格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

リアルタイムで3次元細胞表面に人身売買し、拡散する分子の正確なダイナミクスは、解決するための謎でした。顕微鏡は常に速度、感度、および分解能のバランスをとってきました。1 つまたは 2 つが最大化されている場合、3 つ目は最小化されます。したがって、表面受容体が移動する小型および膨大な速度のために、そのダイナミクスを追跡することは、細胞生物学の分野における大きな技術的課題であり続けています。例えば、多くの研究は、全内部反射蛍光(TIRF)^{顕微鏡1、2、3}を用いて行われ、時間分解能は高いが、T細胞膜の非常に薄いスライス(約100nm)しか画像化できないため、細胞内で遠くに起こる事象を見逃す。これらのTIRF画像はまた、細胞の2次元断面のみを示す。対照的に、ストカスティック光学再構成顕微鏡^(STORM)4、光活性化局在顕微鏡(PALM)5、刺激発光枯渇顕微鏡(STED)6などの超解像技術は、光のアッベ回折限界を克服できる。これらの技術は、高い空間分解能(~20 nmの解像度^{)4、5、6、7}を有するが、それらは多くの場合、完全な2次元(2D)または3次元(3D)画像を取得するために、時間分解能が失われる。さらに、点滅する信号に依存するSTORMやPALMなどの技術は、^{カウント8、9}に不正確を持つ可能性があります。電子顕微鏡法は、はるかに最高の解像度(最大50 pm解像度⁾¹⁰を有する。集積イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)で3次元的に行うことさえでき、最大3nm XYおよび500nmZ分解能¹¹を生じる。しかし、電子顕微鏡の任意の形態は、過酷なサンプル調製を必要とし、時間をかけてライブサンプルをイメージングする可能性を排除し、固定細胞または組織でのみ行うことができます。

真の生理的3Dの性質において、生細胞における表面および細胞内分子のダイナミクスを同定するために必要な高い時空間分解能を得るための技術は、最近開発されたばかりです。その一つがラティス光シート顕微鏡(LLSM)12で、構造型ライトシートを利用して光の漂白を大幅に低減する。ノーベル賞受賞者エリック・ベツィヒによって2014年に開発され、高軸解像度、低いフォトブリーチングとバックグラウンドノイズ、および視野ごとに数百の平面を同時に画像化する能力は、LLS顕微鏡を広視野、TIRFおよび共焦点顕微鏡12、13、14、15、16、17、19^に優れています。この4次元(x、y、zおよび時間)イメージング技術は、まだ回折が限られている(約200 nm XYZ解像度)、3D空間取得のための信じられないほどの時間分解能(約100fpsのフレームレートを達成し、フレームあたり0.85秒の3D再構築された細胞像をもたらす)を有する。

LLSMは、一般に、単一分子および単一細胞レベル、特に免疫細胞のような高い可動細胞における任意の細胞内の任意の分子のリアルタイムダイナミクスを追跡するために使用することができる。例えば、ここではLLSMを使用してT細胞受容体(TCR)ダイナミクスを視覚化する方法を示します。T細胞は、適応免疫系のエフェクター細胞である。TCは、抗原提示細胞(APC)の表面に表示されるペプチドMHC(pMHC)リガンドを認識し、T細胞の選択、発達、分化、運命、機能を決定します。この認識は、T細胞とAPCの界面で起こり、局所的な受容体クラスタリングが免疫学的シナプスと呼ばれるものを形成する。免疫シナプスのTCRはT細胞エフェクター機能に不可欠であると知られているが、シナプスへのリアルタイムTCR人身売買の根本的なメカニズムはまだ不明である。LLSM は、結果として得られた pMHC-TCR インタラクションを使用して、シナプスへの入稿の前後に TCR のダイナミクスをリアルタイムで視覚化することを可能にしました (図 1)。LLSMは、TCの形成力学の現在の問題を解決し、細胞が自己抗原と外来抗原をどのように区別するかを理解するための洞察を提供するために使用することができる。

5C.B10におけるC7 TCRトランスジェニックRAG2ノックアウトマウス。シカゴ大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って、この研究で背景が使用されました。

1. T細胞の収穫と活性化

注: プロトコルのこの部分は、以前のプロトコルに基づいています。詳細^20、21の引用を参照してください。

1. 10-12週齢の5Cを安楽死させる。C7のトランスジェニックマウスは、承認されたIACUCプロトコルに従って(〜20〜25g)、承認されたIACUCプロトコル(すなわち_、CO2チャンバーの後に頚部脱臼が続く)に従った。
2. 70%エタノールでマウスの死骸を十分にスプレーしてファーを浸し、BSL-2安全キャビネットに持ち込みます。
3. マウスを右側に回し、手術用はさみで体腔内に小さな切開を行います。手術用鉗子を使って脾臓を取り除く。必要に応じて、外科的はさみで結合組織を切り取ります。
4. 脾臓を70μmの細孔メッシュセルストレーナーに入れ、1mLシリンジプランジャーの背面でつぶします。完全なRPMI(10%ウシ胎児血清[FBS]、2 mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、50 μM 2-メルカプトエタノール)でストレーナーを十分に洗浄します。
5. 脾細胞の単細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。
   注:この時点のペレットは赤になります。
6. 脾細胞を5 mL RBCリシス緩衝液中に再懸濁させる。5分間インキュベートし、その後、完全なRPMIの5 mLでクエンチします。
7. 脾細胞の単細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。
   注:この時点のペレットは、赤ではなく白でなければなりません。
8. 完全なRPMIの5 mLでペレットを再懸濁します。
9. T-25フラスコに移し、10 μMの蛾シトクロムC(MCC、配列ANERADLIAYLKQATK)を加える。細胞を培養培養器に37°C、5%CO2で一晩入れる。
10. 翌日、組換えマウス IL-2 を最終濃度 100 U/mL に加えます。
11. 次の日を観察し、現在のメディアが黄色に変わると、新しいメディアを追加します。T細胞は黄色の培地に放置して48時間以上放置すると死んでしまい、細胞は収穫後6-10日を使用する準備ができています。

2. セルの準備

1. 0.1%ポリLリジンを10分間5mmラウンドカバースリップにインキュベートし、自然乾燥させます。
2. 密度勾配試薬(材料表を参照)を使用して、死細胞を分離し、1 x 10⁶ T細胞と1 x 10⁶ APC(CH27細胞^21、22細胞質mCherryでトランスデュース)を別々に得ます。
   注: 細胞は、ヘモサイトメーターを使用してカウントされます。
   1. 密度勾配試薬の3 mLを15 mL円錐形チューブに加え、細胞をチューブの縁に滴下して慎重に加えます。を混在させないでください。4 °Cで10分間930 x gで遠心分離。加速/減速を使用する:遅い/遅い。完全な培地と密度勾配試薬の間の薄い中層の細胞を慎重に取り除き、各細胞タイプを別々の円錐形のチューブに入れます。
      注:プロセス中に平均50%が失われていることが分かるように、イメージングに必要以上の細胞を準備する必要があります。プロセスに使用されるセルが多いほど、密度勾配から細胞を簡単に収穫できます。我々は、余分な細胞を確保するために、両方の細胞タイプの4-8 mLを使用しています。必要に応じて、この手順の前にセルをカウントして、必要な量を確保できます。余分な細胞は、それぞれのフラスコに戻されます。
   2. T細胞とCH27細胞の両チューブを5 mLの完全なRPMI(5分間300 x g)で3回洗浄します。洗浄中に毎回上清を捨てます。各チューブを1 mL完全なRPMIで再懸濁し、細胞をヘモサイトメーターでカウントします。
3. 500 μL 完全 RPMI で 1 x 10^{6 APC}を再サスペンドし、10 μM MCC を追加します。37 °C、5% CO₂で 3 時間インキュベートします。500 μL の完全な RPMI (300 x g 5 分) で細胞を 3 回洗浄します。上清を捨てます。
4. 500 μL 完全 RPMI で 1 x 10⁶ T 細胞を再サスペンドします。500 μLの細胞に抗TCRβAlexa488標識Fab(クローンH57)を2μg添加する。37 °Cで30分間インキュベートし_、5%CO2。500 μLのRPMI(5分間300 x g)で細胞を3回洗浄します。洗った後に上清を捨てる。
   注:二価抗TCR抗体を、二価抗体によるT細胞受容体の架橋を避けるためにFab調製キット(材料表を参照)を用いて1価Fabに切断した(このステップは任意である)。
5. 両方の細胞タイプを500μLのイメージング培地(フェノール赤フリーのライボヴィッツのL-15培地、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン)で再懸濁します。

3. LLSMデイリーアライメントの実施

注: (重要) このアライメント プロトコルは、使用される LLSM 計測器に基づいています(資料表を参照)。LLSM はそれぞれ異なっていて、異なるアライメント戦略、特にホーム ビルドされた方法が必要です。適切なルーチンアライメントを実行し、セクション4に進みます。

1. 10 mLの水と30μLのフルオレセイン(1mg/mLストック)をLLSMバス(約10mL)に加え、画像(ホーム)を押して画像位置に目標を移動し、単一のベッセルレーザービームパターンを見ます。ガイドと事前に設定された関心領域(ROI)を使用してレーザービームを整列させ、ビームを細いパターンをすべての方向に平衡させます。
   1. ビームはファインダーカメラに集まったように見えるはずです。2つのミラーチルトアジャスタ、トップマイクロメータ、フォーカス、および放出目的のカラーを使用して調整します。正しく整列されたビームについては、図2A、Bを参照してください。
2. フルオレセインを完全に除去するために、少なくとも200 mLの水で浴と目的を洗います。
3. 画像の標準蛍光ビーズ(ポリL-リジンで5mmのカバースリップにビーズを付けて調製する)は、材料の表を参照してください。
   注:後で処理するために表示できるビーズは1つしかないので、ビューア内にあるか、簡単に切り取って1つのビーズを得ることができるビーズを見つけてみてください。
   1. [X ガルボ範囲] ボックスで 3 に設定してディザをオンにします。現在のフィールドを表示するには、Liveキーを押します。Z 方向に沿って移動して、カバー スリップとビーズを見つけます。Zに沿って移動してビーズの中心を見つけ、停止を押してレーザーを一時停止します。3Dを確認し、中央キーを押してから実行キーを押します。これにより、データが収集されます。
   2. チルトミラー、目標カラー、フォーカスマイクロメータを手動で調整してグレーの最高値を調整し、必要に応じて目標スキャン、z galvo、z +objective (totPSF)、サンプルスキャン(samplePSF)キャプチャモードの適切なパターンを取得します。適切に調整された最大強度プロジェクション(MIP)については、図2のC-Fを参照してください。
      注: さまざまなキャプチャ モード(目的スキャン、z galvo、z+目標、サンプル スキャン)によって、ライトシートがサンプル内を移動する方法が変わります。すべてのスキャンモードは、配置に使用する必要があります。
   3. サンプル スキャンでは、実験中にデータがどのように収集されるかが示されます。サンプル PSF を収集するには、サンプル スキャン モードで[実行]を押して、デスキューおよびデコンボリューションを行います (セクション 5 を参照)。レーザーを3色モード(488、560、647)に変更し、もう一度[実行]を押します。
      注: 角度(57.2°)の LLSM 画像なので、「サンプルスキャン」モードで撮影された画像はこの角度で収集されるため、「歪む」。スキュー解除とは、この角度を補正し、イメージを真の Z スタックに「再整列」するプロセスです。これらのデータは、イメージングメディアと実験中に画像化されるすべてのチャンネルで収集する必要があります。これが正しく収集されない場合、データは正しく歪みなくなります。同様に、媒体が37°C(または所望の実験温度)に加温されていることを確認してください。

4. LLSM を使用したセルの設定

1. ステップ 2.5 からステップ 2.1 から 5 mm の直径の円形カバースリップに 100,000 APC (50 μL) を追加し、10 分間落ち着くようにします。
2. サンプルホルダーをグリースし、カバースリップセルサイドアップを加えます。お風呂に入れる前に泡を避けるために、カバースリップの背面に画像媒体の滴を追加します。サンプルホルダーをピエゾにねじ込み、イメージ(ホーム)を押します。
3. 画像化するAPCを見つけて、LLSMおよびイメージングソフトウェア(資料表を参照)が正しく機能していることを確認します。
   注: 0.4 μm のステップサイズで、ディザが 3 に設定された 2 色の場合は、0.4 μm のステップ サイズと 10 ミリ秒の露出を使用し、その結果、3D イメージのフレームあたり 1.54 秒 (~200 nm XY および 400 nm Z 解像度) になります。これらの設定は、使用する蛍光標識技術からのセルサイズ、所望のZ分解能、およびシグナルの強さに基づいて調整する必要があります。レーザー電力の使用も、使用する蛍光標識技術によって異なります。
   1. 現在の画像を表示するには、ライブを押します。Z に沿って移動して、カバー スリップとセルを探します。
   2. Z 方向に移動して APC の中心を探し、[Stop]を押してレーザーを一時停止します。3Dを確認し、必要な設定を入力します (手順 4.3.1 を参照) 、[中央]を押してから[実行]を押します。これにより、データが収集されます。
4. ステージを下げて位置を読み込み、画像媒体に50 μLのT細胞を加えます(ステップ2.5から100,000個の細胞)がカバースリップの上に直接滴下されます。ピペットの先端の端にドロップフォームを入れて、お風呂の液体に先端を触れるのが最善です。「画像(戻る)」をクリックしてステージを上げます。
5. イメージングを開始します。必要なスタック サイズと時間経過の長さを設定してください。たとえば、0.4 μm のステップ サイズで 60 z スタックをイメージし、500 のタイムフレームを入力します。(通常)フォトブリーチを避けるために500フレームに達する前に記録を停止します。Liveモードを使用してセルペアを検索し、準備が整い、必要な設定が入力されたら、「実行」を押してデータを収集します。例については、ムービー 1および図 1を参照してください。

5. 表面ダイナミクスを追跡する

1. イメージング ソフトウェアからデータをエクスポートします(資料の表を参照)。これにより、各色の各時点に対して Z スタック TIF ファイルが作成されます。
2. まず、データをデスキューしてデコンボルします。
   注: 私たちは、HHMIのJaneliaリサーチキャンパス¹⁸のライセンスの下でLLSpyパイプラインを使用していますが、複数のイメージングソフトウェア内でデスキューとデコンボルションも利用可能です(資料の表を参照)。
3. データをデブリーチします。
   注:私たちはヒストグラムマッチングでフィジーのデブリーチ機能を使用しています(フィジーパスウェイ:画像 |調整 |漂白矯正 |ヒストグラムマッチング |OKです)。
4. トラッキングソフトウェアにインポートします(資料表を参照)。ソフトウェア仕様に従ってクラスタを追跡します。例については、ムービー 2 を参照してください。
   注:追跡結果は、使用するトラッキングソフトウェア、選択したアルゴリズム、選択された希望の出力パラメータなどによって異なります。たとえば、使用した追跡ソフトウェア (マテリアルの表を参照) では、TCR クラスターは完全な球体に編成されていないので、各フィーチャに 1 つのスポットを割り当てるのではなく、不規則な形状を追跡することをソフトウェアに許可することを選択しました。さらに、速度、方向、体積、強度、面積、位置、トラックの継続時間情報を含む35のパラメータを収集することを選択しました。ただし、異なる方法やパラメータは、異なる質問に答えるために有益です。
   1. トラッキングが必要ない場合は、フィジー向け ClearVolume プラグインを使用して、ハイパースタックデータからムービーを視覚化し、作成します。

ここでは、主マウス5Cの分離、調製、およびイメージングについて説明する。C7T細胞は格子光シート顕微鏡を用いた。セクション3の間に、顕微鏡を正しく整列させ、収集後にデータをデコンボルするPSFを毎日収集することが不可欠です。図2では、顕微鏡を整列させると正しい位置合わせ画像が表示されます。図2Aと図2Bは、フルオレセインで画像化した場合の正しいビーム経路とビームアライメントをそれぞれ示す。客観的なスキャンは、XZ および YZ 投影に大きな X 形状を示す必要があります。また、これはできるだけ小さい X に調整する必要があります (図 2C)。これは主に、排出目標カラーを調整することによって達成されます。z galvo スキャンでは、XZ と XY の楕円形が、両側に単一のドット (XZ の場合は上と下、YZ の場合は左右) で表示されます (図 2D)。これは、主に手動またはソフトウェアの電動調整で、ガルボミラーの傾きを調整することによって達成されます。最後に、z+目的スキャンとサンプルスキャンの両方に、できるだけ丸く見えるドットが表示されます(図2Eと図2F)。これらは小さなXを持っているかもしれませんが、これは可能な限り混乱する必要があります。客観的なスキャンとzガルボがうまく設定されている場合、これらはよく整列する必要がありますが、調整が必要な場合は、主にガルボミラーで行われます。このアライメント中、カラーとガルボが調整されるたびに、焦点(放出目標より上のマイクロメートル)も同様に調整する必要があることに注意してください。

このプロトコルを使用すると、T細胞表面上のTCの4次元ダイナミクスが見られます(図1、映画1)。この顕微鏡の主な利点は、TCの可視化された表面単位を追跡し、そのサイズ、動き、信号強度などから定量化されたデータを得る能力にあります(資料表を参照)。ムービー2は、取得したトラックの一例を示す。

図1:T細胞-APCシナプスの4次元イメージング(A)APCと相互作用するT細胞を示す代表的な例3DタイムラプスLLSM画像。示されているのは、APCの表面に提示された抗原(赤、細胞質mCherry)を認識する際のTCR(緑色、抗TCR-AF488によって標識される)のダイナミクスである。スケールバー = 5 μm映画1も参照してください。(B) 直交 XY スライスの (A)。インセットは、セル全体の参照フレームです。スケールバー = 5 μm(C) 直交YZスライス (A).インセットは、セル全体の参照フレームです。スケールバー = 5 μm(D) (A) の二重直交スライス。インセットは、セル全体の参照フレームです。スケールバー = 5 μm映画3も参照してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: LLSM アライメント(A) LLSMイメージング実験に必要なビームパターン。(B) ビームアライメントプロセスのスクリーンショット。左側は、狭くされた焦点を絞ったビームを示すフォーカスウィンドウです。右上には、梁が窓内の中央に配置されていることを示すグラフがあります。右下にはファインダーカメラがあり、細く焦点を合わせるビームでなければなりません。(C) 客観的スキャンによるビードの最大強度予測(MIP)。(D) z-galvo スキャンによるビーズの最大強度予測 (MIP)。(E) Z+ 目的スキャンによるビードの最大強度予測 (MIP)。(F) サンプルスキャンによるビードの最大強度プロジェクション(MIP)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

動画1:T細胞シナプス形成。αTCR-AF488(緑)で標識されたT細胞と、1.54秒間隔で70時間のポイントにわたって細胞質mCherry(赤)を発現するターゲットAPCとの相互作用の2色のボリュームレンダリング。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

ムービー 2: TCR ダイナミック モーションをトラッキングする。ムービー 1と比較する 。可視TCR構造に対応するクラスタは、イメージングソフトウェアを用いて3Dで追跡された。前の 4 つのフレームに対してクラスターの位置を示すドラゴンの尾は、変位長によって色分けされます。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

動画3:T細胞シナプスの直交スライス。ムービー 1および図 1B-Dと比較します。ムービー 1の二重直交スライスは、αTCRβ-AF488 Fabが実際に細胞表面TCRsを標識していることを示す。スケールバー = 5 μmこのビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

著者たちは開示するものは何もない。