Method Article

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

DOI:

10.3791/59883

⸱

September 28th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで提供されるプロトコルは、異なる組織および脳の様々な領域から分離されたミトコンドリアを有する異なるペプチドおよびタンパク質のネイティブ形態、プレフィブリル、および成熟したアミロイド線維の相互作用を調るためのプロトコルである。

Abstract

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ミトコンドリアなどの内部膜を含む膜透過性は、神経変性疾患におけるアミロイド凝集体誘発毒性の一般的な特徴および一次機構であることを示す証拠の増加体。しかし、膜破壊のメカニズムを説明するほとんどの報告はリン脂質モデルシステムに基づいており、生体膜レベルで発生する事象を直接標的とする研究はまれである。ここで説明するアミロイド毒性のメカニズムを膜レベルで研究するためのモデルである。ミトコンドリア単離のために、密度勾配媒体は、最小限のミエリン汚染で調製物を得るために使用されます。ミトコンドリア膜完全性確認後、α-シヌクレイン、ウシインスリン、および鶏卵白リゾザイム(HEWL)から生じるアミロイド線維の相互作用をラット脳ミトコンドリアと、インビトロ生物学的モデルとして調べた。結果は、線維アセンブリを有する脳ミトコンドリアの治療が異なる程度の膜透過性およびROS含有量増強を引き起こす可能性があることを示している。これは、アミロイド線維とミトコンドリア膜との間の構造依存的相互作用を示す。アミロイド線維の生物物理学的特性とミトコンドリア膜への特異的結合は、これらの観察の一部について説明を提供してもよいことが示唆される。

Introduction

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アミロイド関連障害は、アミロイドードとして知られており、異なる組織および器官における不溶性タンパク質沈着物の出現によって定義される疾患の大きなグループを構成する1、2。中でも、神経変性疾患は、タンパク質凝集体が中枢または末梢神経系2に現れる最も頻繁な形態である。アミロイド凝集体3の毒性に関与するメカニズムの数が提案されているが、アミロイド病理4の主なメカニズムとして細胞膜破壊および透過性を指摘する証拠の増大するボディは、 5.血漿膜に加えて、内部オルガネラ(すなわち、ミトコンドリア)も影響を受ける可能性があります。

興味深いことに、新しい証拠は、ミトコンドリア機能障害がアルツハイマー病およびパーキンソン病6、7を含む神経変性疾患の病因において重要な役割を果たしていることを示唆している。この問題に関連して、多くの報告は、ミトコンドリア8、9、10にアミロイドβ-ペプチド、α-シヌクレイン、ハンチンチン、およびALS....

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Protocol

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すべての動物実験は、テヘラン大学の医学の機関動物ケアと使用委員会(IACUC)に従って行われました。ギロチンブレードを研ぎ、刃の断固たる迅速な動きを適用することにより、ラットへの苦しみと有害な影響を最小限に抑えるために最大限の努力がなされました。

1. 脳の均質化とミトコンドリア分離

注:ミトコンドリア単離のためのすべての試薬は、シムズとアンダーソン14に従って調製されました。

  1. ミトコンドリア分離のためのバッファーの調製
    1. 100 mMトリス-HCl溶液を準備する:トリス-HClの0.605グラムの重量を量り、ビーカーで約40 mLの脱イオン水(DW)に溶解します。溶液を50 mLの容積フラスコに移し、DWを加えることで最終容積を50mLに増やします。
    2. 10 mM EDTA溶液を準備する:EDTAの0.202 gの重量を量り、ビーカーで約40 mLのDWに溶解します。溶液を50 mLの容積フラスコに移し、DWを加えることで最終容積を50mLに増やします。
      注:両方の溶液は、少なくとも4週間4°Cで保存することができます。
    3. トリス-HCl/EDTA/スクロースストックソリューションを準備する:ビーカーに10mMトリス-HClの30 mLと10mM EDTAの30 mLを追加します。スクロースの....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、インビトロ生物学的モデルとしてラット脳ミトコンドリアとのアミロイド線維の相互作用を研究するためのモデルを記述する。ミトコンドリア調製に関しては、15%(v/v)密度勾配培地を用いて、脳組織14の主要な汚染としてミエリンを除去した。図1Aに示すように、30,700 x gの遠心分離は、ミエリン(バンド1の主要成分)と、濃縮ミトコンドリア画分を含むバンド2の2つの異なるバンドを生成した。

シムズおよびアンダーソン14によって記述されたプロトコルを改変することにより、シナプスおよび非シナプスミトコンドリアの両方を含むミトコンドリア懸濁液が調製された。純粋な非シナプスミトコンドリアの調製のために、シムズとアンダーソンは以前にプロトコル14を詳述しました。遠心分離の最終段階で、10.......

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Discussion

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豊富な実験結果は、フィブリル凝集体の細胞毒性が生体膜4、5と相互作用し透過する能力と有意に関連しているという仮説を支持する。しかし、データのほとんどは、リン脂質およびタンパク質の多種多様な異種構造である生体膜の本質的特性を必ずしも反映しない人工脂質二層層に基づいています。ここで、脳ミトコンドリアをインビトロ生体膜として用いて、膜レベルで細胞傷害性を凝集する線維を研究するモデルについて説明する。

実験中は、機能的に活性なミトコンドリアを無傷の膜で準備するために、迅速に作業し、氷上のすべてを維持することが重要です。さらに、ミトコンドリア濃度(総タンパク質測定に基づく)は、膜アミロイド線維相互作用に影響を与える重要な要因である。したがって、プロトコル全体で一定に保つ必要があります。本研究では、ミトコンドリア製剤は、シナプスおよび非シナプスミトコンドリアの両方を含んでいた。純粋な非シナプスミトコンドリア製剤の場合、シムズおよびアンダーソン.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

Acknowledgements

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この研究は、イランのザンジャン基礎科学研究所(IASBS)の助成を受けました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートSigma35845
アンモニウムメルク1012171000
ブラック96ウェルプレートコーニング
ブラッククリアボトム96ウェルプレートコーニング
ウシインスリンΣI6634
ウシ血清アルブミン(BSA)シグマA2153
BSA基本的に脂肪酸を含まないシグマA6003
遠心分離機シグマクリスタル
クリアシーリングテープコーニング
CuSO4グマ451657
透析バッグ(2 KDaをカットオフ)シグマD2272
ダウンスホモジナイザーPotter Elvehjem
EDTASigmaE9884
蛍光プレートリーダーBioTek
蛍光分光光度計Cary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
GlycineSigmaG7126
ギロチンイラン製
HClメルクH1758
鶏卵白リゾチーム (HEWL)シグマL6876
Na2CO3シグマS7795
NaH2PO4シグマS7907
NaOHメルクS8045
オキサロ酢酸シグマO4126
パーコールGE ヘルスケア
リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)シグマCS0030
PMSFシグマP7626
カリウム酒石酸ナトリウムシグマ217255
石英キュベットシグマ
光度計ナSPEKOL 2000年モデル
ハク酸シグマS2378
スクロースメルク1076871000
サーモミキサーッペンドルフ
チオフラビンTシグマT3516
トリスHClメルク1082191000
トリトンX-100シグマT9284
トリプトンQUELAB
ウォーターバスメモリ
酵母エキスQUELAB
&β;-NADHシグマN8129
硫酸シ酒石酸分光分析ジェコエ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. L....

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