方法論記事

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

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DOI：

10.3791/59889

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2019年7月17日

 ,  ,  , 
1Faculty of Science, Charles University

この記事について

サマリー

ここでは、核分裂細胞および発芽酵母細胞の蛍光顕微鏡画像における脂質液滴の自動検出および定量的記述のMATLAB実装を提示する。

要約

脂質代謝とその調節は、基礎科学と応用ライフサイエンスとバイオテクノロジーの両方に関心があります。この点で、様々な酵母種は、脂質代謝研究または工業用脂質産生のモデルとして使用される。脂質液滴は非常に動的な貯蔵体であり、その細胞含有量は脂質代謝状態の便利な読み出しを表す。蛍光顕微鏡は、広く利用可能な装置に依存し、個々の脂質液滴の分析を可能にする細胞脂質液滴の定量分析のための選択方法です。さらに、顕微鏡画像解析を自動化できるため、全体的な分析スループットが大幅に向上します。ここでは、3つの異なるモデル酵母種における個々の脂質液滴の自動検出と定量的記述のための実験的および分析的ワークフローについて説明する:核分裂酵母シゾ糖菌ポンベとシゾ糖筋ジャポニクス、および発芽酵母サッカロマイセスセレビシエ.脂質液滴はBODIPY 493/503で可視化され、細胞不透過性蛍光デキストランを培養培養培養培養剤に添加し、細胞境界の特定に役立ちます。細胞は緑と青のチャネルで3D上蛍光顕微鏡に供され、得られたZスタック画像はMATLABパイプラインによって自動的に処理されます。この手順は、主要なスプレッドシートまたは統計パッケージの下流分析に適した表形式で、細胞脂質液滴含有量および個々の脂質液滴特性に関する豊富な定量データを出力します。細胞脂質代謝に影響を与える様々な条件下で脂質液滴含有量の分析例を提供する。

概要

脂質は、細胞エネルギーや炭素代謝、膜成分の合成、生理活性物質の産生に重要な役割を果たします。脂質代謝は、環境条件、栄養素の利用可能性および細胞周期フェーズ1に応じて微調整される。ヒトでは、脂質代謝は、肥満、II型糖尿病および癌2などの疾患に関連している。産業では、酵母などの微生物によって生成される脂質は、再生可能なディーゼル燃料3の有望な供給源を表す。細胞は、いわゆる脂質液滴(LD)に中性脂質を格納します。これらの進化的に保存された体は、トリアシルグリセロール、ステリルエステル、外側リン脂質単層および関連タンパク質1から構成される。LDsは小プラズム網膜に由来し、細胞周期または成長相力学を発揮し、細胞脂質恒常性1にとって重要である。LD番号および形態は、様々な成長条件下で脂質代謝をアッセイするとき、または変異体のパネルをスクリーニングする際に便利なプロキシとして使用することができる。そのダイナミックな性質を考えると、個々のLDの特性を分析することができる技術は、脂質代謝の研究に特に関心がある。

様々な酵母種は、脂質関連代謝経路およびその調節を記述するために使用されてきた、または興味深い化合物または燃料1を生成するためにバイオテクノロジーで使用されている。さらに、発芽酵母サッカロマイセスセレビシエや遠く関連する分裂酵母シゾサッカロマイセスポンベなどのモデル酵母については、ゲノム全体の欠失歪みライブラリを高スループットに使用できる利用可能です。画面4,5.最近、Ld組成物とダイナミクスはS.pombe6,7,8,9に記載されており、脂質代謝に関連する変異体は、新興モデル酵母中に単離されている。シゾサッカロマイセスジャポニカス10.

LDの内容とダイナミクスを研究するために、数多くの技術が利用可能です。ほとんどはナイルレッドやBODIPY 493/503などの親油性染料でLDのいくつかの種類の染色を採用しています。後者は、より狭い励起および放出スペクトルを示し、リン脂質(膜)11とは対照的に中性脂質(LD)に対する特異性の増加を示す。フッ素測定およびフローサイトメトリー法は、貯蔵脂質含有量12、13、14、15に影響を与える遺伝子および成長条件を明らかにするために、様々な真菌種で成功して使用されてきた。これらの方法はハイスループットアプリケーションに適していますが、細胞内の個々のLDの数と形態を測定することはできません。コヒーレントラマン散乱またはデジタルホログラフィック顕微鏡は、LDレベルのデータを生成するラベルフリーの方法ですが、特殊な高価な機器16、17、18を必要とします。一方、蛍光顕微鏡は、一般的に利用可能な機器や画像解析ソフトウェアツールを利用しながら、LD含有量に関する詳細なデータを提供することができます。画像データからのセル/LD検出における様々な高度化と自動化を特徴とするいくつかの解析ワークフローが存在し、大きなLDを持つメタゾン細胞など、異なる細胞タイプに最適化されています 19,20,21, または発芽酵母17,22,23.これらのアプローチの一部は、2D(例えば、最大投影画像)でのみ動作し、セルラーLD含有量を確実に記述できない場合があります。我々の知るうる場合、核分裂酵母顕微鏡データからLD含有量と形態を決定するためのツールは存在しない。自動化された堅牢なLDレベルの分析の開発は、感度の向上と高められた統計力をもたらし、理想的には複数の酵母種で、中性脂質含有量に関する豊富な情報を提供します。

酵母細胞の3D蛍光顕微鏡画像からLD含有量解析のワークフローを開発しました。生細胞は、BODIPY 493/503とカスケードブルーデキトランで染色され、それぞれLDを可視化し、細胞境界を決定します。細胞はガラススライド上に固定化され、標準的なエピ蛍光顕微鏡を使用してZスタックイメージングを行います。画像は、統計分析のために広く使用されている(商用)パッケージであるMATLABに実装された自動化されたパイプラインによって処理されます。パイプラインは、イメージ前処理、セグメンテーション (セルと背景、死んだセルの除去)、および LD 識別を実行します。LD サイズや蛍光強度などのリッチ LD レベルのデータは、主要なスプレッドシート ソフトウェア ツールと互換性のある表形式で提供されます。このワークフローは、S.pombe24における脂質代謝に対する窒素源の利用可能性の影響を決定するために正常に使用された。次に、細胞の LD 含有量に影響を与える成長条件または変異体を使用して、S. pombe、S. japonicusおよび S. cerevisiaeのワークフローの機能を示します。

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プロトコル

1. ソリューションとメディアの準備

  1. 脂質染色液を調作する。
    1. ストック脂質染色液溶解液を調剤し、10mLの無水DMSO(最終濃度1mg/mL)でBODIPY 493/503の10mgを溶解させる。計量中の材料の損失を防ぐために10 mg BODIPY 493/503バイアルの全体の内容物を溶解します。
      注意:DMSOは皮膚を通過することがある。適切な個人用保護具を着用してください。
    2. 1mg/mL BODIPY 493/503ストック溶液の100μLと無水DMSOの900 μL(最終濃度0.1mg/mL)を混合して働く脂質染色液を調作する。
    3. アリコートストックと作業ソリューションを、-20 °Cで保存します。
      注:溶解BODIPY 493/503は-20°Cで数年間安定しています。しかし、溶液は、水分と光から保護する必要があります。
  2. 細胞境界可視化のためのストック溶液を調剤するために、脱イオン水の2.5 mL(最終濃度10mg/mL)にカスケードブルーデキストラン(全バイアル)の25mgを溶解する。アリコートストック溶液を使用し、光から保護された-20°Cで保存します。
  3. 顕微鏡スライドコーティング溶液を調剤するには、脱イオン水の5mL(最終濃度1mg/mL)に大豆レクチン5mgを溶解する。レクチン溶液をアリコートし、-80°Cで保存します。
    注:レクチン溶液は-80°Cで数年間安定している。現在使用中のアリコットは-20°Cで保存してもよい。
  4. 栽培メディアを準備します。
    1. S.ポンベおよびS.ジャポニカス用の複雑なYES栽培培地の400mLを調剤するために、500mLボトルとオートクレーブで脱イオン水の340mLに酵母エキス2gとSPサプリメント0.1g(補助栄養変異体に必要な場合)を溶解する。無菌状態で別途オートクレーブまたはフィルター殺菌ブドウ糖の20%(w/v)の60 mLを追加します。
    2. S.ポンベとS.ジャポニカス用に400mLのEMM栽培培地を用意し、500mLボトルとオートクレーブで脱イオン水の360mLにデキストロースなしでEMMブロスの4.9gを溶解する。無菌状態で別途オートクレーブまたはフィルター殺菌ブドウ糖の20%(w/v)の40 mLを追加します。
      注:S.ポンベおよびS.ジャポニカス栽培に関する一般的なガイドラインについては、それぞれ25及び26を参照してください。
    3. サッカロマイセスセレビシエのための複雑なYPAD栽培培地の300mLを調剤するには、500mLボトルとオートクレーブで脱イオン水の270mLに酵母エキス3g、ペプトン6g、アデニン硫酸30mgを溶解する。無菌状態で別途オートクレーブまたはフィルター殺菌ブドウ糖の20%(w/v)の30 mLを追加します。
    4. S.セレビシエに対して定義された最小培地の300mLを調剤するには、500mLボトルとオートクレーブに脱イオン水の270mLに酵母窒素塩基(アミノ酸なし)の2gを溶解する。無菌状態で別途オートクレーブまたはフィルター殺菌ブドウ糖の20%(w/v)の30 mLを追加します。
      注:S.セレビシエ栽培に関する一般的なガイドラインについては、27を参照してください。

2. 細胞培養

  1. 指数または早期静止段階にS.ポンベまたはS.ジャポニカスを成長させる。
    1. 午前中は、新鮮な核分裂酵母バイオマスでYES培地の5mLを接種する。32°Cで32°Cで、数時間振盪(180rpm)でインキュベートします。
      注:すべての栽培のために、適切な通気を確保するために、培養量の10倍の量を有するErlenmeyerフラスコを使用してください。一部の実験室では30°Cで核分裂酵母を増殖させることを好むが、32°Cの栽培温度は細胞に有害な影響を及ぼさずに倍増時間を短縮し、実験を行うために必要な総時間を短縮する25、28.
    2. 同日の午後遅く(少なくとも6時間の培養後)、新鮮なYES培地で培養物を10mLの最終培養量に希釈し、翌朝に所望の光学密度(OD)(または細胞数/mL)に達するようにし、32°Cでインキュベートします。ホーキング(180 rpm)。希釈係数を正確に決定するために、各使用済みひずみの倍増時間を知っておく利点があります(式1を使用)。
      figure-protocol-1
      V培養が希釈に必要な前培養量である場合、Vファイナルは新培養の総体積(標準栽培の場合は10mL)であり、OD確定は、到達する所望のODである。翌朝、OD電流は、前培養の現在測定されたODであり、tは収穫までの細胞増殖の時間であり、遅れは遅れ期の持続時間である(実験室の状態に依存し、する必要がある経験的に定義される)とt DTは、歪みの倍増時間です。
      注:指数相細胞を分析する場合、これは劇的にいくつかの後の世代のための細胞生理学(LD含有量を含む)を変化させるので、前培養物が静止期に達しないようにしてください。
    3. イメージング日の午前中に、培養物が必要以上に高いODに達した場合(指数相細胞の場合)、新鮮なYESで希釈し、LDの染色前に少なくとも2倍の時間インキュベーションを続けます。染色(セクション3)。
  2. 指数および静止段階にS.セレビシエを成長させる。
    1. 午後には、少量の新鮮な発芽酵母バイオマスでYPAD培地の10mLを接種し、振盪(180rpm)で30°Cで一晩インキュベートします。
    2. 撮像日の朝、YPAD培地の10mLで培養をOD0.1に希釈し、必要なOD(例えば、指数相のOD1)に成長する。手順 2.1.2 で説明されているように、カルチャの希釈を実行します。染色に進みます(セクション3)。

3. 脂質滴染色

  1. 画像化する各サンプルに顕微鏡カバースリップを準備します。水平に配置されたピペット先端の長い側面を使用してきれいなカバースリップにスライドコーティング溶液の1 μLを広げます。コーティング溶液を完全に乾燥させ、カバースリップをほこりのない環境に保管します。
    注:ガラススライドとカバースリップは、必要に応じて使用前に洗浄することができます。洗浄手順は、食器用洗剤による洗浄、水洗い、塩酸3%で一晩浸漬、蒸留水で洗浄することで構成されています。洗浄されたスライドおよびカバースリップは使用されるまで純粋なエタノールで貯えられる。
  2. 必要に応じて、細胞培養のODまたは細胞数/mLを測定します。同等の実験条件を確保するために、すべてのテストされた株の間で同様の値に到達してみてください。
  3. 各細胞培養のピペット1mLを1.5mLマイクロ遠心管にする。S.セレビシエのみの場合は、スライドコーティング液の5μLを加え、渦を短時間加え、5分間振盪で30°Cでインキュベートします。
  4. 各培養アリコートおよび渦に脂質染色溶液の1 μLを短時間加加する。次に、細胞境界可視化溶液と渦の10 μLを簡単に追加します。
    注:これはBODIPY 493/503の蛍光消光につながるので、両方の汚れの予め混合溶液を調製しないでください。
  5. 遠心分離(1,000 x g、3分、RT)で細胞を回収し、ほぼすべての上清(〜950 μL)を除去します。 残りの上清中の細胞を再中断する。
  6. レクチンコーティングされたカバースリップ上の緻密な細胞懸濁液のピペット2 μLを、きれいな顕微鏡スライドの上に置きます。細胞は単層を形成する必要があります。イメージングにおけるアーティファクトを最小限に抑えるために、顕微鏡検査(セクション4)にできるだけ早く進みます。一度に最大 2 つのサンプルを処理します。

4. 顕微鏡とイメージングの設定

  1. イメージング条件を最適化します。
    注:    顕微鏡をセットアップするには、サンプルに損傷を与え、結果を歪める可能性のある強力な光源への長時間の露出が必要です。したがって、LD定量にさらに使用されない専用のサンプルスライドを使用して撮像条件を設定する。
    1. 位相コントラストまたは差動干渉コントラスト(DIC)を使用してセルに焦点を当てます。
      注:位相コントラストまたはDICイメージは参照用に撮影できますが、自動画像解析ステップでは使用されません。
    2. z スタック設定をセルボリューム全体に設定します。合計垂直距離は、セルのサイズによって異なります。光学スライスの数は、目的の数値絞り(Z軸の点広がり関数)に依存します。中心焦点面を基準にしてフォーカスを設定します。
      注:スライスの最適な数は、多くの場合、顕微鏡制御ソフトウェアによって設定され、手動で計算する必要はありません。典型的な細胞幅は、S.ポンベの場合は3~5μm、S.ジャポニカスでは4~7μm、S.セレビシエでは3~7μmです。
    3. 画像化するには、緑色のチャネルで光の強度と露光時間を設定します(BODIPYの励起と放出最大値はそれぞれ493 nmと503nmです)。
      注:BODIPY 493/503は非常に明るいフルオロクロムです。しかし、それは過度に強い光強度で急速に漂白されることがあります。さらに、LDはライブセル内で可動式であるため、露光時間を最小限に抑え、最初に(青チャンネルに切り替える前に)完全なグリーンチャンネルZスタックをキャプチャして、アーティファクトのぼやけを防ぎます。また、飽和ピクセルを避けるために、信号強度のカメラの線形範囲を考慮してください。
    4. セル境界をイメージするには、青色チャネルで光強度と露光時間を設定します(カスケードブルーデキストランの励起と発光最大値はそれぞれ400nmと420nmです)。
      注:青色チャネルの信号強度は画像セグメンテーションには必要ですが、LD定量自体には使用されません。したがって、このチャネルの最適な設定は、解析に重要ではありません。
    5. 可能であれば、標準化された条件下で複数のサンプルのイメージングを容易にするために、顕微鏡制御ソフトウェアで自動化された実験ワークフローを作成します。
  2. イメージング条件が最適化されると、画像サンプルを定量に使用します。手順 4.1 で説明したように、セルに焦点を当て、緑と青のチャネルでセルをイメージします。
    注:サンプル間の比較を可能にするには、すべてのイメージを同じ設定で取得する必要があります。サンプルごとに複数の視野をイメージし、堅牢で代表的なデータを取得します。
  3. 青と緑のチャネル Z スタック イメージを 16 ビット多層 TIFF ファイル (つまり、視野ごとに 2 つのファイル) として保存します。対応するファイル名に "緑" または "青" という単語を含めます。画像解析を続行します(セクション5)。

5. 画像解析

  1. 取得した画像の品質を視覚的に確認します。
    1. ImageJ 29、30またはその他の適切な画像解析ソフトウェアで顕微鏡画像を開きます。
    2. 取得中に移動した多数のセルを含むイメージ スタックを削除します (したがって、ぼやけたアーティファクトが作成されます)。
    3. 青色チャネル内の高蛍光非細胞粒子を含む画像スタック(例えば、顕微鏡スライドやカバースリップの汚れ、栽培培地の不純物)を除去する。
      注:青いチャネル内の非常に明るい非細胞オブジェクトは、細胞検出アーティファクトを作成したり、その近傍の細胞の検出を妨げる可能性があります。
    4. 死細胞の大部分を含む画像スタック(すなわち、生細胞と比較して青色蛍光が増加した細胞)を除去する。
      注:サンプル中の死んだ細胞の小さな割合の存在は、通常は問題ではなく、これらの細胞は分析中に自動的に破棄されますが、一部の死んだ細胞または死んでいる細胞は、セグメンテーションアルゴリズムによって生細胞として認識されることがあります。報告された結果をスキューします。
  2. MATLABソフトウェアで画像を分析します。
    1. メイン フォルダを作成し、すべての MATLAB スクリプトをこの場所にコピーします。
    2. サブフォルダ(「ポンベ」、「セレビシエ」または「ジャポニカス」)を作成し、入力したTIFFイメージファイルをこの場所にコピーします。
    3. MATLAB を起動し、スクリプト MAIN.m を開いて実行します。メニューでは、分析する酵母種を選択し、画像処理を開始する。
      注:細胞およびLD検出に必要なパラメータのいくつかは、特定の種に対して事前に設定され、他のものは画像処理中に自動的に決定される。あらかじめ設定された値は経験的に決定され、客観的な倍率、カメラの種類と感度、イメージング設定など、いくつかの要因に依存します。必要に応じて、ユーザーはスクリプト ファイルを編集して、実験設定をより良く反映するように生物固有のプリセットを変更できます。すなわち、細胞認識時に許容されるオブジェクトサイズは「minArea」および「maxArea」パラメータによって与えられ、オブジェクト境界内の充填ボリュームの最小部分は「Solidity」パラメータによって与えられます。LD認識の場合、明るさのしきい値は「th」パラメータ(その値は主に画像ビット深度と蛍光信号強度によって影響されます)によって与えられ、最大許容LDサイズは「MaxArea」パラメータによって与えられます。
    4. スプレッドシート エディタまたは統計パッケージを使用して、必要に応じて出力ファイルを検査して処理します。ワークフローは、セミコロン区切り CSV ファイルを生成し、検出されたセル オブジェクトと LD を持つセグメント化された TIFF ファイルを生成します。
      注:ワークフローでは、イメージを背景オブジェクトとセル オブジェクトに分割し、各セル オブジェクトを複数の隣接セルで構成できます。したがって、"xxxx_cells.csv" ファイルの出力は単一セル データを表すものではなく、セル単位のボリュームメトリックの計算にのみ使用する必要があります。

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結果

全体の手順は、核分裂酵母の図1に要約され(発芽酵母ワークフローは類似している)、以下に、ワークフローが知られている様々な条件下で3つの異なる酵母種のLD含有量を研究するために使用することができる方法の例を提供します。セルラー LD 含有量に影響を与えます。各例は、単一の生物学的実験を表す。

figure-results-1
図1:実験および分析ワークフローの概略図。核分裂酵母のワークフローを例に示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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ディスカッション

脂質代謝とその調節の理解は、基礎生物学と臨床およびバイオテクノロジーの応用の両方にとって重要です。LD含有量は、細胞の脂質代謝状態の読み出しを表し、蛍光顕微鏡はLD含有量決定に用いられる主要な方法の1つである。提示されたプロトコルは、3つの異なる形態的に異なる酵母種における個々のLDの自動検出および定量的記述を可能にする。私たちの知る場合、核分裂酵母に対する同様のツールは存在しません。画像処理に必要な MATLAB スクリプトは補足ファイルとして含まれており、Figshare リポジトリ (DOI 10.6084/m9.figshare.7745738) と共に、この原稿からのすべての生および処理された画像および表形式のデータと共に利用できます。CSV 出力ファイルの詳細な説明、およびダウンストリーム データ分析と視覚化用の R スクリプト。また、最新バージョンの MATLAB スクリプトは GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis) から入手できます。

成功したLD分析は、得られた生蛍光画像の品質に大...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、チャールズ大学助成金PRIMUS/MED/26、GAUK 1308217とSVV 260310によってサポートされました。私たちは、画像解析パイプラインの顕微鏡検査と開発に関するOndéej Sebestaに感謝します。私たちは、S.セレビシエ株のためのReGenExラボ、およびS.ジャポニカス株のためのJapoNetとニキヒロノリの研究室に感謝します。ppc1-88株は、酵母遺伝資源センタージャパンによって提供された。顕微鏡検査は、欧州地域開発基金とチェコ共和国の国家予算(プロジェクトNo.)が共同出資する共焦点・蛍光顕微鏡検査所で行われました。CZ.1.05/4.1.00/16.0347およびCZ 2.16/3.1.00/21515)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12ビット単色CCDカメラ 浜松 ORCA C4742-80-12AG浜松 または同等のもの
アデニン半硫酸塩、≥99%メルクA9126-25G 
BODIPY 493/503 (4,4-ジフルオロ-1,3,5,7,8-ペンタメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン)サーモフィッシャーサイエンティフィックD3922中性脂質染色
用 D-(+) - グルコース、≥99.5%メルクG7021 
デキストラン、カスケードブルー、10,000 MW、アニオン性、リジン固定可能なサーモフィッシャーサイエンティフィックD1976、細胞の陰性染色用
ジメチルスルホキシド、≥99.5%メルクD4540のモレキュラーシーブEMMブロスで無水物を保つ
Formedium PMD0405培地は、個々のコンポーネントから調製することもできます
フィジー/ImageJソフトウェアNIH または同等のもの、顕微鏡データの目視検査用
高精度カバーガラス、22 mm x 22 mm、No 1.5VWR630-2186は、任意の#1.5カバーガラスを使用します
MATLAB 用画像処理ツールボックス、バージョン 10.0Mathworks  
上の細胞固定化のためのGlycine max(大豆)MerckL1395
MATLABソフトウェア、バージョン9.2Mathworks  
顕微鏡スライド、26 mm x 76 mm、厚さ1 mmガラスL762601.2、顕微鏡のステージに適合する任意の顕微鏡スライドを使用し、細胞をロードする前に徹底的に清掃
オリンパスCellR顕微鏡 自動z軸対物レンズ運動オリンパス または同等のもの
ペンタバンド フィルター セットSemrockF66-985明視野、緑、青のチャンネルで十分です
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4Mathworks  
SPサプリメントFormediumPSU0101 
MATLABを実行できる標準的なオフィスコンピュータ   
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1Mathworks  
微生物学のためのユニバーサルペプトンM66ク1070431000 
UPLSAPO 60XO対物レンズオリンパス または同等のもの
酵母エキスFormediumYEA03 
アミノ酸を含まない酵母窒素塩基FormediumCYN0405 
以上の純度、デキストロースなしスライドからのレクチンニットはします メル

参考文献

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