最適化されていますが、関連する原虫寄生虫、酵母または哺乳動物細胞に適応することができます。
概要
イノシトールリン酸塩(IP)とホスホイノシチド(POI)は、遺伝子発現1、2、3、小胞の人身売買などの細胞プロセスの調節を通じて、白質生物生物学において中心的な役割を果たしている。4、信号伝達5、6、代謝7、8、9、および発達8、10。これらの代謝産物の調節機能は、タンパク質と相互作用し、したがってタンパク質機能を調節する能力から生じます.タンパク質によって結合すると、IPおよびピは、タンパク質立体構造11、触媒活性12、または相互作用13を変化させ、したがって細胞機能に影響を与える。IPおよびPは、核2、3、14、15、小平
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プロトコル
1. 親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティングによるIP結合タンパク質の解析
- 細胞増殖、リシスおよび親和性クロマトグラフィー
- T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。1つの結合アッセイには合計5.0 x 107細胞で十分です。
- 血流形態の場合、37°Cおよび5%CO2で10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したHMI-9培中の細胞を増殖させる。8.0 x 105から 1.6 x 106セル/mL の間のセル密度を維持します。
注: 1.8 x 106セル/mL より高い密度は、細胞の生存率に影響を与える可能性があります。インビトロで成長したT.brucei 427株の倍増時間は5.5〜6.5hの間である。 - プロ環状形態の場合、SDM-79培地で細胞を27°Cで10%FBSで補い、1.0 x 107と3.0 x 107細胞/mLの間の細胞密度を保つ。
- 精製タンパク質(例えば、組換えタンパク質)の場合、0.5~1 μgのタンパク質を摂取し、結合バッファーの450 μLで希釈する(25mM HEPES、150mM NaCl、0.2%4-ノンニルフェニルポリエチレングリコ....
- 血流形態の場合、37°Cおよび5%CO2で10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したHMI-9培中の細胞を増殖させる。8.0 x 105から 1.6 x 106セル/mL の間のセル密度を維持します。
- T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。1つの結合アッセイには合計5.0 x 107細胞で十分です。
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結果
親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティングによるRAP1とPI(3,4,5)P3相互作用の解析
この例は、この方法を用いて、T.ブルシー・リサートまたは組換えT.ブルーシーRAP1タンパク質からのRAP1による結合を分析する。ヘマグルチニン(HA)タグ付きRAP1を発現するT.ブルーセイ血流形態のライサテスを結合アッセイに用いた。RAP1は、変異面糖タンパク質(VSG)遺伝子3、48の転写制御に関与するタンパク質であり、これは抗原変動49による寄生虫免疫回避に関与する表面タンパク質についてコードする。RAP1は、ホスファチリノシトール5-ホスファターゼ(PIP5Pase)酵素3とテロメリックタンパク質複合体内で相互作用し、これはVSG遺伝子転写1、3の制御<.......
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ディスカッション
これらの代謝産物の細胞機能を理解するためには、IPまたはPに結合するタンパク質の同定が重要です。ウェスタンブロットまたは質量分析に結合されたアフィニティクロマトグラフィーは、IPまたはPI相互作用タンパク質を同定し、その調節機能に関する洞察を得る機会を提供します。IPまたはPは化学的にタグ付けされた[例えば、Ins(1,4,5)P3はビオチンに化学的にリンクされている]とストレプトアビジンを介してアガロースビーズに架橋またはストレプトアビジン磁気ビーズによって捕捉され、その後、質量によって識別することができる相互作用タンパク質の単離を可能にする分光またはウェスタンブロット。ここで説明するプロトコルは、これらの代謝産物に結合するT.brucei3、8および哺乳動物細胞47からのタンパク質を同定するために使用されている。(ビオチン以外の)カスタマイズされたタグを使用するアプローチのバリエーションは、酵母46でも使.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(NSERC、RGPIN-2019-04658)によって支援されました。NSERCディスカバリーは、初期のキャリア研究者のためのサプリメントを起動します (DGECR-2019-00081) とマギル大学.
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセトン | Sigma-Aldrich | 650501 | ケトン |
| アセトニトリル | Sigma-Aldrich | 271004 | 溶剤 |
| 重炭酸アンモニウム | Sigma-Aldrich | A6141 | 無機塩 |
| 遠心分離機 Avanti J6-MI | ベックマン・コールター | Avanti J6-MI | 大容量用遠心分離機 (例:1L) |
| 遠心分離機用ボトル | Sigma-Aldrich | B1408 | 培養物1Lの遠心分離用ボトル |
| コントロールビーズ | エシュロン | P-B000-1ml | アフィニティクロマトグラフィー試薬 - 制御 |
| D-(+)-グルコース | Sigma-Aldrich | G8270 | 糖、細胞の生存を維持するためにPBSに添加 |
| ジチオスレイトール(DTT) | バイオ・ラッド | 1610610 | 還元剤 |
| Dynabeads M-270 ストレプトアビジン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 65305 | ビオチンリガンド結合用ストレプトアーゼビーズ |
| EDTAフリープロテアーゼ阻害剤 カクテル | ロシュ | 11836170001 | プロテアーゼ阻害剤 |
| 電気泳動バッファー | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris、192 mM グリシン、0.1% SDS、pH 8.3 |
| ファルコン 15 mL 円錐形遠心分離チューブ | Corning Life Sciences | 430052 | 10 mL 培養液を遠心分離するには |
| ギ酸 | Sigma-Aldrich | 106526 | 酸性 |
| グリシン | Sigma-Aldrich | G7126 | アミノ酸 |
| HMI-9 細胞培養培地 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ME110145P1 | T. brucei 血流形態 |
| 用細胞培養培地Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE |
| Ins(1,4,5)P3 ビーズ | エシュロン | Q-B0145-1ml | アフィニティクロマトグラフィー試薬 |
| インスタント 無脂肪 ドライ ウェ | スタンブロッティング用 | Thomas Scientific | C837M64 |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides |
| Lab ローテーター | トーマス・サイエンティフィ | 1159Z92 | 結合アッセイ用 |
| LoBind 微量遠心チューブ | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 13-698-793 | 質量分析用低タンパク質結合チューブ |
| Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | 洗剤 |
| PBS、pH 7.4 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10010031 | |
| 化学発光用生理バッファーペルオキシダーゼ基質 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 32106 | ウェスタンブロッティング用基質 タンパク質のウェスタンブロッティング検出用 |
| PhosSTOP ホスファターゼ阻害剤 カクテル錠 | ロシュ | 4906845001 | ホスファターゼ阻害剤 |
| PI(3)P PIP ビーズ | エシュロン | P-B003a-1ml | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PI(3,4)P2 PIP ビーズ | エシュロン | P-B034a-1ml | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PI(3,4,5)P3 PIP ビーズ | エシュロン | P-B345a-1ml | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PI(3,5)P2 PIP ビーズ | エシュロン | P-B035a-1ml | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PI(4)P PIP ビーズ | エシュロン | P-B004a-1ml | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PI(4,5)P2 PIP ビーズ | エシュロン | P-B045a-1ml | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PI(5)P PIP ビーズ | エシュロン | P-B005a-1ml | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | タンパク質染色 (0.1% [w/v] in 5% 酢酸) |
| ヘキサシアノ鉄カリウム(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | カリウム塩 |
| PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | アフィニティークロマトグラフィー試薬 |
| PVDF メンブレン | Bio-Rad | 1620177 | ウェスタンブロッティング用 |
| 冷蔵遠心分離機 | Eppendorf | 5910 R | 微量遠心分離機 少量用(例:1.5 mL) |
| ドデシル硫酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | 862010 | 洗剤 |
| チオ硫酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | 72049 | 化学薬品 |
| SpeedVac 真空濃縮器 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | SPD120-115 | サンプル濃度(質量分析用など) |
| 細胞培養用T175フラスコ | ThermoFisher Scientific | 159910 | 50 mL T. brucei培養 |
| プシン、質量分析グレード | Promega | V5280 | タンパク質消化用トリプシン |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U5128 | 変性試薬 |
| Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | 混合反応用 |
| ウェスタンブロッティング転写バッファー | Bio-Rad | 1610734 | 25 mM トリス、192 mM グリシン、pH 8.3、20% メタノール |
| Whatman 3 mm 紙 | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | 紙 Wester 転写用 |
| 2-メルカプトエタノール (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | 還元剤 |
| 2x Laemmli サンプルバッファー | Bio-Rad | 161-0737 | タンパク質ローディングバッファー |
| 4–20%ミニプロティアン TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561094 | Gel for Protein Electrophoresis |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | タンパク質ローディングバッファー |
参考文献
- Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
- Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D.
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再版と許可
