方法論記事

化合物阻害、IC50値、アーティフィファクト活性、ヌクレオシドリボヒドロラーゼの全細胞活性を決定するためのNMRベース活性アッセイ

DOI：

10.3791/59928

⸱

2019年6月30日

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1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMRベースの活性アッセイは、2つのヌクレオシドリボヒドロラーゼ酵素の阻害剤を同定し、特徴付けるために開発された。プロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞のアッセイのために提供されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR分光法は、創薬における酵素阻害剤の同定および特徴付けにしばしば用いられ、特に断片スクリーニングの文脈において使用される。NMRベースの活性アッセイは、これらの弱い阻害剤を検出するために必要なより高濃度の試験化合物で働くのに理想的に適しています。NMR実験におけるダイナミックレンジと化学シフト分散により、基板、製品、試験化合物からの共振を容易に解決できます。これは、UV-vis吸収プロファイルが重複する化合物から読み出し干渉の問題がしばしば生じる分光光測定アッセイとは対照的です。また、レポーター酵素が不足しているため、単酵素NMRアッセイは結合アッセイ偽陽性を起こしにくい。この属性は、従来の高スループットスクリーニングアッセイおよびベンチトップトリアージアッセイを補完する直交アッセイとして有用になります。詳細なプロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞におけるアッセイのために提供されます。これらの方法は、2つのヌクレオシドリボヒドロラーゼ酵素を用いて実証される。プリン特異的酵素に対して1H NMRの使用が示され、19F NMRはピリミジン特異的酵素に対して示されている。 プロトコルは、一般に、基質と製品の共鳴がNMR分光法によって観察および区別される任意の酵素に適用可能である。創薬の文脈で最も有用になるために、基板の最終的な濃度は、そのKm値の2〜3倍以下でなければなりません。 NMR実験の選択は、利用可能な酵素反応と基板、ならびに利用可能なNMR計測に依存する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

核磁気共鳴(NMR)分光法は、酵素反応1、2を特徴付けおよび監視するために十分に確立されている。化学シフトと結合パターンの違いは、基板と製品の共振を区別するために使用され、相対共振強度は反応のパーセントを定量化するために使用されます。基板の消費と製品の作成の両方がNMRスペクトルで直接観察されます。これは分光光法または蛍光分光法とは対照的であり、反応時間の経過は、消費または作成されるいくつかの化学種に起因する吸光度の変化によって示される。他の方法と同様に、NMRは、温度、pH、または他の溶液条件の関数として酵素反応を研究するために使用することができ、阻害剤の効果を決定することができます。

さらに最近では、NMRベースの酵素活性アッセイは、フラグメントスクリーニング3、4について実証されている。NMRベースのアッセイは、これらの弱い阻害剤を検出するために必要な高濃度の試験化合物(多くの場合、1mMと同じくらい高い)で働くのに理想的に適しています。NMR実験におけるダイナミックレンジと化学シフト分散により、基板、製品、試験化合物からの共振を容易に解決できます。これは、読み出し干渉の問題が多くUV-vis吸収プロファイルが重複する化合物から生じる分光光アッセイと比較します。また、レポーター酵素が不足しているため、単酵素NMRアッセイは結合アッセイ偽陽性を起こしにくい。この利点は、それらが直交アッセイとして有用になり、従来の高スループットスクリーニングアッセイおよびベンチトップトリアージアッセイ5を補完する。

当研究室では、NMRベースの活性アッセイを用いて、トリコモナス膣ヌクレオシドリボヒドロラーゼの阻害剤を同定し、評価しています。T.膣寄生虫は、最も一般的な非ウイルス性感染症6を引き起こす。既存の治療法7に対する耐性の増加は、主要な標的8を表す必須ヌクレオシドサルベージ経路酵素を有する新規なメカニズムベースの治療の必要性を促進している。NMRベースの活性アッセイは、ピリミジンおよびプリン特異的酵素、ウリジンヌクレオシドリボヒドロラーゼ(UNH)9、およびアデノシン/グアノシンがヌクレオシドリボヒドロラーゼ(AGNH)10を好む両方のために開発された。これら2つの酵素によって触媒された反応を図1に示す。NMRアッセイは、化学的開始点のフラグメントライブラリをスクリーニングし、IC50値を決定し、集約ベースまたは共生結合阻害剤11を除離するために使用されている。同じアッセイはまた、全細胞12における酵素活性を評価するために翻訳されている。

詳細なプロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞におけるアッセイのために提供されます。プロトコルは、一般に、基質と製品の共鳴がNMR分光法によって観察および区別される任意の酵素に適用可能である。わかりやすくするために、3 つの仮定がなされています。まず、基板は指定されません。NMRベースの活性アッセイが有用である場合、基板の最終濃度はKm値4の2〜3倍以下であるべきである。示されている実施例では、アデノシンおよび5-フルオロリジンの最終濃度はそれぞれ100μM(K m= 54 μM)および50 μM(Km = 15 μM)である。プロトコルでは、これらの濃度を達成することは、5mMアデノシンの12 μLまたは2.5mM 5-フルオロリジンの12 μLに相当する。

第2に、プロトコルに提供される酵素の量は、5μL、30分で基板から製品への約75%の変換をもたらすのに必要な量に対応するように選択した。この量は、通常、精製酵素ストックからの大きな希釈を表し、希釈は、各酵素のために事前に決定する必要があります。精製されたAGNHおよびUNH酵素ストック溶液は、数千の反応に十分な酵素を提供するアリコートで-80°Cで保存されます。したがって、希釈係数は、理想的には数ヶ月ごとに決定または検証する必要があります。第3に、特定の1D NMR実験は指定されていない。代表的な結果では、AGNH10および19 F NMRに対して1H NMRが示され、対応する参考文献に記載されたNMR実験が示されている。 NMR実験の選択は、利用可能な酵素反応と基板、ならびに利用可能なNMR計測に依存する。最後に、記載された実験アプローチが定量的NMR(qNMR)13,14の厳密な要件に従わないことを指摘すべきである。プロトコルでは、パーセント反応は、絶対濃度を決定するのではなく、各スペクトルにおける同じ共振の強度の相対的な変化を使用して決定される。このアプローチにより、qNMRに必要な内部規格や外部規格と同様に、データの取得と処理の変更が不要になります。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 500 μM および 250 μM の初期試験化合物アッセイ

  1. 反応用の基板および試験化合物を調調します。
    1. 水中の基質(アデノシンまたは5-フルオロリジン)のストック溶液と、過熱ジメチルスルホキシド(DMSO)中の50mM試験化合物を調製する。使用する基板溶液の濃度については、導入セクションを参照してください。
    2. 4つの1.5 mLマイクロフュージチューブ、1-4のそれぞれに基板(アデノシンまたは5フッ素)の12 μLを追加します。
    3. チューブ1(0分制御)と4(30分制御)に6 μLの過熱DMSOを追加します。チューブ2に試験化合物の6 μLを追加します。試験化合物の3 μL と、チューブ3に過熱DMSOの3 μLを追加します。
  2. 十分な反応ストック溶液を調調します。
    注:ストック溶液は、それぞれが517 μLのバッファー、60 μLの酸化重水素、および5 μLの酵素溶液(AGNHまたはUNH)を含む5つの反応に対してです。使用する酵素溶液の濃度については、導入セクションを参照してください。
    1. 15 mL円錐管に2.59mLの反応バッファー(50 mMリン酸カリウム、0.3M KCl、pH 6.5)を加えます。円錐管に酸化重水素を300μL加えます。円錐形に25 μLの酵素溶液(AGNHまたはUNH)を添加します。
    2. 円錐形のチューブを2回ゆっくりと反転させ、混ぜます。
  3. 0分制御反応を同時に開始し、消し取る。反応ストック溶液の582 μLをクリーンなマイクロフュージチューブに移します。このマイクロフュージチューブに1.5M HClの10 μLを追加します。組み合わされた592 μLをマイクロフュージチューブ1に移します。ゆっくりと意図的な方法でサンプルを2回吸引し、分配します。
  4. 残りの 3 つの反応をずらりと実行します。時間0分で、反応ストック溶液の582μLをマイクロフュージチューブ2に移す。ゆっくりと意図的な方法でサンプルを2回吸引し、分配します。マイクロフュージチューブ3と4の場合は、30秒間隔で繰り返します。30分待って
  5. 反応をクエンチ。時間30分で、マイクロフュージ2に1.5M HClの10 μLを加えます。マイクロフュージチューブ3と4の場合は、30秒間隔で繰り返します。各マイクロフュージからNMRチューブに600μLの溶液を移します。
  6. 各サンプルで1D NMRスペクトルを取得します。データを処理して、正しいフェジングとフラットベースラインを確保します。
  7. 制御スペクトルの基板の変換率を計算します。
    1. 0分と30分のコントロールのためにスペクトルをオーバーレイします。0分コントロールの基板信号を30分コントロールに合わせてスケーリングします。このパーセンテージに注意してください。
    2. パーセント変換を計算します (100 – ステップ 1.7.1 で決定されたパーセンテージ)。
  8. 試験化合物を含む反応に対する基板の変換率を計算します。
    1. 0分の制御および500 μM試験化合物を含む最初の反応のためのオーバーレイスペクトル。0分コントロールの基板信号をテスト化合物とスペクトルに合わせてスケーリングします。このパーセンテージに注意してください。パーセント変換を (100 – 決定されたパーセンテージ) として計算します。
    2. 250 μM試験化合物を含む第2の反応についても繰り返します。
  9. 各試験化合物濃度の反応率と抑制率を計算します。
    1. パーセント反応を (1.8.1/1.7.2) x 100 として計算します。
    2. 阻害率を(100 – ステップ 1.9.1 で決定したパーセンテージ) として計算します。

2. IC50値の決定

  1. 反応用の基板および試験化合物を調調します。
    1. 水中の基質(アデノシンまたは5-フルオロリジン)のストック溶液と、過熱DMSO中の10mM試験化合物を調製する。使用する基板溶液の濃度については、導入セクションを参照してください。
  2. 10 mM試験化合物のシリアル希釈を調用する(過量DMSO)。
    1. 5つの1.5 mLマイクロフュージチューブ(1-5)に36 μL重いDMSOを追加します。
    2. チューブ1に12 μL 10 mM試験化合物を追加し、軽くタップして混ぜます。試験化合物は現在2.5mMです。
    3. チューブ1からチューブ2に12 μLを移し、軽くタップして混ぜます。試験化合物は0.63 mMになりました。チューブ2からチューブ3に12 μLを移し、軽くタップして混ぜます。試験化合物は0.16 mMになりました。チューブ3からチューブ4に12 μLを移し、軽くタップして混ぜます。試験化合物は0.04 mMになりました。チューブ4からチューブ5に12 μLを移し、軽くタップして混ぜます。試験化合物は0.01 mMになりました。
  3. 反応用に14本の1.5mLマイクロフュージチューブを準備します。
    1. 14 1.5 mLマイクロフュージチューブ、1-14のそれぞれに基板(アデノシンまたは5フッ素)の12 μLを追加します。
    2. チューブ1(0分制御)と14(30分制御)に12 μLの過熱DMSOを追加します。
    3. チューブ2および3に10mM試験化合物の12 μLを追加します。チューブ4および5に2.5 mM試験化合物の12 μLを追加します。チューブ6および7に0.63 mM試験化合物の12 μLを追加します。チューブ8および9に0.16 mM試験化合物の12 μLを追加します。チューブ10および11に0.04 mM試験化合物の12 μLを追加します。チューブ12および13に0.01 mM試験化合物の12 μLを添加します。
  4. 511 μL のバッファー、60 μL の酸化重水素、および 5 μL の酵素溶液 (AGNH または UNH) を含む 15 の反応を実行するのに十分な反応ストック 溶液を調製します。使用する酵素溶液の濃度については、導入セクションを参照してください。
    1. 15 mL 円錐管に7.67mLの反応バッファー(50 mMリン酸カリウム、0.3M KCl、pH = 6.5)を加えます。円錐管に酸化重水素の900 μLを追加します。円錐形に75 μLの酵素溶液(AGNHまたはUNH)を添加します。
    2. 円錐形のチューブを2xにそっと反転させ、混ぜます。
  5. ステップ1.3~1.9~(576μLの反応ストック溶液を使用)に従って、各試験化合物濃度に対する反応のパーセントを決定します。
  6. グラフパッドプリズムを使用してIC50値を計算します。
    1. 反応試験化合物濃度(200 μM、50 μM、12.5 μM、3.13 μM、0.78 μM、0.20 μM)の対数反応(それぞれ2つの値)を相関するデータテーブルを作成します。
    2. 非線形カーブ フィットを使用して、IC50値と標準誤差を決定します。

3. 100 μM および 50 μM の洗剤カウンタースクリーンアッセイ

  1. 反応用の基板および試験化合物を調調します。
    1. 水中の基質(アデノシンまたは5-フルオロリジン)のストック溶液と、過熱DMSO中の10mM試験化合物を調製する。使用する基板溶液の濃度については、導入セクションを参照してください。
    2. 8つの1.5 mLマイクロフュージチューブ、1-8に基板(アデノシンまたは5-フルオロリジン)の12 μLを追加します。
    3. チューブ1と5(0分コントロール)と4と8(30分コントロール)に6 μLの過熱DMSOを追加します。チューブ2および6に試験化合物の6 μLを追加します。試験化合物の3 μL と、チューブ3と7に過熱DMSOの3 μLを追加します。
  2. 517 μL のバッファー、60 μL の酸化重水素、および 5 μL の酵素溶液 (AGNH または UNH) を含む 5 つの反応を実行するために、洗剤を使用せずに十分な反応ストック溶液を調製します。使用する酵素溶液の濃度については、導入セクションを参照してください。
    1. 15 mL 円錐管に2.59 mLの反応バッファー(50 mMリン酸カリウム、0.3M KCl、pH = 6.5)を加えます。円錐管に酸化重水素を300μL加えます。円錐形に25 μLの酵素溶液(AGNHまたはUNH)を添加します。
    2. 円錐形のチューブを2xにそっと反転させ、混ぜます。
  3. 517 μL のバッファー、60 μL の酸化重水素、および 5 μL の酵素溶液 (AGNH または UNH) を含む 5 つの反応を実行するために、0.01% v/v トリトン X-100 洗剤で十分な反応ストック溶液を準備します。
    1. 反応バッファーの20 mLにトリトンX-100洗剤の2 μLを加えます(50 mMリン酸カリウム、0.3M KCl、pH = 6.5)。洗剤溶液は1日以内に使用する必要があります。
    2. 0.01%トリトンX-100洗剤を含む反応バッファーの2.59 mLを15 mL円錐管に加えます。円錐管に酸化重水素を300μL加えます。円錐形に25 μLの酵素溶液(AGNHまたはUNH)を添加します。
    3. 円錐形のチューブを2xにそっと反転させ、混ぜます。
  4. チューブ1~4の場合、洗剤を使用しない反応ストック溶液を使用して、ステップ1.3~1.9で概説した手順に従って、各試験化合物濃度の阻害率を決定する。
  5. チューブ5~8の場合、0.01%v/vトリトンX-100洗剤を用いて反応ストック溶液を用いて、1.3〜1.9の手順で概説した手順に従って、各試験化合物濃度の阻害率を決定する。

4. ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ

  1. 反応用の基板および試験化合物を準備する
    1. 水中の基質(アデノシンまたは5-フルオロリジン)のストック溶液と、過熱DMSO中の10mM試験化合物を調製する。使用する基板溶液の濃度については、導入セクションを参照してください。
    2. 反応バッファーの 53.8 μL (50 mM リン酸カリウム、0.3 M KCl、pH = 6.5) を 2 つの 1.5 mL マイクロフュージ チューブ (それぞれ), 1 および 2 に追加します。チューブ1および2に酵素(AGNHまたはUNH)の5 μLを追加します。
    3. 2つの1.5 mLマイクロフュージチューブ、3および4(各)に反応バッファーの511 μLを追加します。チューブ3および4に酸化重水素の60 μLを追加します。チューブ3および4に酵素(AGNHまたはUNH)の5 μLを追加します。
    4. チューブ1に1.2 μLの過熱DMSOを追加します(30分制御)。試験化合物の1.2 μLをチューブ2に追加します。チューブ3に12 μLの過熱DMSOを追加します(30分制御)。チューブ4に試験化合物の12 μLを追加します。30分間インキュベートします。
  2. 希釈液を備えた1.5mLマイクロフュージチューブを2本用意します。
    1. 2つの1.5 mLマイクロフュージチューブ、5および6のそれぞれに468 μLの反応バッファーを追加します。各チューブ(5および6)に酸化重水素の60 μLを追加します。
  3. 反応用に4本の1.5mLマイクロフュージチューブを準備します。
    1. 4つの1.5 mLマイクロフュージチューブ、7-10のそれぞれに基板(アデノシンまたは5フッ素)の12 μLを追加します。
  4. ジャンプ希釈を実行し、反応を開始します。
    1. チューブ5からチューブ1に溶液の528 μLを移します。ゆっくりと意図的な方法でサンプルを2回吸引し、分配します。チューブ6からチューブ2に溶液の528 μLを移します。ゆっくりと意図的な方法でサンプルを2回吸引し、分配します。
    2. 時間 0 分で、チューブ 1 からチューブ 7 に溶液の 588 μL を転送します。ゆっくりと意図的な方法でサンプル2xを吸引し、分配します。30秒間隔で、チューブ2からチューブ8、チューブ3からチューブ9、チューブ4からチューブ10に溶液の588 μLを転送します。ゆっくりと意図的な方法でサンプルを2回吸引し、分配します。30分待って
  5. チューブ7~10の場合は、ステップ1.5~1.9で概説した手順に従って、各試験化合物濃度の阻害率を決定します。

5.大腸菌全細胞における化合物アッセイ

  1. 実験前日に大腸菌の10mLの一晩培養を準備する。
  2. NMR実験用に大腸菌細胞を調記します。
    1. 15,000 x gで10分間1mLのアリコートで細胞を遠心分離する。
    2. 上清を廃棄し、ボルテックスにより1mLの反応バッファー(50mMリン酸カリウム、0.3M KCl、pH=6.5)で細胞の各アリコートを再懸濁する。
  3. 次の変更を行って、目的のアッセイについてはセクション 1 または 2 に従います。
    1. 再懸濁細胞の280 μLで反応ストック溶液中のバッファーの280 μLを置き換えます。
    2. 5 μLのバッファーを反応ストック溶液に5μLの酵素(AGNHまたはUNH)で置き換えます。

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結果

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図2は、セクション1に続く1H NMRを用いてAGNHに対して2つの化合物を試験した結果を示す。酵素反応は、それぞれ8.48 ppmおよび6.09 ppmでアデノシンシングルトとダブルト共鳴の消失によって最も容易に観察され、定量され、30分コントロールで観察される8.33 ppmのアデニンシングルト共鳴の出現スペクトル。500 μM化合物1の存在下では、8.33 ppmでのアデニン共鳴の欠如によって証明される製品は形成されていない。250μM化合物1の存在下では、基板の約10%が製品に変換されている。対照的に、化合物2の濃度はいずれも、30分制御スペクトルのものと類似した基板および産物共鳴によって証明されるように酵素を阻害しない。このデータは、化合物1を良好なAGNH阻害剤として識別する。化合物1(7.70-8.00および8.50-8.60 ppm)および化合物2(7.40-7.80 ppm)から生じる共振も観察される。図 4、図 6、図8、および図

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

記載されているプロトコルは、基質および/または製品がNMRスペクトル内で解決可能なシグナルを有することを条件として、一般に多くの酵素に適用可能である。しかし、基板の濃度がKm値に近く、合理的な時間枠内のNMR実験で検出されるほど高いことがわかります。2-3倍以下の基板濃度Km値は、競争力のある非競争的、競争力のない阻害剤4を検出するのに最適です。ここで示すように、UNH、基板、Km値は15μMと低い値が適しています。 CH3またはCF3信号を用いることと、低温プローブ上のNMRデータ収集と相まって、この閾値をさらに15に下げることができる。しかし、基板Km値が1μM未満の酵素は、NMR実験の本来の感度が低いため、この方法を用いて研究することは困難である可能性が高い。このような状況では、分光光法または蛍光分光法がより適切な技術である。

...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アストラゼネカフラグメントライブラリーから化合物を提供してくれたディーン・ブラウン博士と、AGNHとUNH酵素を提供してくれたデビッド・パーキン博士に感謝します。この出版物で報告された研究は、B.J.S.に賞番号R15AI128585の下で国立衛生研究所のアレルギーと感染症の国立研究所によってサポートされました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではなく、ランデスバーグ家であるS.N.M.に授与されたホレイス・G・マクドネル・サマー・リサーチ・フェローシップによっても支持された。フェローシップは、J.A.G.、およびアデルフィ大学からB.J.S.に対する教員開発助成金とフレデリック・ベッテルハイム研究賞を授与されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AGNH精製された社内N/ATVAG_213720
UNH精製された社内N/ATVAG_092730
アデノシンSigmaA9251
5-フルオロウリジンSigmaF5130
ジメチル スルホキシド-D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99.9%
リン酸カリウム 一塩基性シグマP0662
二塩基性カリウムシグマP3786
カリウムグマP9541
酸化重水素ケンブリッジ同位体研究所DLM-4-100D、99.9%
塩酸フィッシャーケミカルA144212
トリトンX-100グマX100
3-(トリメチルシリル)プロピオン-2,2,3,3,-d4酸性ナトリウム塩(TSP)シグマ269913D、98%
2,2,2-トリフルオロエタノール-1,1-d2シグマ612197D、99.5%
ピペットルソンF123602ピペットマンクラシックP1000
ペットギルソンF123601ペットマンクラシックP20ピ
ペットルソンF123600ピペットマンクラシックP20
マイクロチューブフィッシャー・サイエンティフィ05-408-129
コニカルチューブコーニング352099
マイクロ遠心機エッペンドルフ5418
ボルテックスミキサーフィッシャーサイエンティフィ02215365
NMRチューブノレル502-7または、NMRに適宜
NMR分光計ブルカーN/AvanceIII500
PrismソフトウェアGraphPadN/AVersion 5.04
リン酸塩化シシギピピギック ック

参考文献

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