この記事は、マクロファージを引き付けるために腫瘍細胞から条件付き培地の能力を評価するのに有用なインビトロアッセイを表す。
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この記事について
サマリー
要約
腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、異なるタイプの癌に対する腫瘍塊の細胞の大部分を占める。神経膠芽腫(GBM)は、治療法のない悪性脳腫瘍であり、腫瘍塊の半分までである。TAMは、細胞内の特定の遺伝子の活性化に応じて、腫瘍前または抗腫瘍でありうたることができる。腫瘍における遺伝的変異は、サイトカイン発現を調節することにより、腫瘍微小環境へのAMの募集に影響を与える可能性がある。ここでは、腫瘍細胞からの条件付き培地によるマクロファージ募集を評価する定量的細胞ベースアッセイについて説明する。このアッセイは、ヒトマクロファージ細胞株MV-4-11を用いて、神経膠芽腫からの条件付き培地によるマクロファージの引力を研究し、高い再現性と低変動性を可能にする。このアッセイで生成されたデータは、腫瘍と腫瘍微小環境との相互作用のより良い理解に寄与することができる。同様のアッセイは、T細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む腫瘍細胞と他の免疫細胞との相互作用を評価するために使用することができる。
概要
マクロファージは、高い催奇形性と機能的不均一性1を有する免疫細胞である。彼らは宿主防衛システム、組織修復、発達および腫瘍進行1で重要な役割を果たす。TAMは固形腫瘍の微小環境におけるマクロファージである。特定のTAmは、T細胞媒介性細胞傷害活性を阻害し、腫瘍微小環境(TME)を調節し、血管新生、侵来および転移を促進することを通じて腫瘍増殖を促進することができる2、3、4、5.TMEはTMEの中で最も豊富な細胞型の一つであり、より多くのTAMは一般的に多くのタイプの固形腫瘍6の悪い患者生存と相関する。腫瘍細胞の明確な遺伝的特徴は、マクロファージを募集する能力に影響を与える。GBMでは、治療法のない積極的な脳腫瘍では、マクロファージは腫瘍質量7の半分まで表すことができる。表皮成長因子受容体(EGFR)とその切り捨て変異体EGFRvIIIの共増幅は、腫瘍成長の利点を付与するGBMで頻繁に観察され、8.EGFRおよ....
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プロトコル
1. 中程度の準備
-
無血清幹細胞培地の調製
- 50x B27サプリメントを解凍し、表皮成長因子(EGF、0.1%BSAで10mM酢酸で20μg/mL)、線維芽細胞増殖因子(FGF、0.1%BSAで10mM酢酸で20μg/mL)を解凍する。
- EGFの500 μL(最終濃度20ng/mL)、FGFの500 μL(最終濃度20ng/mL)、10mLの50x B27~500mLのダルベッコの改変イーグル中型/栄養混合物F-12(DMEM/F12)、100xペンリン/ペニンの5mLを加えます。ボトルを4~6回反転して混ぜ、500mL 0.1μmの濾過カップを通して殺菌します。ボトルに印を付け、4 °Cに保管してください。
注:媒体は4°Cで1ヶ月まで使用するのに良いです。
- MV-4-11培養培地を調製する:イスコベの改変ダルベッコ培地(IMDM)の500mLに50mLのウシ血清(FBS)を加える。ボトルを4~6回反転して混ぜ、500mL 0.1μmの濾過カップを通して殺菌します。ボトルに印を付け、4 °Cに保管してください。
注:媒体は4°Cで1ヶ月まで使用するのに良いです。 - 腫瘍細胞維持培地を調味する:ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の500mLにFBSの50mLを加える。ボトルを4~6回反転....
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結果
結果は通常、棒グラフを介して表示されます (図 1に示す例)。480/520 の値が高いサンプルは、条件付きメディアがマクロファージを募集する能力が高いことを示します。実験的なニーズに応じて、追加のコントロールを含めることができます。例えば、中和抗体を使用して、条件付き培った培膜を治療してマクロファージケモタキシスを廃止し、同じアッセイを行うことができます。また、条件付きメディアに余分なケモカイン(CCL2)を追加することもでき、これは正のコントロールとして機能します。
図1:EgFRとEGFRvIIIを共発現するU87細胞からの条件付き培養培地は、対照ベクターを発現するU87細胞よりも多くのマクロファージ、また.......
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ディスカッション
このプロトコルでは、いくつかの重要なステップがあります:1)トランスウェルインサートの選択。MV-4-11細胞株の場合、5μmトランスウェルインサートはうまく機能します。しかし、一般的に使用される単球細胞株THP-1のような他の細胞株の場合、異なる細孔サイズがより良く働くかもしれません。2)異なる細胞株が異なる速度で成長するにつれて、セル番号に応じて条件付き媒体の体積を調整することが重要である。この目的のために、同じ実験条件下でインキュベートされた無細胞培温を用いて、条件付き培養培具を希釈することができる。3)FBSはサイトカインを含有する。上室にMV-4-11細胞を播種するために無血清培地を使用することが重要です。ここで FBS を使用すると、細胞の移行が観察されない場合があります。
研究者は、異なるアプリケーションに対してこのアッセイを変更できます。例えば、他の腫瘍細胞は、一次患者由来異種移植片培養物、またはマウス細胞のいずれかが、上記の例で使用される脳腫瘍細胞株を置換することができる。マクロファージ細胞株は、特定の必要性に応じて、患者またはマウスからの一次マクロファージまたは.......
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開示事項
ウィリアム・A・ワイスはステムシナジー・セラピューティクスの共同創設者です。Zhenyi Anは何も開示する必要はありません。
謝辞
助成金:Z.Aは、アレックスのレモネードスタンド財団、米国脳腫瘍協会、NIH T32CA108462、サンドラー財団が部分的に資金提供している画期的な生物医学研究プログラムから支援を受けました。W. ワイスは、NIH助成金R01CA221969、R01NS091620、P50CA097257、U01CA217864、P30CA82103によってサポートされました。サミュエル・G・ワックスマン癌研究財団;そして、エブリンとマッティ・アンダーソン・チェア。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.1 μmろ過カップ | サーモフィ | ッシャー566-0010 | |
| 0.45 μm フィルターユニット | ミリポア | SLHA033SS | |
| 10 mL 血清ピペット | オリンパスのプラスチック | 12-104 | |
| 15 mL 滅菌遠心チューブ | オリンパスのプラスチック | 28-103 | |
| 1 mL ピペットチップ | ART 分子バイオプロダクツ | 2779-RI | |
| 2 mL 吸引ピペット | ファルコン | 357558 | |
| 24ウェルプレート | ミリポア | ECM507 | ECM507の一部、または別途購入可能 |
| 4x 溶解バッファー | ミリポア | ECM507 | ECM507の一部、または別途購入可能 |
| 5 μm トランズウェルインサート | ミリポア | ECM507 | ECM507の一部、または別途購入可能 |
| 75 cm2フラスコ | コーニング | 430641U | |
| アキュターゼ | 革新的な細胞技術 | AT-104 | |
| B27 | ギブコ | 12587-010 | |
| CyQuant 染料 | ミリポア | ECM507 | ECM507の一部、または別途購入可能 |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| ペン連鎖球菌 | Gibco | 15140-122 | |
| トリパン ブルー | バイオラード | 1450021 |
参考文献
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Front....
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再版と許可
