方法論記事

クリック化学を用いた血管平滑筋細胞の増殖測定

DOI：

10.3791/59930

⸱

2019年10月30日

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1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

この記事について

サマリー

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増殖は細胞機能の重要な部分であり、新薬の潜在的な毒性を評価するために使用される一般的な読み出しである。したがって、増殖の測定は、細胞生物学において頻繁に使用されるアッセイである。ここでは、接着細胞および非付着細胞に使用できる増殖を測定するシンプルで汎用性の高い方法を提示します。

要約

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細胞が増殖する能力は、ほとんどの細胞の正常な機能に不可欠であり、増殖の調節不全は多くの疾患プロセスの中心にある。これらの理由から、増殖の測定は細胞機能を評価するために使用される一般的なツールです。細胞増殖は、単にカウントすることによって測定することができます。しかし、これは増殖を測定する間接的な手段です。分裂する準備をする細胞を直接検出する一般的な手段の1つは、標識されたヌクレオシド類似体の組み込みによるものである。これらには、放射性ヌクレオシドアナログ3H-チミジンおよび5-ブロモ-2'デオキシウリジン(BrdU)および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)などの非放射性ヌクレオシド類似体が含まれる。EdUの組み込みは、BrdUと比較していくつかの利点を有するクリック化学によって検出される。本報告では、EdUの組み込みによる増殖を測定するためのプロトコルを提供する。このプロトコルには、さまざまな読み出しのオプションと、それぞれの長所と短所が含まれています。また、計画された実験の特定のニーズを満たすためにプロトコルを最適化または変更できる場所についても説明します。最後に、この基本的なプロトコルを他の細胞代謝産物を測定するために変更する方法について説明します。

概要

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増殖は細胞機能1、2の重要な部分である。増殖の制御は、発達などの正常なプロセス、および癌および心血管疾患のような病理学的プロセスに影響を与える。血管平滑筋細胞の過形成成長は、例えば、アテローム性動脈硬化症3の前駆体であると考えられている。細胞増殖の変化は、新薬の潜在的な毒性を評価するためにも使用されます。その広範な影響を考えると、増殖の測定は多くの細胞生物学ベースの研究室の主力です。

細胞増殖は、目的の細胞集団がかなり急速に分裂する場合、単に細胞を数えることによって測定することができる。成長が遅い細胞の場合、細胞数の感度が低下する可能性があります。増殖は、多くの場合、標識されたヌクレオシド類似体の組み込みによって測定される。ゴールドスタンダードは3H-チミジンの組み込みですが、多くの研究所は、新しい非放射性代替品の入手可能性を考えると、この方法から脱却しています。これらには、細胞傷害性蛍光色素、細胞周期関連タンパク質の検出、および5-ブロモ-2'デオキシウリジン(BrdU)および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)4のような非放射性ヌクレオシド類似体の組み込みが含まれる。

カルボキシフルオレセインジアセテートコハシニジルエステル(CFSE)などの細胞質色素は、細胞が5個分裂するたびに色素の強度が半分になるため増殖を検出する。この技術は、非付着細胞のフローサイトメトリーで一般的に使用されます。接着細胞にはあまり使用されていませんが、新世代のイメージングプレートリーダーではこれが変わる可能性があります。抗体ベースの技術(フローサイトメトリー、免疫組織化学など)による細胞周期関連タンパク質の検出は、組織または非付着細胞にしばしば使用される。これらの細胞/組織は、染色前に固定し、透過する必要があります。ヌクレオシド類似体BrdUおよびEdUは、3H-チミジンへのアプローチが似ているが、放射能の不便さがない。BrdUの組み込みは抗BrdU抗体によって検出されるため、細胞は染色前に固定され、透過する必要があります。さらに、細胞はBrdUエピトープを露出させるためにDNaseで処理されなければならない。

EdUの組み込みは、アルキンとアジドが触媒銅の存在下で一緒に「クリック」をグループ化するクリックケミストリーによって検出されます。いずれの基も、生合成的に組み込まれた分子または検出分子4として機能することができる。市販のヌクレオシド類似体は、アルキン基が付着している。増殖アッセイの場合、従って、アルキン機能化ヌクレオシドアナログは、蛍光色素または他のマーカーに共役したアジドによって検出される。EdUの組み込みには、BrdUに対していくつかの利点があります。まず、アルキン基とアジド基は哺乳動物細胞に見つからないため、この相互作用は低いバックグラウンド6で非常に特異的である。両方の基が小さいので、細胞はBrdU7に必要な核酸類似体を露出させるためにDNA変性を受ける必要はない。最後に、クリックケミストリーは汎用性が高く、DNA、RNA、タンパク質、脂肪酸、および炭水化物8、9、10、11の代謝標識に使用することができる。目的とする代謝標識ターゲットが細胞表面上にある場合、生細胞は12と標識することができる。さらに、細胞は抗体による免疫蛍光染色のためにさらに処理することができる。

次のプロトコルは、ヒト血管平滑筋細胞における増殖を測定するためのEdU組み込みおよびクリック化学の使用について説明する(図1)。EdUの組み込み方法、それぞれ代表的な結果、長所と短所の3つの異なる方法を示します。クリックケミストリーによる増殖の測定は、付着性、成長の遅い細胞に特に有用である。また、細胞の形態は良好に維持され、抗体ベースの染色も行うことができる。

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プロトコル

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1. 蛍光標識を用いたEdUの検出

  1. ストックソリューション
    1. 二重蒸留H2Oの10 mLにEdUの12.5 mgを加えて5 mM EdUのストックソリューションを準備します。
    2. ラベリング液成分を調製する: 200 mM トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン (THPTA) (1.15 mL H2O で 100 mg), 100 mM CuSO4 (1 mL H 2 O; 1 mL H2O;10 mM S3 ピコリルアジド (1 mg in 95.3L で 1 mg)-20°Cで5μLアリコート、および1Mアスコルビン酸ナトリウム(1mLH2Oで200mg;新鮮にする)に保存する。
    3. 0.15 mg/mLの濃度でレサズリン原液を調製する。フィルター滅菌し、4 °Cで1 mLのアリコートを保存します。
      注:ピコリルアジドは、いくつかの異なるフッ素、ビオチン、および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に共役して利用可能です。
  2. 血管平滑筋細胞(VSMC)にEdUでラベルを付けます。
    注:ヒトVSMCは、剥離した組織からの増殖を介して腸骨動脈から単離した。インスリンを用いた血清遊離媒体で増殖すると、トランスフェリン、これらの細胞はVSMCマーカースムーセリン、平滑筋ミオシン重鎖(SM-MHC)およびSMCαactin13を発現する。
    1. 96ウェルプレート中のダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の2 x 104/mLの板血管平滑筋細胞。
      注:細胞は、2%の胎児ウシ血清を有する平滑筋細胞媒性で37°Cで増殖する。
    2. (省略可能) このオプションを選択します。付着のために一晩に数時間を許可します。各井戸に20°Lレサズリンストックを加えます。37°Cで3時間インキュベートし、プレートリーダー(560 ex、594em)で蛍光信号を読み取ります。メディアを新しい DMEM に置き換えます。
      注: この手順はオプションです。レサズリンは、細胞番号を正規化し、めっき14の十分な変動を考慮するために使用されます。
    3. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または血小板由来成長因子(PDGF)30ng/mLを培養期間開始時の治療あたり3−6ウェルに添加し、72時間インキュベートする。
    4. 5 mM EdU ストックを 1 mM に希釈します。72時間培養期間の最後の24時間に2μLを各ウェル(最終濃度20μM)を加えます。1 セットのレプリケートに EdU を追加しないでください。これらの井戸は、バックグラウンド蛍光/発光を決定するために使用されます。
      注:EdUによる培養およびラベリングの持続時間は、平滑筋細胞用に最適化されていますが、細胞タイプごとに変更する必要がある場合があります。
  3. パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定します。
    1. メディアを取り外し、室温で10分間、ウェルあたり4%PFA(PBS)の150 μLを加えます。
    2. PFAを取り出し、室温で30分間ウェルあたり150μLのポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル(TX-100)(水中)を加えます。
    3. PBSで3回洗ってTX-100を取り外します。
      注意:PFAは有毒であり、注意して取り扱います。
      注: プロトコルはここで一時停止できます。固定細胞は、4°CでPBSに保存することができる。
  4. 組み込まれた EdU を検出します。
    1. バーラリング溶液(96ウェルプレートあたり10mL、インナー60ウェルを使用)を製造する直前に、ストック溶液から試薬を次の順序で追加します:THPTA 20 μL、CuSO4 20 μL、Cy3ピコリルアジド5μL、ナアスコルビン酸100μLをPBSに10mLの総体積で追加します。
    2. 井戸からPBSを取り出し、各ウェルに150°Lのラベリング液を追加します。37°Cで30分インキュベートする。すべての核を検出するには、各ウェルに4',6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)を追加します。蛍光プレートリーダーで読む (Cy3 550ex,570em;DAPI 350ex、470em)または顕微鏡上の画像。
      注: プロトコルはここで一時停止できます。固定および染色された細胞は4°CでPBSに貯蔵し、後でイメージすることができる。

2. 発光を用いたEdUの検出

  1. セクション1.1~1.3を完了します。
  2. 0.1%ポリソルベート20(TBST)でトリス緩衝生理線を調製します。
  3. 井戸をブロックします。
    1. 150°Lのブロッキングバッファ(材料表)を各ウェルに加え、室温で90分間インキュベートします。
    2. ブロッキングバッファを取り外し、200μLのPBSで3回洗浄します。
  4. 組み込まれた EdU を検出します。
    1. ステップ1.4.1の指示に従ってラベリング液を作り、Cy3ピコリルアジ化物にビオチンピコリルアジ化物を置き換えます。
    2. TBSTの200°Lで5回、振り回し、1回の洗浄で3分を洗浄します。
    3. 室温で20分間0.3%H2O2の150°Lの内因性ペルオキシダーゼをクエンチ。
    4. H2O2を取り出し、TBSTの200°Lで5回洗浄し、1回の洗浄につき3分振ります。
    5. TBSTでストレプトアビジンワサビエペルオキシダーゼ(SA-HRP;1:200)を希釈し、各ウェルに50 μLを加えます。室温で1時間インキュベートする。
    6. TBSTの200°Lで5回、振って、1回の洗浄で3分を洗浄します。
    7. 化学発光酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)基質(材料表)をそれぞれウェルに50μL加えます。
    8. 発光を検出できるプレートリーダーですぐに読みます。

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結果

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図2では、PDGFに応答してVSMCの増殖を測定する3つの異なる実験の結果を示す。SMC用に配合された媒介で細胞を増殖させた後、血清フリーDMEMで実験を行い、血清または増殖因子の増殖に対する潜在的な影響を排除した。図2Aでは、同じ実験の結果を、蛍光対発光読み出しを用いて比較する。これらのプレートを読み取るために、吸光度、蛍光、発光を読み取ることができるマルチモードマイクロプレートリーダーを使用しました(材料表を参照)。

スキャンウェルモードでプレートリーダーを使用して、蛍光測定値は井戸全体にわたって平均化されます。このモードは、井戸の中心とエッジの違いによる潜在的な不正確さを軽減します。しかし、非常に少数の核が陽性である場合、この方法で読み取ると、陽性細胞の「数」が過小に過ぎない可能性が高くなります。この読み出しを使用する数値は、別の井戸の蛍光に対する蛍光を意味し、正確な細胞番号ではありません。さらに、蛍光を拾う繊維や死んだ細胞...

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ディスカッション

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EdUの組み込みは、細胞増殖を測定するための簡単で簡単な方法です。これは、接着細胞13に特に有用である。当社のプロトコルは平滑筋細胞を使用しますが、任意の付着細胞(上皮、内皮など)に適用可能です。プロトコルは複雑ではありませんが、1つの重要なステップはラベリングソリューションを作ることであり、成分はリストされている順序で追加する必要があります。また、化学発光ウェスタンブロットと同様に、発光読み出しを使用する場合は、プレートを直ちに読み取る必要があります。

プロトコルのいくつかの部分は、必要に応じて変更または最適化できます。1 つの部分は、EdU でのインキュベーションの持続時間です。私たちの目標は、できるだけ多くの増殖細胞を検出することだったので、固定および染色の前に完全な24時間EdUを追加しました。ただし、このタイミングは、S フェーズと G2/M フェーズの両方でセルを測定する可能性があります。S相の細胞のみを標識するには、Cecchiniらからでも、ゆっくりと分裂した細胞を6時間以内にEdUでインキュベートすることをアドバイス...

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開示事項

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著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

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ケイティ・キャロルの技術支援に感謝します。また、ドクター・デビッド・クールとプロテオミクス解析研究所のサイエンスイメージングプレートリーダーの指導と提供に感謝します。この作品はライト州財団の助成金(L.E.W.へ)によって支えられた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5-エチニル-2'-デオキシウリジンカルボシンスNE08701
ビオチン ピコリルアジドクリック化学ツール1167-5
CuSO4フィッシャーサイエンティフィックC1297-100G
Cy3 ピコリルアジドクリック化学ツール1178-1
Cytation プレート リーダーBiotek
EVOS 顕微鏡サーモフィッシャーサイエンティフィック
過酸化水素溶液Sigma-Aldrich216763
Na アスコルビン酸Sigma-Aldrich11140-250G
NucBlue 固定細胞染色対応プローブInvitrogenR37606DAPI 核染色
Odyssey ブロッキングバッファーLi-Cor927-40000ブロッキングバッファー
パラホルムアルデヒド電子顕微鏡サービス15710
PBSフィッシャーサイエンティフィックSH3002802
塩化ナトリウムシグマライフサイエンスS3014-5kg
ストレプトアビジン 西洋ワサビ ペルオキシダーゼ コンジュゲートライフサイエンスS911
スーパーシグナル ELISA フェムトサーモサイエンティフィックPI137075ELISA基板
シナジー プレート リーダーBiotek
THPTAクリック ケミストリー ツール1010-100
トリス ヒドロキシメチル アミノメタン 塩酸塩 (Tris-HCl)フィッシャー・サイエンティフィックBP153-500
トリトン X 100バイオ・ラッド1610407
トゥイーン 20フィッシャー・サイエンティフィックBP337-100

参考文献

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