紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

サマリー

このプロトコルは、マウスの眼表面細胞からの活性一次培養における活性酸素種(ROS)、生細胞、および死細胞の同時検出を実証する。2',7'-ジクロロフルオレセインセテート、ヨウ化プロピジウム、ヘーチスト染色を用いてROS、死細胞、生細胞をそれぞれ評価し、続いてイメージングと分析を行います。

要約

眼表面は、様々な環境要因により定期的な消耗を受ける。UV-C放射線への暴露は、労働衛生上の危険を構成する。ここでは、マウスの眼面からUV-C線への一次幹細胞の被曝を実証する。活性酸素種(ROS)形成は、酸化的ストレス/損傷の程度の読み出しです。実験的なインビトロ設定では、酸化ストレスのために生成された死細胞の割合を評価することも不可欠です。この記事では、UV-C曝露マウス一次眼表面幹細胞の2',7'-ジクロロフルオレシンセインテアト(DCFDA)染色とDCFDA染色の蛍光画像に基づく定量を紹介します。DCFDA 染色は直接 ROS 生成に対応します。また、ヨウ化プロピジウム(PI)とヘーヒト3332との同時染色とDCFDA(ROS陽性)およびPI陽性細胞の割合を同時に染色することにより、死細胞と生細胞の定量化を実証した。

概要

眼表面(OS)は、角膜の外層及び腺上皮を主成分とする機能ユニットであり、涙腺、筋膜腺、結膜、眼瞼のマージン及び信号を変換するインナーベーションの一部^{である1。}透明ドーム型の角膜層は、光をレーティナに焦点を当てています。この血管組織は、上皮細胞、角質細胞、及び内皮細胞およびコラーゲンおよびグリコサミノグリカンなどの細胞内皮細胞および細胞成分2などの細胞成分から構成^される。この地域は、栄養素のほとんどを供給する涙によって排出されます。OSの解剖学的位置は、外部環境に直接接触することを余びれにし、明るい光、微生物、塵の粒子および化学薬品のようなさまざまな粗い部品にそれをしばしば露出させる。この要因は、物理的な傷害にOSを素因とし、それが様々な病気になりやすいです。

酸化ストレスは、活性酸素種(ROS)の生成と内因性抗酸化防御機構³との間の不一平衡に起因する。ROSは反応性分子とフリーラジカルに分類され、いずれもミトコンドリア酸化リン酸化⁴を介して分子酸素_(O2)に由来する。前者の群は、過酸化水素(H2O2)、一重酸素^(1O2)などの非ラジカル種から構成され、後者はスーパーオキシドアニオン_(O2-)、およびヒドロキシルラジカル^(•OH)などの種を含む。これらの分子は、正常な細胞プロセスの副産物であり、その役割は、シグナル伝達、遺伝子発現、および宿主防御⁵などの重要な生理機能に関与している。ROSの産生の増強は、病原体侵入、異種生物、紫外線(UV)放射線への曝露などの因子に応答して生成されることが知られている^4。このROSの過剰産生は、核酸、タンパク質、脂質などの分子の損傷につながる酸化ストレス^{をもたらす6。}

UV 放射の最も主要な光源である自然光は、UV-A (400 ~320 nm)、UV-B (320 ~290 nm)、UV-C (290~200 nm)⁷で構成されています。波長とスペクトルエネルギーの逆相関が報告されている。自然UV-C放射は大気に吸収されますが、水銀灯や溶接器具などの人工的な光源が放出され、したがって、職業上の危険を構成します。眼への暴露の症状は、光角膜炎および光角結膜炎⁸を含む。ROSの産生は、UV誘導細胞損傷⁹を与える主要なメカニズムの1つである。今回の研究では、UV-Cに曝露されたマウスの一次眼表面細胞/幹細胞における2',7'-ジクロロジハイドロフルオレセインダイアセテート(DCFDA)染色法を用いてROSの検出を実証した。緑色蛍光を蛍光顕微鏡を用いて捕捉した。細胞は、ヘエヒト33342および赤色のヨウ化プロピジウムの2つの染料でカウンター染色し、それぞれ生細胞および死細胞を染色した。

プロトコル

実験は、スイスのアルビノマウスアイに由来する一次眼細胞/幹細胞に対して行った。この実験のための目を収穫するための動物の使用は、制度動物倫理委員会、イェネポヤ(大学とみなされる)によって承認されました(IEAC承認番号、6a /19.10.2016)。

1. 試薬の調製

注: マウスの眼表面からの主細胞/幹細胞の導出は、このプロトコルの範囲を超えています。したがって、UV-C曝露量、ROSを評価するための試薬調製、生細胞および死細胞およびそれらの定量を実証する。試薬の各容積については表1を参照してください(最終染色液を得るために添加される10%ウシ胎児血清、DCFDA、ヘキストおよびプロピジウムヨウ化ストック溶液)。

1. DMSOの5.13 mLでDCFDA粉末の25 mgを溶解することにより、10 mM DCFDAのストック溶液を調製します。アリク250 μLは、アンバー色1.5mLチューブにそれぞれ250μL、-20°Cで保存します。
2. 25 mg バイアルの内容物全体を 2.5 mL の脱イオン水に溶解して、10 mg/mL (16.23 mM 溶液) Hoechst 33342 のストック溶液を調製します。アンバー色のマイクロ遠心チューブに100μLのアリコートを作り、最大6ヶ月間2〜6°Cで保管してください。長期保存のために、-20 °Cで保管してください。
3. 1 mg/mLのヨウ化プロピジウムを脱イオン水にストック液を調製し、アリコート1mLをアンバー色の1.5mLチューブにそれぞれ、4°Cで保存する。

2. 細胞めっきおよびUV-C放射線処理

1. めっき前に、我々の研究室で単離されたマウスの一次眼表面細胞(未発表の結果;そのような細胞は、穏やかな細胞解離剤(材料表)を用いて角膜上皮、間質細胞および角質細胞の混合物である。
2. プレート0.2 x 10⁶マウスの一次眼表面細胞を35mm 0.2%基調膜マトリックスコーティングした細胞培養皿で2.5mLの完全培地。_5%CO2と加湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートする。
   注:マウス眼表面から一次細胞を培養するための完全な培地は、20%FBS、1%ペンストレップ、1%グルタマックス、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%のピルビン酸ナトリウム、および0.1%-βメルカプトエタノールを含むDMEM高グルコースで構成されています。
3. 細胞を様々な用量のUV-Cに曝露する前に、最大量の媒体を廃棄し、薄い層の培地(約500μL)のみが細胞と接触し続け、それらを覆うのに十分です。
4. UV-Cソース/チャンバー(ハイブリダイゼーションオーブン/UVクロスリンカーの下部室)に一度に1つずつ、皿を取ります。資料の表)。皿をチャンバーに入れ、皿の蓋を取り外します。皿の開いたふたの位置は細胞がUV-C露光の間に最大UV-C線量を受け取ること保障する。
5. 細胞をUV-Cの異なるグレード/用量に曝露する:1 J/m 2、100J/m2、1,000 J/m 2および10,000 J/m^2。
6. UV-C露光後、すぐに各皿の蓋を交換し、UV-Cソースチャンバーからそれらを取り外します。
7. 各料理を層流フードに持ち込み、2 mLの新鮮な完全なメディアで各料理を上にします。
8. 37 °C_CO2インキュベーターで3時間細胞をインキュベートする。UV-C曝露後の3時間のインキュベーションは、初期の効果を視覚化して定量化するのに最適です。

3. 生細胞染色媒体の調製

1. 3時間の細胞インキュベーションポストUV-C露光の最後の15分の間に新鮮な染色媒体を準備します。
2. 10% FBS-DMEMを含む染色媒体のプレウォーム10 mLは、37°Cに1%ペンストレップで補足した。
3. 10 mM DCFDA の 5 μL を追加します。5 mg/mL ヘクスト溶液の 5 μL と 200 μL の 1 mg/mL ヨウ化プロピジウム.DCFDA、Hoechst、および PI の最終濃度は、10 mL の染色媒体でそれぞれ 5 μM、5 μg/mL、20 μg/mL です。

4. UV-C曝露マウス主眼球のDCFDA染色

1. UV-C曝露マウスの主眼球細胞を様々な用量で3時間インキュベートした後、培地を35mmの皿から吸引した。
2. 各皿に2mLの作製DCFDA染色媒体をそっと補って補充してください。
3. 37°Cの_CO2インキュベーターで暗闇の中で15分間染色培地を用いて細胞をインキュベートし、生細胞染色を行います。

DCFDA(ROS)、ホーハスト細胞、PI染色細胞の観察

1. インキュベーション終了後、染色媒体を廃棄する。
2. 細胞に新鮮な完全な媒体を追加し、反転蛍光顕微鏡/細胞のイメージャー(材料のテーブル)の下で細胞を観察します。希望のフィールドを撮影: 明視野, 青色蛍光, 赤蛍光, 緑色蛍光.
   注:青色蛍光染色された細胞は核であり、緑色蛍光はROS生成細胞用であり、赤色蛍光はPI陽性死細胞を示す。

6. イメージング技術を用いた染色細胞(ホーチストブルー、PIデッド、グリーン-ROS)の定量化

1. 反転蛍光顕微鏡/細胞イメージャーの下で撮影した画像を、定量化のためにImageJにエクスポートします。
2. 各チャンネル(すなわち、青(nuclei/Hoechst)、緑(ROS)、赤(Dead/PI陽性))を使用して、カウントのために各画像を1つずつ開きます。非露出制御から開始し、1、100、1,000、10,000 J/m^-2に順次移動します。
3. 各フィールドのソフトウェアメニューで十字架としてマークされたセルカウントツールを使用してセルを数える [青陽性 (Hoechst 陽性; 核), 赤陽性 (PI 陽性; 死細胞); 緑色陽性 (ROS)] 各画像に対応する各画像で、治療。
4. 各フィールドの各特定のシグナルをクリックしてカウントします。たとえば、青/Hoechst染色された核をクリックすると、所定のフィールド内の核の総数が得されます。
5. 結果を、UV損傷による細胞死の割合(PI陽性細胞数x100をホーハスト陽性細胞数で割った数)と、ROS産生の割合をUV損傷(DCFDA陽性細胞数x100)で計算する。

結果

DCFDAは、細胞内のROSを検出するための指標として使用されるフルオレセインの化学的に還元された形態である無色色の色素である。この色素は細胞内に閉じ込められ、緑色蛍光を発する蛍光ジクロロジハイドロフルオレセイン(DCF)に容易に酸化されます。この蛍光は蛍光顕微鏡を用いて検出することができる。細胞は、次のようにROS蓄積と可視化し、相関することができます:(i)ROSのない生細胞は、高い青色蛍光を放出する。(ii) ROS蓄積を有する生細胞は、低緑色蛍光で高い青色蛍光を発する。ROS蓄積を有する(iii)死細胞は、高い赤色および高緑色蛍光を有する低青色蛍光を発する。

コントロール細胞および細胞をUV-Cの1^J/m2に曝露した細胞は、DCFDA/ROSおよびPI陽性細胞を示さなかった。UV-Cの非露光制御は、ホーハスト染色によって示される核染色のみを示した(図1)。しかし、UV-C非露光対照細胞にはPIまたはDCFDA陽性細胞は見られなかった(図1)。

ディスカッション

ここで説明するDCFDA染色法により、UV-C線で処理されたマウスの一次眼の生細胞におけるROSの可視化が可能になります。この染色方法の利点は、研究者が生きた細胞に対するUV-C(UVC暴露後3時間)の即時効果と、ROS陽性の割合と死んだ細胞の割合に対する同時列挙を研究できることです。また、染色法が生細胞に用いられているように、細胞は、UV-C放射線の遅延効果の研究のためにより長い時間(数日間)同一の培地中で更にインキュベートすることができる。したがって、この染色法により、ROS生成(緑色)を可視化し、同時に生細胞内の生細胞、アポトーシスおよび死細胞集団を反転蛍光顕微鏡下で区別することが可能になります。しかし、特定の状況下では、ROS陽性およびPI陽性細胞を得ることを期待しているにもかかわらず、視覚化は失敗する可能性があります。そのような場合は、トラブルシューティングを推奨します (表 2)。

このプロトコルは、最適な結果を得るために正確に行われなければなりません。最適な結果は、特定のUV-C線量誘発DNA損傷の正確な読み出しとして生成された緑色蛍...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFDA)	シグマ	D6883	2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートは蛍光プローブであり、細胞に透過性です。活性酸素種の定量に使用されます。
細胞培養ディッシュ(35mm)	Eppendorf	SA 003700112	細胞を培養するための滅菌ディッシュです。
DMEM高グルコース	HiMedia	AT007	広く使用されている細胞培養培地には、4500 mg / Lのグルコースが含まれています。
ウシ胎児血清、EU原産	HiMedia	RM99955	細胞培養培地の最も重要な成分の一つです。成長因子、アミノ酸、タンパク質、A、D、E、Kなどの脂溶性ビタミン、炭水化物、脂質、ホルモン、ミネラル、微量元素を提供します。
GlutMax	Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050061	L-グルタミンのサプリメントおよび代替品として使用されます。細胞の生存率と成長を改善するのに役立ちます。
HL-2000 ハイブリンカー	UVP		ハイブリダイゼーションオーブン/UVクロスリンカー
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst染色は、生細胞と死細胞の両方に透過性があります。細胞が死んでいるか生きているかに関係なく、二重飢餐状態のDNAに結合します。
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	細胞の成長と生存率を高めるためのサプリメントとして使用されます。
ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-Strep)	Gibco、Thermo Fisher Scientific	15140122	ペニシリンおよびストレプトマイシンは、培養中の細菌汚染を防ぐために使用されています。
ヨウ化プロピジウム	Sigma	P4170	死細胞のみ透過性のある蛍光色素です。DNAと結合し、生細胞と死細胞を区別するのに役立ちます。
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad