方法論記事

アラビドプシス二重受精における精子核形態をたどる受精状態の評価

DOI：

10.3791/59916

⸱

2019年8月29日

 , 
1Graduate School of Horticulture, Chiba University

この記事について

サマリー

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アラビドプシス二重受精における精子核形態に基づいて成功または失敗した受精を決定する方法をエピ蛍光顕微鏡で示す。

要約

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開花植物は、「二重受精」と呼ばれるユニークな性的再生システムを持っており、それぞれの精子細胞が卵細胞または中央細胞と正確に融合します。したがって、2つの独立した受精イベントがほぼ同時に起こる。受精卵細胞と中枢細胞はそれぞれザイゴットとエンドスパームに発達する。したがって、二重受精の正確な制御は、その後の種子開発のために不可欠です。二重受精は、深く隠され、厚い卵巣および卵巣組織で覆われている女性のゲームトフィート(胚嚢)で起こる。この雌しべ組織構造は、二重受精の観察と分析を非常に困難にし、二重受精のメカニズムに関する多くの疑問が未解決のままである現状を作成しました。受精レギュレータ候補の機能評価には、受精の見型分析が重要である。アラビドプシス・タリアナにおける受精の完了を判断するために、精子核を標識する蛍光シグナルの形状が指標として用いられる。受精に失敗した精子細胞は、メスのゲーテの外側に凝縮された蛍光信号によって示されるのに対し、正常に受精する精子細胞は、女性のゲーテの核を持つカルヨガミーによる凝縮信号によって示される。ここで説明する方法は、生体内条件下での受精の成功または失敗を決定するツールを提供する。

概要

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開花植物は、二重受精を介して種子を生成し、ゲーム血漿膜1、2に局在するタンパク質間の相互作用によって直接制御されるプロセスである。開花植物オスのガメ、精子細胞のペアは、花粉で発症します。受粉後に成長する花粉管は、雌のゲーム、卵細胞、胚嚢で発達する中央細胞に精子細胞のペアを提供します。オスとメスのゲームが出会った後、ゲームの表面のタンパク質は、認識、付着、融合を促進し、二重受精を完了します。これまでの研究では、オスのガメテ膜タンパク質生成細胞特異的1(GCS1)/HAPLESS2(HAP2)3、4、およびGAMETE発現2(GEX2)5は、ガメ融合に関与する受精調節剤として同定され、 添付ファイルは、それぞれ。我々は最近、男性のガメテ特異的膜タンパク質、DUF679ドメイン膜タンパク質9(DMP9)を、ゲームと相互作用に関与する受精調節器として同定した。我々は、DMP9発現の減少は、A.タリアナ6における二重受精中の卵細胞受精の有意な阻害をもたらすことを見出した。

卵巣組織でさらに包まれた卵巣に埋め込まれた胚嚢に二重受精が起こるので、二重受精プロセスの状態を観察し、分析することは困難である。このため、二重受精制御のメカニズム全体を完全に理解するのを妨げる多くの不明確な点が依然として存在する。生体内条件下での二重受精中のガメテの挙動を追跡する観察技術の確立は、受精レギュレータの候補候補の機能解析に不可欠である。最近の研究では、ガメの細胞内構造が蛍光タンパク質で標識されるマーカーラインが得られた。この記事では、人工的に受粉した雌しべに由来する胚嚢で発生した二重受精を観察するための簡単で迅速なプロトコルを示す。精子細胞核マーカーラインHTR10-mRFP7を用いて、各メスの受精状態は精子核信号形態に基づいて判別することができる。受精時の精子核の形態的変化に焦点を当てた我々のプロトコルは、統計的証拠のために十分な量のデータを効率的に得ることができる。HTR10-mRFPの背景(DMP9 KD/HTR10-mRFP)を持つDMP9-ノックダウンラインを男性植物として使用し、単一の受精パターンを示した。このプロトコルは、他の受精レギュレータの機能解析にも適しています。

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プロトコル

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1. 人工受粉

注:プロセスを開始する前に、5番鉗子のペアが必要です。

  1. 成長室で16時間/8-hの暗いサイクルの下で22 °CでA.タリアナ(Col-0)を成長させる。
    注:軸芽の開発を促進するために、ハサミで最初に開発された花の茎をカットし、削除します。活発に成長する植物(最初の茎の切断後2〜3週間、植物の高さ約25センチメートル)は、分析に適しています。
  2. エミュレートするには、第5鉗子を使用して、ステージ11 8(図1A)で花芽のセパル(図1B)、花びら(図1C)、およびスタメン(図1D)を取り除きます。上部に見られる花びらのビットを持つ芽が最適です。
    注:適切な女性のゲームマーカーラインを使用してください。このプロトコルでは、野生型植物を女性の親として使用しました。
  3. 15~18時間後に、鉗子でフィラメントをつまんでステージ138でDMP9KD/HTR10-mRFPの花のスタメンを取る。
  4. 受粉するには、消化された雌しべの汚名を、脱気剤で数回軽くたたきます。

2. 観察のための排卵の準備

注:両面テープが付いているスライドガラス、第5の鉗子、27 Gの注入針および解剖顕微鏡は必要である。

  1. 受粉(HAP)の後7〜8時間、雌しべを収集し、両面テープ上に置き、その後、テープ上の雌しべを固定するために鉗子で穏やかに押します(図2A、A')。
    注:雌しわのほとんどの卵管は、少なくとも1つの花粉管10 HAP9を受け取る。第1の花粉管からの精子細胞の両方またはいずれかの1つが受精に失敗した場合、第2の花粉管は受精回復システム10に起因する排卵によって引き付けられるであろう。最初の花粉管から精子核形態を分析するには、遅く10HAPまでに卵管調製を完了することをお勧めします。
  2. 解剖顕微鏡下で注射針を用いて卵巣の上端と下端を切り取る(図2B,B')。
  3. 注射針の先端を動かして、リプラムの両側に沿って卵巣壁をスリットする(図2C、C')。
    注:中隔からの卵の分離を防ぐために注射針を浅く挿入します。
  4. 注射針を使用して卵巣壁をエバート(図2D,D')。
  5. 排卵が接続されている中隔の基部をつまみ、鉗子で慎重に持ち上げます(図2E)。
  6. 卵管をスライドガラス上の水滴に移し、蛍光顕微鏡下で観察するためのカバーガラスで優しく覆う(図2E,E')。

3. 顕微鏡検査

注:このプロトコルでは、蛍光フィルターキューブ(材料の表を参照)、デジタルカメラ、および付属のソフトウェアを備えたエピ蛍光顕微鏡を使用しました。

  1. 20倍または40倍の対物レンズと装備されたデジタルカメラを使用して、mRFPで標識された精子核を含む卵丘の画像を取得します。
  2. 胚嚢におけるmRFP標識精子核の数を確認する。
    注:2つのmRFP標識精子核を含む卵子は、統計分析のために母集団サイズに含めることができる。
  3. 胚嚢内の各mRFP標識精子核の形状と位置を確認する。
    注:花粉管から放出された直後に、凝縮されたmRFP標識精子核のペアが卵と中央細胞の間に局在する。例えば、カラザル側で検出された非凝縮されたmRFP標識精子核は、中央細胞受精を示す。適切な女性のガメテ膜マーカーラインを用いることによって、補足図1に示すように、精子細胞がプラスモグミー(膜融合後であるが、カルヨガミーの前)を受けているかどうかが明確に監視することができる。

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結果

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DMP9KD/HTR10-mRFPで受粉した雌ししから卵黄を7-8 HAPで採取し、観察した。

ほとんどの卵子は、卵子細胞(マイクロパイラー側)と中心細胞(カラザル側)核位置に2つの凝縮されたmRFP標識精子核を含み、それぞれ(図3A)、二重受精に成功したことを示す。さらに、中央細胞核に非凝縮されたmRFP標識精子核を含む卵子と卵子細胞外の凝縮されたmRFP標識精子核(図3B)が観察され、単一受精を示した。二重受精に失敗した場合、gcs1変異精子細胞(図3D)3、4のように、卵細胞と中心細胞の境界で2つの凝縮されたmRFP標識精子核が観察された(図3C)。<...

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ディスカッション

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HTR10-mRFPは、父方クロマチン(すなわち、精子細胞核を可視化する)を標識し、二重受精におけるダイナミクスが7に報告されている。花粉管からの放出直後に、HTR10-mRFP標識精子核は依然として凝縮されている。しかし、各精子核は、カルヨガミーで受精したメスのガメ核と合併すると凝縮され、3~4時間後にゲーム膜融合7が行われている。未受精精子細胞は、gcs1精子細胞が受精せずに逮捕される胚嚢に示すように凝縮されたままである(図3D)。通常、肥沃なHTR10-mRFPを花粉親として使用する場合、7-8 HAPでピスティル内の排卵の57.9%±17.8%(平均±s.d.;n =16ピスティル)に2つのmRFP標識精子核信号が含まれており、ほぼすべての信号(97.2%)二重受精に成功した(図3Aに同様の信号パターンが示されている)を反映して、凝縮される。 ...

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

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本研究は、日本学術振興会(JP17H05832 to T.I.)の支援を受け、千葉大学植物化学植物分子科学戦略優先研究推進プログラムの助成を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BX51オリンパス落射蛍光顕微鏡
カバーガラス松波ガラスC018181
DMP9KD/HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
>両面テープニチバンNW-15S15mm幅
DP72オリンパスデジタルカメラ
鉗子活任意の5番鉗子が利用可能
成長室ニホニカLPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFPシロイヌナズナ、エコタイプ コロンビア-0 (Col-0) background
Ingouff et al. (2007)7
注射針テルモNN-2719S27 G
スライドガラス松波ガラスS9443
SZX9オリンパス解剖顕微鏡
U-MRFPHQオリンパス蛍光フィルターキューブ (励起:BP535-555、発光:BA570-625、二色ミラー:DM565)
UPlanFL N 40xオリンパス対物レンズ (NA 1.3)、油浸
UPlanSApo 20xオリンパス対物レンズ (NA 0.75)、ドライ

参考文献

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  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
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  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076(2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

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HTR10 mRFP

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