格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

Summary

このプロトコルの目的は、ラティス光シート顕微鏡を使用して、生細胞の表面受容体ダイナミクスを4次元的に可視化する方法を示すことを目的としています。ここで、CD4+一次T細胞上のT細胞受容体が示されている。

Abstract

細胞のシグナル伝達と機能は、その表面受容体の動的構造および相互作用によって決定される。これらの受容体の構造と機能の関係を実際に理解するには、十分な時空間分解能で生きた細胞表面上でそれらを視覚化し、追跡する必要があります。ここでは、最近開発したラティス光シート顕微鏡(LLSM)を使用して、生細胞膜でT細胞受容体(TCR)を4次元(4D、空間、時間)で画像化する方法を示します。T細胞は適応免疫系の主要なエフェクター細胞の一つであり、ここではT細胞のシグナル伝達および機能がTCRの動態および相互作用によって駆動されることを示す例としてT細胞を使用した。LLSMは、前例のない時空間分解能で4Dイメージングを可能にします。したがって、この顕微鏡技術は、生物学において異なる細胞の表面または細胞内分子の広い配列に一般的に適用することができる。

Introduction

リアルタイムで3次元細胞表面に人身売買し、拡散する分子の正確なダイナミクスは、解決するための謎でした。顕微鏡は常に速度、感度、および分解能のバランスをとってきました。1 つまたは 2 つが最大化されている場合、3 つ目は最小化されます。したがって、表面受容体が移動する小型および膨大な速度のために、そのダイナミクスを追跡することは、細胞生物学の分野における大きな技術的課題であり続けています。例えば、多くの研究は、全内部反射蛍光(TIRF)^{顕微鏡1、2、3}を用いて行われ、時間分解能は高いが、T細胞膜の非常に薄いスライス(約100nm)しか画像化できないため、細胞内で遠くに起こる事象を見逃す。これらのTIRF画像はまた、細胞の2次元断面のみを示す。対照的に、ストカスティック光学再構成顕微鏡^(STORM)4、光活性化局在顕微鏡(PALM)5、刺激発光枯渇顕微鏡(STED)6などの超解像技術は、光のアッベ回折限界を克服できる。これらの技術は、高い空間分解能(~20 nmの解像度^{)4、5、6、7}

Protocol

5C.B10におけるC7 TCRトランスジェニックRAG2ノックアウトマウス。シカゴ大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って、この研究で背景が使用されました。

1. T細胞の収穫と活性化

注: プロトコルのこの部分は、以前のプロトコルに基づいています。詳細^20、21の引用を参照してください。

1. 10-12週齢の5Cを安楽死させる。C7のトランスジェニックマウスは、承認されたIACUCプロトコルに従って(〜20〜25g)、承認されたIACUCプロトコル(すなわち_、CO2チャンバーの後に頚部脱臼が続く)に従った。
2. 70%エタノールでマウスの死骸を十分にスプレーしてファーを浸し、BSL-2安全キャビネットに持ち込みます。
3. マウスを右側に回し、手術用はさみで体腔内に小さな切開を行います。手術用鉗子を使って脾臓を取り除く。必要に応じて、外科的はさみで結合組織を切り取ります。
4. 脾臓を70μmの細孔メッシュセルストレーナーに入れ、1mLシリンジプランジャーの背面でつぶします。完全なRPMI(10%ウシ胎児血清[FBS]、2 mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、50 μM 2....

Results

ここでは、主マウス5Cの分離、調製、およびイメージングについて説明する。C7T細胞は格子光シート顕微鏡を用いた。セクション3の間に、顕微鏡を正しく整列させ、収集後にデータをデコンボルするPSFを毎日収集することが不可欠です。図2では、顕微鏡を整列させると正しい位置合わせ画像が表示されます。図2Aと図2Bは、フルオレセインで画像化した場合の正しいビーム経路とビームアライメントをそれぞれ示す。客観的なスキャンは、XZ および YZ 投影に大きな X 形状を示す必要があります。また、これはできるだけ小さい X に調整する必要があります (図 2C)。これは主に、排出目標カラーを調整することによって達成されます。z galvo スキャンでは、XZ と XY の楕円形が、両側に単一のドット (XZ の場合は上と.......

Discussion

提示されたプロトコルは、5Cから分離されたCD4⁺ T細胞の使用に最適化された。使用されるLLSM機器上のC7トランスジェニックマウス、したがって他の細胞システムとLLSMは異なる方法で最適化する必要があるかもしれません。しかし、このプロトコルは、生理学的条件下で最も歪みが少ない細胞全体の表面受容体のダイナミクスを定量化するために使用することができるため、4Dイメージングのパワーを示す。したがって、この技術の将来の多くの応用があります。

重要なステップは、細胞が適切な濃度で沈降できるようにすることです。カバースリップに多くのAPCが落ち着き、密度が高くなりすぎると、単一のAPCと相互作用しているTセルを見つけるのは難しいです。T細胞に複数のシナプスがある場合、データの追跡と解釈は非常に複雑になる可能性があります。同様に、APCが少なすぎると、シナプスを形成するT細胞を見つけることも困難である。私たちの手の中で、50,000個の細胞が10分間落ち着くことを可能にすることは最適な密度を達成する。ただし、付着細胞を持つシステムを使用する場合、この問題は回避できます。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL シリンジ	BD	309659	T 細胞採取用
2-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	T 細胞培養用
5 mm 丸型カバーガラス	World Precision Instruments	502040	イメージング用
70um 滅菌細胞ストレーナー	Corning	7201431	T 細胞採取用
Alexa Fluor 488 抗マウス TCR &β; 鎖抗体	BioLegend	109215
ウシ胎児血清 (FBS)	X&Y細胞培養	FBS-500	T細胞培養用
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	T細胞採取用デニスティグラジエント試薬
フルオレセインナトリウム塩	Sigma-Aldrich	F6377	顕微鏡アライメント用
FluoSpheres カルボン酸修飾マイクロスフェア	サーモフィッシャーサイエンティフィック	F8810	顕微鏡アライメント用
イマリス	ビットプレーン	N/A	追跡ソフトウェア;追跡ソフトウェアの他のオプションには、AmiraまたはTrackmate(フィジー)が含まれます。
格子ライトシート顕微鏡	3i	N/A	顕微鏡
LeibovitzのL-15媒体を使用し、フェノールレッドなし	イメージング用サーモフィッシャー科学	21083027
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25030-081	T細胞培養用
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpyは、ハワードヒューズ医学研究所、ジャネリアリサーチキャンパスからのライセンスの下で使用されました。アクセスについては、innovation@janelia.hhmi.org にお問い合わせください。他のデコンボリューションおよびデクソーイング方法は、Fiji、Slidebook、Amiraなどの画像処理ソフトウェアで利用できます。https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
>蛾 シトクロムC (MCC)、配列 ANERADLIAYLKQATK	エリンビオ	カスタム合成	細胞収穫用
ペナシリン/ストレプタマイシン	ライフテクノロジー	15140122_3683884612	T細胞培養用
ポリ-L-リジン	フェニックス 研究製品	P8920-100ML	イメージング用
RBC 溶解バッファー	eBioscience	00-4300-54	T細胞収穫用
組換えマウス IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	T細胞培養用
RPMI 1640 培地	コーニング	MT10040CV	T細胞培養用
Slidebook	3i	N/A	LLSMイメージングソフトウェア
外科解剖ツール	Nova-Tech International	DSET10	T細胞収穫用
T-25フラスコ	エッペンドルフ	2231710126	T細胞培養用
サーモサイエンティフィック ピアス ファブ マイクロプレパレーションキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	44685	ファブの準備用