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方法論記事

生細胞におけるフラ-2-アナログによる細胞内Ca2+測定に関する新規ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補正法

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DOI：

10.3791/59881

⸱

2019年9月20日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Ulsan College of Medicine/Asan Medical Center, 2Asan Medical Center, 3Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology

この記事について

サマリー

NADHとfura-2アナログの励起波長と発光波長のスペクトルが重なり合うため、[Ca2+]の定量測定中に生細胞内の両方の化学物質からの信号干渉は避けられません。そこで、NADH信号干渉を測定する新規なオンライン補正法「Ca2+」を開発した。

要約

[Ca2+]を定量的に測定するために、比率蛍素プローブであるフラ2アナログが頻繁に使用されます。しかし、色素の使用法は、主にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)からの自己蛍光干渉のために生細胞において本質的に制限される。具体的には、NADHの大部分がミトコンドリアにあるため、フラ-2アナログを定量的に用いてミトコンドリア[Ca2+]を測定する際の大きな障害となる。蛍光色素濃度が同じである場合、特定の励起強度は同じ発光強度を生成する必要があります。したがって、2つの異なる励起波長の発光強度比は一定でなければならない。この原理に基づき、NADH信号干渉を測定する新規なオンライン補正法「Ca2+」を開発し、NADHとフラ-2の実信号強度を得ることができる。また、400nmでイソスベスティック励起または励起を用いて「Ca2+」を計算する新規方程式を開発した。この方法では、ミトコンドリア[Ca2+]の変化を正常に測定することができました。さらに、励起波長と発光波長の異なるセットを用いて、NADH、[Ca2+]、およびpHまたはミトコンドリア膜電位(+m)を含む複数のパラメータを同時に測定することができる。ミトコンドリア[Ca2+]およびαmまたはpHを、フラ-2-FFおよびテトラメチルロダミンエチルエステルエステル(TMRE)またはカルボキシセミナフトローダフールフルオール-1(カルボキシ-SNARF-1)を用いて測定した。

概要

細胞内Ca2+の重要な役割は広く知られている1.[Ca2+]の定量化は、細胞の生理機能のプロセスを理解するために不可欠です。Fura-2アナログはUV範囲(<400 nm)で励起され、定量測定にレシオメトリック法を適用できるので非常に便利です。従って、pH、膜電位等の他の生理学的パラメータは、他の蛍光色素と共に測定することができる。ミトコンドリアCa2+濃度([Ca2+]m)の範囲は、伝えられるところでは0.08−20 μM2、3、4、5であった。フラ-2アナログの中でも、フラ2-FFは「Ca2+」のこの範囲の測定に適しています。しかし、生細胞には代謝過程にNADH/NADPHが含まれており、NADHはフラ-2アナログと励起と発光スペクトルが重なり合うため信号干渉を発生します。この干渉は、fura-2アナログの使用を大幅に制限します。具体的には、ミトコンドリア[Ca2+]を測定するためにアナログを適用した場合、NADHの最大量がミトコンドリアにあるため、この干渉が最大の障害となる。これは、ミトコンドリア膜電位(+m)に関連するNADHの変化によってさらに複雑になり、及びmの変化は[Ca2+]m 6、7、8に影響を与える,9.さらに、[Ca2+]mダイナミクスを研究するためには、NADH、αm、pHなどの他のミトコンドリアパラメータの状態を知る必要がある。

353 nm、361 nm、および 400 nm の励起を伴う 450 nm および 500 nm の放出には、NADH および fura-2-FF からの信号が含まれており、式は次のとおりです。ここで、353 nmおよび361nmは、それぞれ450nmおよび500nmでの排出に対するフラ2-FFのイソスベスティックポイントである。

F361,450 = F361,450,NADH + F361,450,フラ方程式 1
F353,500 = F353,500,NADH + F353,500,フラ方程式 2
F400,500 = F400,500,NADH + F400,500,フラ方程式 3

ここで、F x,yは x-nm 励起による y-nm での測定された発光強度であり、Fx,y,NADHは純粋な NADH 依存性発光強度を表し、Fx,y,Furaは純粋なフラ-2-FF 依存性発光強度を表します。蛍光色素の同じ濃度の下で、特定の励起強度は、同じ発光強度を生成する必要があります。したがって、2つの異なる励起波長の発光強度比は一定でなければならない。Ca2+およびフラ-2はNADH蛍光特性に影響を与えなかった。従って、NADHの450nmおよび500nmでの放出の比率は、任意の励起波長で一定であった。NADHまたは[Ca2+]がフラ-2-FFの放出および励起スペクトルに影響を与えないという仮定に基づいて、同じルールをフラ2-FFに使用することができます。しかし、Ca2+はフラ-2-FF放出のスペクトルシフトを引き起こした。したがって、Ca2+の効果を除去するには、Ca2+に依存しないイソスベスト励起を使用する必要があります。各発光波長(すなわち、450 nmおよび500 nm)は異なるアイソスベストポイントを有し、我々の実験セットアップから、500nmで353 nm、450nmで361nmを選択した。これらのことから、次の式は有効な 10です。

R= F361,450,フラ/F353,500,フラ方程式 4
RN1 = F400,500,NADH/F361,450,NADH方程式 5
RN2 = F353,500,NADH/F361,450,NADH式 6

これらの定数では、(式 1)(式2)および(式3)からの次の式が有効です。

F361,450 = F361,450,NADH + Rf × F353,500,フラ方程式 7
F353,450 = RN2 × F361,450,NADH + F353,500,フラ方程式 8
F400,500 = RN1 × F361,450,NADH + F400,500,フラ方程式 9

これらの式から、Rf、RN1、およびRN2が知られている場合、NADHおよびfura-2の純粋な信号は以下のように得ることができる。

F361,450,NADH = (F361,450 - Rf × F353,500)/(1 - Rf × RN2)式 10
F353,500,フラ= (RN2 × F361,450 - F353,500)/(Rf × RN2 - 1) 式 11
F400,500,フラ= F400,500 - RN1 × F361,450,NADH方程式 12
Rふら= F353,500,フラ/F400,500,フラ方程式 13

フラ-2-FFのCa2+結合形態は、400nm励起波長で実質的に非蛍光であった。このプロパティに基づいて、次の新しいキャリブレーション方程式を導き出すことができます。

[Ca2+] = Kd ∙ (F400,500,max/F353,500,max)× (Rフラ- R分)式 14

ここで、Kdは解離定数であり、F400,500、maxおよび F353,500、最大は、それぞれ 400 nm と 353 nm の励起を持つ 500 nm で放出された信号の最大値であり、Rminは Ca 2 の最小 Rフラです。+-フリー条件。アイソスベスティック励起を用いたので、この方程式は以下のようにさらに簡略化することができる。

[Ca2+] = Kd ∙ (1 / R分)∙ (Rフラ- R分)式 15

したがって、[Ca2+]を計算するために必要なのは Kdと R分の値だけです。

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プロトコル

すべての実験プロトコルは、地元の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. ソリューションの準備

  1. 単一の新たに単一分離された心臓筋細胞11を調調す。
    注: 各ラボには異なる細胞貯蔵ソリューションがある場合があります。ここで、筋細胞は培養培地(DMEM)に貯蔵される。
  2. Ca2+-フリー溶液の100 mLを準備します(表1)。
  3. 50mLビーカーで培養培地の50mLを調出します。アリコット5 mLと37 °Cで水浴に入れます。残りの溶液を室温に保ちます。
  4. Ca2+-フリー溶液の50 mLにサポニン5mgを添加してサポニン溶液の50 mLを調製する。
    注:サポニンは、心臓筋細胞を透過化し、サイトソリックコンパートメントを除去し、ミトコンドリア蛍光のみを視覚化するために使用されます。
  5. ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した1mMフラ-2-FF-AMの16 μLを調製する。
    注:2 mLチューブでDMSOとアリコート16 μLに溶解したフラ-2-FF-AMの1mMストック溶液を作ります。使用するまで-20°Cで保管してください。
  6. NADHフリーCa2+フリー溶液(表1)の50 mLとNADHフリーCa2+飽和溶液の50 mLを準備します(表1)。KOH で pH を 7.0 に調整します。
    注:NADHフリーCa2+フリーソリューション(表1)には、ミトコンドリアでNADHを最小限に抑えるために、ミトコンドリア基板なしで10μM FCCPおよび100 μM ADPが含まれています。
  7. Ca2+-フリー溶液の50 mL、50 mLのマラテ溶液、50 mLのピルビン酸溶液、50 mLのマル酸ピルビン酸溶液、およびNADH補正因子測定に使用するロテネン溶液の50 mLを調製する(表1)。

2. ミトコンドリアへのフルオロプローブのローディング手順

  1. 1mMのフラ-2-FF-AMの16 μLに培養培地の2mLを添加して染料ローディング液を調製する。
    注:蛍光色素は、光の下で壊れやすいです。使用する直前にソリューションを準備します。蛍光色素を含む溶液を暗い場所に保管してください。フラ-2-FF-AMの最終濃度は8μMです。カルボキシ-SNARF-1を使用した場合は、2 μMカルボキシ-SNARF-1-AMで染料ローディング溶液を準備します。
  2. 単離した細胞の2 mLを取り、直立した位置に5 mLの試験管に置く。
  3. 骨髄細胞が底に沈み、上清を取り除くのを15分間待ちます。
    注:上清は細胞の破片を含んでいるかもしれません。細胞の損傷を避けるためにチューブを遠心分離しないでください。
  4. 染料ローディング液の2 mLを追加します。
  5. 4°Cで60分間細胞で染料ローディング溶液をインキュベートします。
  6. 次いで、試験管を37°Cの水浴に30分間直立した位置に入れる。
  7. 上清を取り出し、37°Cの予温められた培地の4mLを加える。37°Cの水浴で60分間細胞をインキュベートします。
  8. 最後に、上清を取り出し、室温で培養剤を4mL加え、チューブを室温に保ちます。

3. マルチパラメトリック測定システムの導入

注:図 1は、システム全体の図を示しています。

  1. 励起光源の場合は、3ミリ秒以内に光を変化させることができる高速モノクローター(ポリクロムII)を使用します。
  2. 反転顕微鏡でオイル浸漬レンズ(40x、NA 1.3)を使用して信号強度を高めます。
  3. 近赤外線フィルタと電荷結合デバイス(CCD)カメラを使用して、蛍光信号干渉なしでオブジェクトフィールドを監視します。
  4. オブジェクト フィールド イメージをキャプチャして領域を取得します。
  5. 背景を減らすためのセルを表示するには、フィールドダイヤフラムを使用してモニタ画面のオブジェクトフィールドを調整します。
  6. 各バンドパスフィルタ(450、500、590、640 nm)を備えた4つのフォトマルチプライヤチューブを使用して、フォトン計数法で発光波長を検出します。適切なダイクロイック ミラーを使用して、放出光を分割およびリダイレクトします。
    注:励起光は発光光に比べて非常に強いです。したがって、背景を減らすために、最も高いブロッキング特性を持つバンドパスフィルタを選択します。フォトン計数システムは、PMT、フォトンカウンターユニット、高速カウンターの組み合わせで構成されています。システムを制御し、データをサンプリングするために、カスタムメイドの駆動ソフトウェアが使用されました。この方法を他のシステムに適用する方法を見つける必要があります。

4. マルチパラメトリック測定システムを用いるNADH補正方法

  1. フラ2-FFのアイソスベスティックポイントの同定
    注:多くのレポートは、蛍光特性が細胞で変化することを述べています。したがって、すべての手順を実行してパラメータを取得し、その中の干渉を修正します。
    1. 色素を積んだ細胞を顕微鏡に取り付け、3分間待って細胞を底に沈める。
      注: 40 倍の対物レンズを使用して、1 つの対物フィールドごとに約 1 セルを表示するようにセル数を調整します。
    2. NADHフリーCa2+フリー溶液を37°Cで浸透させる。
    3. セルをターゲットにした後、セクション 4.1 に示すように、セルのない背景とセル領域を測定します。セル領域からセルの背景を計算します。
      注:両方のバックグラウンド信号は、各実験で修正する必要があります。
    4. サポニン溶液を60秒に浸透させ、NADHフリーCa2+フリー溶液に戻ります。
    5. 0.1 nmステップで350nmから365nmまでの励起スキャンにより、450nmと500nmで同時にフラ2-FF放出信号を測定します。
    6. NADHフリーCa2+飽和溶液を浸透させ、ステップ4.2.5を繰り返します。
    7. Ca2+-飽和溶液の信号をCa2+-free条件の信号から差し引きます。
    8. 他の単一心筋細胞で4.2.2から4.2.7までの手順を繰り返します。
      注:信号強度が弱くなった場合は、4.2.1から繰り返します。少なくとも 5 つの異なるセルの手順を繰り返します。
    9. 得られたすべての信号から、各励起における放出の標準偏差を計算し、最小標準偏差(SD)値をアイソスベスティックポイントとして示す励起波長を選択します。
      注: 代表的な数値を図 2 に示します。
  2. 細胞領域を用いてのバックグラウンド信号検出と補正方法
    注:背景には2種類あります。1 つはセルから来て、もう 1 つはカバー スリップ (セルのない背景) の反射から来ます。両方の背景は、各実験で修正する必要があります。
    1. 顕微鏡の浴中に色素フリーの細胞を取り付け、3分間待って細胞を底に沈める。約5分間のNADHフリーCa2+-フリーソリューションを提供します。
      注:すべての溶液灌流速度は37°Cで2-3 mL/分です。
      注: 40 倍の対物レンズを使用して、1 つの対物フィールドごとに約 1 セルを表示するようにセル数を調整します。
    2. 対象セルをカバーするオブジェクト フィールドを設定します。
    3. セルをフィールドの外に移動した後、セルのないウィンドウのバックグラウンド信号を測定し、オフセットとして設定します。
      注:信号は、フォトン計数システムで検出される光信号を意味します。
    4. セルを初期位置に戻し、セルの背景信号とセル領域を測定します。
      注:励起光はバンドパスフィルタでフィルタリングされますが、フィルタリングされた光は非常に多く含まれています。この光は、細胞に当たると分散し、光子計数システムは高感度であるため、かなりのバックグラウンド信号を引き起こします。修正する必要があります。
      注:細胞領域は、キャプチャされた細胞画像および利用可能なイメージングソフトウェアを用いて計算されてもよい。セル領域の単位は、ピクセル数を含む任意の単位にすることができます。標準化が必要です。
    5. 4.1.1 から 4.1.4 まで 10 回繰り返して、セル領域とセルの背景信号の関係を取得します。
      注:後で、セルのバックグラウンド信号は、リレーションシップからセル領域から計算できます。励起電球は老化するので、この手順は、少なくとも毎月繰り返す必要があります。
  3. R因子の測定
    1. セクション4.2で得られた信号から方程式4でRfを計算します。
    2. 無色細胞を顕微鏡に取り付け、Ca2+フリー溶液を透過します。
    3. F 361、450、NADH、F 400、500、NADH、F 361、450、NADH、およびF 353、500、NADHなどの信号を測定します。
    4. マレート溶液を浸透させ、4.3.3を繰り返します。信号を測定します。
    5. ピルビン酸溶液を浸透させ、4.3.3を繰り返します。信号を測定します。
    6. マラテピルビン酸溶液を浸透させ、4.3.3を繰り返します。信号を測定します。
    7. ロテネ溶液を浸透させ、4.3.3を繰り返します。信号を測定します。
      注:5 mMピルビン酸、5 mMマラテプラス5mMピルビン酸、および10 μMロテノン添加に記録されたNADH信号の例を図3に示す。
    8. F 361、450、NADH対F400、500、NADHおよびF 361、450、NADH対F353、500、NADHの各傾きを計算する。 図 3に示すように。各勾配は RN1と RN2を示します。

5. TMREまたはカルボシー-SNARF-1の励起および発光光の選択

  1. さらにミトコンドリア電位を測定するためのTMREを用いれば、530nmの励起波長と590nm発光波長を用いる。
  2. さらにミトコンドリア電位を測定するためのカルボキシ-SNARF-1を用い、540nmの励起波長と590nm及び640nm12の発光波長を用いる。

6. フラ2-FFのKd値の選択

  1. pH の変更は、fura-2-FF10での Ca2+バインディングの Kd値に影響を与える可能性があります。ミトコンドリアの場合は pH 7.5 で 5.28 の Kd値を使用します。

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結果

ミトコンドリアCa2+修正による変更10
図4は、補正前後の[Ca2+]mの変化を示す。結果は明らかに[Ca2+]mの実質的な変化を示した。サイトソリックCa2+を含まないミトコンドリア安静カルシウム濃度は1.03±0.13μM(平均±S.E.、n=32)、最大[Ca2+]mは1μM[Ca2+]cで29.6±1.61μM( 平均 ±S.E., n = 33) (図 5)

NADH、[Ca2+]、及び10の同時測定
正に帯電したTMREは、膜電位依存的な方法で分配することができる。膜電位は、各コンパートメント...

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ディスカッション

干渉補正法は、NADHとフラ2アナログの信号を測定するために開発されました。信号の正確な測定は、正確な補正に不可欠です。しかし、蛍光装置の本来の性質は、フラ-2のNADHとは無関係の背景信号を生成する。最高品質のバンドパスフィルタは、光の不要な波長の10-8までしか通過できません。しかし、単一細胞からの蛍光シグナルは非常に小さく、バンドパスフィルタ後の励起光の反射は、実際の蛍光信号を汚染するのに十分な強さです。そのため、背景信号の慎重な補正が必要である。

Fura-2はミトコンドリアCa2+を測定するための負荷の問題を抱えている。第一に、ミトコンドリアに特に色素をロードすることは容易ではなく、非特異的な負荷を別の器官に誤りがある可能性がある。ミトコンドリアCa2+濃度は一般にサイトゾルよりも高く、Kd値が高いフラ-2-FFを使用すると、サイトソリックCa2+変化の汚染を回避できる。他の問題のあるオルガネラは、サルコプラズマ網炎(SR)である。しかしながら、分布量の違い(ラッ...

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開示事項

著者は、開示する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、文部科学省の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)の基礎科学研究プログラム(2018R1A6A3A01011832)、科学・ICT・未来計画省(NRF-2016M3C1A6936606)の支援を受けたものです。貿易産業省(10068076)によって。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<強力>2 mL エッペンドルフ チューブAxygenMCT-200-C2 mL チューブ
<強力>AD/DA コンバーターInstrutechITC-18機器
<強力>ADP、アデノシン 5′-二リン酸一カリウム塩二水和物Sigma-aldrichA5285化学薬品
<強力>バンドパスフィルターEaling Electro-Optics、Inc35-3920機器、640±11nm
バンドパスフィルターOmega Optical690-9823機器、590±15nm
バンドパスフィルターOmega Optical500DF20-9916機器、500±20nm
バンドパスフィルターChroma Technology Corp.60685機器、450±30nm
<強>塩化カルシウム溶液Sigma-aldrich21114化学薬品
<強>カルボキシ-SNARF-1(AM)InvitrogenC1272化学薬品
<強>電荷結合素子(CCD)カメラフィリップスFTM1800NH/HGI機器
<強>ダイクロイックミラークロマテクノロジー株式会社86009マルチバンド・ダイクロイック・ミラー・反射型機器 : <400nm、490±10, 560±10、トランスミッション:460±15, 510±20、>580nm
<強力>ダイクロイックミラークロマテクノロジー株式会社567DCXRU機器、反射 : <560nm、透過率:> 580nm
<強>ダイクロイックミラークロマテクノロジー480dclp機器、反射 : <470nm、透過率:> 490nm
<強>ダイクロイックミラークロマテクノロジー(株)20728マルチバンドダイクロイックミラー 反射 : <405nm、470nm;30、透過率:430nm~520nm、>640nm
<強>ジメチルスルホキシド(DMSO)シグマアルドリッチ154938ケミカル
ズ<強>DMEM、ダルベッコ」のモディファイドイーグル」s 中Sigma-aldrichD5030化学薬品
<強力>EGTA、エグタジン酸、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸Sigma-aldrichE4378化学薬品
FCCP、メソキサロニトリル 4-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾンSigma-aldrich21857化学薬品
<強>磁場ダイヤフラムニコン86506機器
<強>フラ-2-FF(AM)TEFLABS137化学薬品
<強>グリーンチューブDWM試験管
<強力>HEPES、  4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N′-(2-エタンスルホン酸))Sigma-aldrichH3375Chemicals
High-speed counterNational InstrumentsNI-6022Equipment
Hot mirrorChroma Technology Corp.21002機器、50:50<
強>倒立顕微鏡 >ニコンTE-300備品
<強>マラテシグマ・アルドリッチ27606化学薬品
<強>近赤外フィルター クロマ・テクノロジー・コーポレーションD750 / 100X機器、750±100nm
油浸レンズニコンMRF0140040倍、NA 1.3;装置
<ストロング>フォトンカウンターユニット浜松C3866装置
<ストロング>フォトンマルチプライヤ管浜松R2949装置
<ストロング>ポリクロニクスIIティルフォトニクスSA3/MG04装置
<ストロング>塩化カリウムメルク1.04936化学薬品
<強力>水酸化カリウム溶液シグマ・アルドリッチP4494化学薬品
<ストロング>ピルビン酸シグマ・アルドリッチ107360化学薬品
<ストロング>ロテノン>シグマ・アルドリッチR8875化学薬品
<ストロング>サポニン>シグマ・アルドリッチS4521化学薬品
<強>TMRE、テトラメチルローダミン、エチルエステル分子プローブT669化学薬
品

参考文献

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