葉緑体は植物を定義する細胞小器官です。多くの代謝的、発生的、シグナル伝達の機能とともに、葉緑体は光合成を担っています。光合成は、太陽光エネルギーを利用して生命の細胞活動を支えるプロセスです。したがって、葉緑体は植物だけでなく、植物に依存する多くの生態系や農業にとっても不可欠です。葉緑体は数千種類の異なるタンパク質で構成されており、その多くは核でコードされ、細胞質から取り込まれた後、内部で明確に異なる複数の器官内区画のいずれかに送られます1。葉緑体の発生と機能をより完全に理解し、食料安全保障やバイオエネルギーに関連する世界的課題に対応する葉緑体操作を含むバイオテクノロジー戦略を可能にするためには、重要な葉緑体タンパク質の標的、局在、相互作用を特定することが不可欠です。この方法集は、これらの目標を達成するために用いられる極めて重要かつ補完的な手法のセットを記述しています。このコレクションは主に広く使われているモデル植物である アラビドプシス・タリアナ (タールクレソン)に焦点を当てていますが、これらの方法は他の生物にも応用・応用可能です。
このコレクションには、核コードタンパク質が二重膜の外膜を横断して葉緑体に持ち込む様子を解析するための2つの異なる技術の記述が含まれています。LingとJarvisによる論文2では、分離された葉緑体を放射性標識された前駆体タンパク質とインキュベートするin vitro法について説明しています。葉緑体が前駆体タンパク質をどれだけ吸収するかは、SDS-PAGEおよびリンイメージングを用いてトランジットペプチド(リーダー配列標的)切断によって起こるタンパク質サイズの変化を監視することで決定されます。本手法は、数十年にわたり葉緑体タンパク質の導入をin vitroで研究してきた手法の発展であり、プラントが経験するストレス条件に対する輸入機構の応答性を評価するための追加ステップも含んでいます。一方、Leeらの論文では、蛍光タンパク質ドメインを持つキメラ前駆体タンパク質を完全な細胞(原形体)で一時的に発現させることに基づくin vivo法が説明されています。このアッセイでは、葉緑体タンパク質の輸入範囲を2つの方法で追跡できます。蛍光顕微鏡を用いて蛍光信号の局在と強度を監視すること、また、トランジットペプチド切断によって生じるタンパク質サイズの変化を免疫ブロッティングを用いて解析することによっても研究されました。これら2つの手法は非常に補完的であり、並列5で併用することで説得力のある結果をもたらします。
タンパク質が外膜を通って葉緑体に取り込まれ、そのトランジットペプチドが除去されると、そのタンパク質は基質(細胞小器官の主要な内部水域区画)で最終的な立体構造を取るか、複数の内部選別経路のいずれかに関与することがあります。非常に豊富な光合成複合体の場所として、サイラコイド膜はこのような内部選別の主要な目的地となっています。実際、チラコイドタンパク質の標的化は複数の機構的に異なる経路を含みます。Asherらの論文では、異なるティラコイドタンパク質転座経路の研究を可能にする一連のin vitro手法が説明されています。これらの方法は、単離されたティラコイドを放射性標識された前駆体タンパク質と、場合によっては濃縮ストロマール抽出物で培養するものです。タンパク質がティラコイドにどれだけ吸収されるかは、標的シグナルの切断評価や、SDS-PAGEおよびリン光イメージングを用いて外因性のサーモリシンプロテアーゼからの保護を評価することで監視されます。もちろん、チラコイドだけが葉緑体のサブ区画ではなく、他の区画も評価できることが望ましいです。この点で、Bouchnakらの論文8は特に重要であり、葉緑体をサブフラクショクションして包膜、ストロマ、ティラコイドに対応する高純度の試料を得る方法を説明しています。これらの分画は製備後、免疫ブロッティングや質量分析法で解析され、葉緑体タンパク質のサブオルガネラ局在に関する情報を豊富に提供できます。
タンパク質間相互作用および多タンパク質複合体アセンブリの解析に関しては、本コレクションでは2つの異なる手法が記載されています。Shanmugabalajiらの論文10では、葉緑体多タンパク質複合体の親和性精製法が提示されています。この技術は、関心複合体の成分を発現させた遺伝子組み換え植物の解析を含み、その複合体にアフィニティタグ(いわゆるタンデム親和精製タグ、TAPタグ)を搭載させるものです。このタグが不活性なマトリックスに強く結合する能力は、精製戦略の一部として活用されます。提示された方法は、特に葉緑体タンパク質輸入機構(包膜内に埋め込まれたTOCおよびTICと呼ばれる多タンパク質複合体)の精製に焦点を当てていますが、原理的には葉緑体11に存在する他の多タンパク質集合体の研究にも応用可能です。Rantalaらによる論文12では、自然条件下での電気泳動に基づく複雑な特性評価の補完的なアプローチが説明されています。ここで紹介する技術は、精製されたチラコイドから光合成複合体を穏やかな非イオン性洗剤を用いて解放し、その後ブルーネイティブ(BN)-PAGEを用いて分離するものです。錯体の一次分解の後、変性条件下で第二次元の電気泳動が進むことができ、これにより第一次元で特定された各錯体の個々の成分を可視化できます。TAP法と同様に、このネイティブPAGEアプローチは、オルガネラ内の他のタンパク質複合体の研究にも成功裏に応用可能です。いずれの方法でも、精製された複合体は免疫ブロッティングや質量分析など様々な方法で分析できます。
この方法コレクションに含まれる論文は、既存のリソース15,16と組み合わせることで、特にオルガネラルプロテオームに密接に関連する葉緑体生と機能の多様な側面の理解を大きく深めるために用いられる強力な補完技術群を示しています。葉緑体は陸上光合成の一次生産の大部分を担い、さらに植物の環境への反応(生物的・非生物的ストレスを含む)において重要な役割を果たすため、これらの驚くべき小器官は今後も長年にわたり世界中の基礎研究や応用研究の主要な焦点であり続けるでしょう。