増殖は細胞機能の重要な部分であり、新薬の潜在的な毒性を評価するために使用される一般的な読み出しである。したがって、増殖の測定は、細胞生物学において頻繁に使用されるアッセイである。ここでは、接着細胞および非付着細胞に使用できる増殖を測定するシンプルで汎用性の高い方法を提示します。
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この記事について
サマリー
要約
細胞が増殖する能力は、ほとんどの細胞の正常な機能に不可欠であり、増殖の調節不全は多くの疾患プロセスの中心にある。これらの理由から、増殖の測定は細胞機能を評価するために使用される一般的なツールです。細胞増殖は、単にカウントすることによって測定することができます。しかし、これは増殖を測定する間接的な手段です。分裂する準備をする細胞を直接検出する一般的な手段の1つは、標識されたヌクレオシド類似体の組み込みによるものである。これらには、放射性ヌクレオシドアナログ3H-チミジンおよび5-ブロモ-2'デオキシウリジン(BrdU)および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)などの非放射性ヌクレオシド類似体が含まれる。EdUの組み込みは、BrdUと比較していくつかの利点を有するクリック化学によって検出される。本報告では、EdUの組み込みによる増殖を測定するためのプロトコルを提供する。このプロトコルには、さまざまな読み出しのオプションと、それぞれの長所と短所が含まれています。また、計画された実験の特定のニーズを満たすためにプロトコルを最適化または変更できる場所についても説明します。最後に、この基本的なプロトコルを他の細胞代謝産物を測定するために変更する方法について説明します。
概要
増殖は細胞機能1、2の重要な部分である。増殖の制御は、発達などの正常なプロセス、および癌および心血管疾患のような病理学的プロセスに影響を与える。血管平滑筋細胞の過形成成長は、例えば、アテローム性動脈硬化症3の前駆体であると考えられている。細胞増殖の変化は、新薬の潜在的な毒性を評価するためにも使用されます。その広範な影響を考えると、増殖の測定は多くの細胞生物学ベースの研究室の主力です。
細胞増殖は、目的の細胞集団がかなり急速に分裂する場合、単に細胞を数えることによって測定することができる。成長が遅い細胞の場合、細胞数の感度が低下する可能性があります。増殖は、多くの場合、標識されたヌクレオシド類似体の組み込みによって測定される。ゴールドスタンダードは3H-チミジンの組み込みですが、多くの研究所は、新しい非放射性代替品の入手可能性を考えると、この方法から脱却しています。これらには、細胞傷害性蛍光色素、細胞周期関連タンパク質の検出、および5-ブロモ-2'デオキシウリジン(BrdU)および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)4のような非放射性ヌクレオシド類似体の組み込みが含まれる。
カルボ....
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プロトコル
1. 蛍光標識を用いたEdUの検出
- ストックソリューション
- 二重蒸留H2Oの10 mLにEdUの12.5 mgを加えて5 mM EdUのストックソリューションを準備します。
- ラベリング液成分を調製する: 200 mM トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン (THPTA) (1.15 mL H2O で 100 mg), 100 mM CuSO4 (1 mL H 2 O; 1 mL H2O;10 mM S3 ピコリルアジド (1 mg in 95.3L で 1 mg)-20°Cで5μLアリコート、および1Mアスコルビン酸ナトリウム(1mLH2Oで200mg;新鮮にする)に保存する。
- 0.15 mg/mLの濃度でレサズリン原液を調製する。フィルター滅菌し、4 °Cで1 mLのアリコートを保存します。
注:ピコリルアジドは、いくつかの異なるフッ素、ビオチン、および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に共役して利用可能です。
- 血管平滑筋細胞(VSMC)にEdUでラベルを付けます。
注:ヒトVSMCは、剥離した組織からの増殖を介して腸骨動脈から単離した。インスリンを用いた血清遊離媒体で増殖すると、トランスフェリン、これらの細胞はVSMCマーカースムーセリン、....
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結果
図2では、PDGFに応答してVSMCの増殖を測定する3つの異なる実験の結果を示す。SMC用に配合された媒介で細胞を増殖させた後、血清フリーDMEMで実験を行い、血清または増殖因子の増殖に対する潜在的な影響を排除した。図2Aでは、同じ実験の結果を、蛍光対発光読み出しを用いて比較する。これらのプレートを読み取るために、吸光度、蛍光、発光を読み取ることができるマルチモードマイクロプレートリーダーを使用しました(材料表を参照)。
スキャンウェルモードでプレートリーダーを使用して、蛍光測定値は井戸全体にわたって平均化されます。このモードは、井戸の中心とエッジの違いによる潜在的な不正確さを軽減します。しかし、非常に少数の核が陽性である場合、この方法で読み取ると、陽性細胞の「数」が過小に過ぎない可能性が高くなります。この読み出しを使用する数値は、別の井戸の蛍光に対する蛍光を意味し、正確な細胞番号ではありません。さらに、蛍光を拾う繊維や死んだ細胞.......
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ディスカッション
EdUの組み込みは、細胞増殖を測定するための簡単で簡単な方法です。これは、接着細胞13に特に有用である。当社のプロトコルは平滑筋細胞を使用しますが、任意の付着細胞(上皮、内皮など)に適用可能です。プロトコルは複雑ではありませんが、1つの重要なステップはラベリングソリューションを作ることであり、成分はリストされている順序で追加する必要があります。また、化学発光ウェスタンブロットと同様に、発光読み出しを使用する場合は、プレートを直ちに読み取る必要があります。
プロトコルのいくつかの部分は、必要に応じて変更または最適化できます。1 つの部分は、EdU でのインキュベーションの持続時間です。私たちの目標は、できるだけ多くの増殖細胞を検出することだったので、固定および染色の前に完全な24時間EdUを追加しました。ただし、このタイミングは、S フェーズと G2/M フェーズの両方でセルを測定する可能性があります。S相の細胞のみを標識するには、Cecchiniらからでも、ゆっくりと分裂した細胞を6時間以内にEdUでインキュベートすることをアドバイス.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
ケイティ・キャロルの技術支援に感謝します。また、ドクター・デビッド・クールとプロテオミクス解析研究所のサイエンスイメージングプレートリーダーの指導と提供に感謝します。この作品はライト州財団の助成金(L.E.W.へ)によって支えられた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5-エチニル-2'-デオキシウリジン | カルボシンス | NE08701 | |
| ビオチン ピコリルアジド | クリック化学ツール | 1167-5 | |
| CuSO4 | フィッシャーサイエンティフィック | C1297-100G | |
| Cy3 ピコリルアジド | クリック化学ツール | 1178-1 | |
| Cytation プレート リーダー | Biotek | ||
| EVOS 顕微鏡 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| 過酸化水素溶液 | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na アスコルビン酸 | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue 固定細胞染色対応プローブ | Invitrogen | R37606 | DAPI 核染色 |
| Odyssey ブロッキングバッファー | Li-Cor | 927-40000 | ブロッキングバッファー |
| パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡サービス | 15710 | |
| PBS | フィッシャーサイエンティフィック | SH3002802 | |
| 塩化ナトリウム | シグマライフサイエンス | S3014-5kg | |
| ストレプトアビジン 西洋ワサビ ペルオキシダーゼ コンジュゲート | ライフサイエンス | S911 | |
| スーパーシグナル ELISA フェムト | サーモサイエンティフィック | PI137075 | ELISA基板 |
| シナジー プレート リーダー | Biotek | ||
| THPTA | クリック ケミストリー ツール | 1010-100 | |
| トリス ヒドロキシメチル アミノメタン 塩酸塩 (Tris-HCl) | フィッシャー・サイエンティフィック | BP153-500 | |
| トリトン X 100 | バイオ・ラッド | 1610407 | |
| トゥイーン 20 | フィッシャー・サイエンティフィック | BP337-100 |
参考文献
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell ....
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