方法論記事

チョウザメフィンと顎骨マトリックスからのコルチゾール抽出

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DOI：

10.3791/59961

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2019年9月10日

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1College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, 2Team of An Educational Program for Specialists in Global Animal Science, Brain Korea 21 Plus Project, Konkuk University, 3Persian Gesture, 4Department of Animal Science and Technology, College of Animal Bioscience and Technology, Konkuk University, 5Department of Animal Science, Animal Physiology, AgResearch, 6Faculty of Agriculture, Animal Science Department, Ferdowsi University of Mashhad

この記事について

サマリー

本研究では、チョウザメ種のフィンと顎骨からのコルチゾール抽出のためのプロトコルを提示する。フィンと顎骨コルチゾールレベルは、ELISAアッセイに続く2つの洗浄溶媒を比較することによってさらに調べた。本研究は、新しいストレス指標として顎骨コルチゾールの実現可能性を試験的に実施した。

要約

本研究の目的は、2つの洗浄溶媒(水とイソプロパノール)を用いてチョウザメのひれからコルチゾールを抽出する技術を開発し、3つの主要チョウザメ種間のフィンコルチゾールレベルの違いを定量化することを目的とした。フィンは、7匹のベルーガ(フーソ)、7シベリア(アシペンサー・バエリ)、5匹のセブルガ(A.ステラタス)を含む19匹の犠牲チョウザメから収穫された。チョウザメはイランの農場で2年間(2017~2018年)飼育され、韓国(2019年1月~2月)でコルチゾール抽出分析を行いました。5 H. husoからの顎骨もコルチゾール抽出に使用された。データは、SAS 環境の一般的な線形モデル (GLM) 手順を使用して分析されました。変動のアッセイ内係数とアッセイ間係数はそれぞれ14.15と7.70であった。簡単に言えば、コルチゾール抽出技術は、サンプル(300±10mg)を3mLの溶媒(超純水およびイソプロパノール)で2回洗浄し、80rpmで2.5分間回転させ、洗浄したサンプルを室温(22-28°C)で7日間空気乾燥し、さらに乾燥させた。50Hzでビーズビーターを32分間使用し、粉末に粉砕し、乾燥粉末(75±5mg)に1.5mLメタノールを塗布し、連続混合で室温で18時間のスロー回転(40rpm)を行います。抽出後、サンプルを遠心分離(9,500 x g 10分)、1mL上清を新しいマイクロ遠心管(1.5mL)に移し、38°Cでインキュベートしてメタノールを蒸発させ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を介して分析した。.種間のフィンコルチゾールレベル、または洗浄溶媒間のフィンおよび顎骨コルチゾールレベルに差は認められなかった。本研究の結果は、チョウザメの顎骨マトリックスが固体行列に対する有望な代替応力指標であることを示している。

概要

コルチゾールは、動物のストレスの信頼性の高い指標.コルチゾール抽出は、ストレスレベルとストレスの一般的なパターンを監視する研究者のための有効なフレームワークを提供します。例えば、これまでの研究では、ヒト1、2、サル3、4、牛5、羊6、および様々な方法を用いて毛髪コルチゾール測定の方法論的検証を行った。金魚7,8.魚種では、スケール、皮膚粘液、feces、血液9などのマトリックスにおけるコルチゾール測定が、魚の健康に関する情報を提供することが示されている。血液サンプリングが問題がある場合、またはスケールが不足している場合は、コルチゾール抽出のための代替行列が必要です。魚類において、代替行列は顎骨、ヒト歯10に類似した硬い組織を含むことができる。

魚のストレスレベルを決定するための新しい行列と検証された技術の開発は、チョウザメが環境ストレス因子11への長期暴露を経験することができるキャビア業界に特に関心があります。チョウザメの性別は2歳までには特定できず、チョウザメはスケールを持っていません。コルチゾールは成長段階2、7、12の間に固体マトリックスに徐々に蓄積するので、フィンや顎骨などの硬いマトリックスからの長期コルチゾール蓄積データは、ストレスに関する洞察を提供することができます異なる成長段階でレベル。対照的に、血液コルチゾールレベルは、死亡時のストレスレベルのスナップショットを提供し、長期的な飼育条件13,14の間にストレスを正確に表すことができない。キャビア市場での競争の激化に伴い、長期飼育(8~12年以上)のチョウザメ種間で健康な卵を生産するためのストレス条件を改善する新しいアプローチは、ますます重要な研究分野となっています。チョウザメのコストが高いため、収穫されたサンプルは非常に高価です(種や成長段階に応じて成熟した魚1匹につき$8,000-15,000)、研究プロジェクトの制限要因です。しかし、チョウザメのひれと顎骨からのコルチゾール抽出のための適切な技術の開発は、魚の養殖システムと野生の魚の両方に有用に適用することができ、消費のためのチョウザメの卵の品質と収穫を改善し、保全。

信頼性の高い結果6を提供するだけでなく、適切なコルチゾール抽出技術の選択は、サンプル調製中にマトリックス内に存在する他の化合物が出力を混同しないことを確実にするために非常に重要であり、一貫性のない結果です。フィンと顎骨コルチゾールレベルが周囲の水中のホルモンレベルの影響を受けるかどうかを決定することは同様に重要です.Heimbürge etal.15は、年齢、性別、妊娠、季節、色12、およびコルチゾールが抽出された身体領域を含む多くの因子がコルチゾールレベルに影響を与える可能性があることを示唆した。しかし、魚体マトリックス8におけるコルチゾール抽出に対する洗浄溶媒の影響に関する情報はほとんどなく、チョウザメの卵17を除くチョウザメにおけるこれらの効果に関する情報はほとんどない。

チョウザメのひれと顎骨からベースラインコルチゾールレベルを分析するには、魚を安楽死させる必要がありますが、このアプローチは生チョウザメの血液採取に必要な侵襲的な技術を伴いません。フィンおよび顎骨のサンプルは容易に集められ、これらのティッシュからの抽出は速く行うことができる。同様に、ホルモンの抽出と分析は簡単で、少し専門的な機器を必要とします。

本研究では、魚のひれや顎骨からのコルチゾールの抽出、洗浄、判定に関する新しい簡単に適用された技術を提示し、これらのマトリックスから測定されたコルチゾールレベルをストレスとして確実に使用できるかどうかを決定する目的で、指標。この技術の利点は、簡単で非侵襲的な8アプローチ、より少ないデータバリエーション、および信頼性の高い出力1、6、8、17が含まれます。この技術は、チョウザメのようなスケールのない魚種に適用可能である。この技術は、魚の屠殺、適切な洗浄溶媒の選択2、4、サンプル3、5、専門の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の適切な粉砕を必要とするアプリケーション5、7、および固体行列6へのコルチゾール源の組み込みに関する広範な知識。

ベルーガ(フーソ)、シベリア(アシペンサー・バエリ)、セブルガ(A.ステラタス)の3種からフィンの基礎コルチゾールレベルを得るために、2種類の洗浄溶剤(超純水とイソプロパノール)を塗布しました。)、各種の標準的な環境条件の下で。H.husoの顎骨はまた、チョウザメのストレスを評価するために使用されました。これはチョウザメの顎骨のコルチゾールレベルを測定する最初の研究です。本研究の結果は、性決定前の早期成長段階(~1年)におけるチョウザメ種の比較コルチゾールデータを提供する。

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プロトコル

以下の実験手順と方法は、韓国・春川大学の動物福祉倫理局によって承認された。

1. フィンコレクション

  1. 傷やストレスを最小限に抑えるために、ネットを使用してチョウザメを穏やかに捕獲します。
  2. 魚を淡水で注意深くすすいでから、安楽死の前に吸収性タオルで体表面を拭きます。
  3. 魚が驚いたり、意識を失ったりするようなプラスチックハンマーを使用して魚の頭を打つ。ナイフで頭を取り除きます。
  4. 体重 (g) と長さ (cm) を測定します。
  5. 安楽死後、殺菌された外科はさみを使用して、できるだけ体を近くに切断することによってフィンサンプルを収集します。
    注:個々の、非リサイクル吸収性タオルは、各魚に使用する必要があります。この研究で使用される種の記述統計は次の通りでした: ベルーガチョウザメ(H. huso):年齢 = 18 ± 2.1 ヶ月, 体重 = 2,700 ± 300 g, 体長 = 55 ± 5 cm;シベリアチョウザメ(A. baerii):年齢 = 9.6 ± 2.4 ヶ月、 体重 = 1,750 ± 250 g, 体の長さ = 45 ± 5 cm;セブルガチョウザメ(A.ステラタス):年齢=14±1.3ヶ月、体重=1,000±100g、体長=65±5cm。

2. コルチゾール抽出用フィン製剤

  1. フィンサンプル(組織1個につき1サンプル:~3g)を実験室の計量紙(107mm×210mm)に置き、乾燥するまで数日間室温で乾燥させます。
  2. アルミ箔のシートにサンプルをラップし、ラベル付きビニール袋に入れ、実験室に移します。
  3. 洗浄、コルチゾール抽出、乾燥、ELISA分析など、さらなる使用のために冷蔵庫にサンプルを保存します(図2)。

3. フィンコルチゾール分析

  1. デジタル分析スケール(精度:0.0001)を校正し、スケールパンに計量紙で300±10mgのサンプルを計量します。
  2. サンプルを洗います。
    1. 各サンプルを15L円錐ポリプロピレンチューブに移します。5,000 μL シングルチャネルピペットを使用して、各チューブに3 mLのイソプロパノールを追加します。
    2. 80 rpmでチューブを回転させて2.5分間回転させてコルチゾールを洗い流し、潜在的な外部汚染を除去します。この手順を 2 回繰り返します。
    3. 洗浄したサンプルを室温(22~28°C)で7日間エアドライ。
    4. 洗浄剤として超純水を用いて洗浄手順を繰り返す。
  3. 骨切断鉗子を使用して体組織から顎骨を抽出します。ステップ 1.5-3.2.4 を顎骨サンプルに適用します。
  4. 乾燥フィンまたは顎骨サンプル(75±5mg)を計量し、50 Hzでビーズビーターを使用して32分間粉砕します。
    1. 1000 μLピペットを使用して粉末フィンまたは顎骨を含む各チューブに1.5 mLのメタノールを届けます。サンプルをチューブローターに室温で18時間の遅い回転(40rpm)で置き、連続混合でコルチゾールを抽出します。
  5. コルチゾール抽出に続いて、室温で10分間9,500 x gでサンプルを遠心分離します。遠心分離後、各サンプルからコルチゾール(1mL)を含む上部有機層を収集し、別の1.5mLマイクロ遠心管に入れます。
    1. 38°Cでインキュベーションしてサンプルを乾燥させ、メタノールを蒸発させます。抽出したコルチゾールサンプルを一晩ヒュームフードの下に保管し、メタノールが消散できるようにします。
      注:コルチゾール含有層は、通常、色が黄色がかった。

4. フィンコルチゾール検出

  1. ELISAキットを使用する前に、乾燥したフィンまたは顎骨サンプルを室温で1.5時間解凍します。
  2. リン酸バッファー、渦、遠心分離機の 400 μL を 1,500 x gで 15 分間追加します。
  3. 各サンプル(25 μL)を複製して実行し、アッセイの精度と信頼性を向上させます。標準カーブの外側のデータを外れ値として削除します。
  4. マイクロプレートリーダーを450nmに設定し、μg dL-1に設定し、プレートの光学密度を読み取ります。
    1. 4 パラメータ非線形回帰曲線フィットのマイクロプレート ソフトウェアを使用します。ソフトウェアから得られたサンプルのコルチゾールレベルを、次の式を使用してpgmg-1に変換します。
      F = 10,000E (A/B) (C/D)
      ここで、F=(pgmg-1)におけるフィンコルチゾールレベルの最終値、E=乾燥抽出物を再構成するために使用されるアッセイバッファーの体積(mL)、アッセイ出力によって提供される濃度(μgdL-1)、B=余分に供されたフィンの重量(mg)。c=粉末フィンに添加されたメタノールの体積(mL)と、抽出物から回収したメタノールの体積(mL)をD=3に乾燥させた。

5.統計分析

  1. 各サンプルを洗浄手順の前に2つのサブサンプルに分割し、ELISAキットアッセイ(サンプルあたり2×2=4個の観測値)で複製して実行し、結果の試験力と信頼性を向上させます。
  2. SASソフトウェア環境における一般的な線形モデル(GLM)手順を測定データ18に適用することにより、2つの洗浄溶媒の効果とその相互作用を比較する。
  3. P < 0.05 の有意レベルで Tukey のテストを使用する平均間のテストの違い。0.05 < p < 0.10 を有意な差としてではなく傾向の証拠として受け入れます。

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結果

提示されたフィンコルチゾール抽出技術は、3つのチョウザメ種を用いて本研究で開発され、確認された。洗浄溶媒として超純水とイソプロパノールを用いて得られたコルチゾールレベルを比較した(図2)。H.huso顎骨からのコルチゾールを調べ、チョウザメの顎骨がフィンの代替マトリックスとして使用されるかどうかを決定した。洗浄溶媒、チョウザメ種、およびその相互作用の影響を表1に示す。コルチゾールレベルは、イソプロパノールで洗浄されたフィンサンプルにおいて、水で洗浄したものよりも高い傾向があった(p= 0.089)。チョウザメ種間のフィンコルチゾールレベル(p=0.525)に有意な差はなかった。洗浄溶媒とチョウザメ種との間に有意な相互作用はなかった(p= 0.947)。洗浄溶媒は、H.husoチョウザメ(p= 0.45)におけるコルチゾールレベルに有意な影響を及ぼさなかった(表2)。変動のアッセイ内係数とアッセイ間係数はそれぞれ...

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ディスカッション

チョウザメは、過去数千年を通じてほとんど適応を示していないので、「生きた化石」と呼ばれることがあります。チョウザメ属アシペンサーは、キャビアを生産する27種が含まれています。しかし、3種(ベルーガ、バエリ、セブルガ)は、世界的なキャビア供給のほとんどを生産します。チョウザメは、自然の生息地で過剰漁業や干渉に対して脆弱であり、したがって、他のどの種のグループよりも危機的に絶滅の危機に瀕しています。チョウザメは、1億5000万年前から存在していた生きている脊椎動物の最古のグループに属しています。アシペンサー種は成熟し、ゆっくりと成長します。一部(例えば、H.huso)は100年生きることができ、体重は2,000kgを超える。チョウザメは、スケールのない軟骨魚であり、口の前部に位置するスキュートと触覚バーベルと呼ばれる大きな骨板の5列によって特徴付けられています(図1)。これらの種と他の魚との生理学的な違いは、環境ストレスに対する減少した血漿(コルチコステロイド)応答を含む。私たちのフィンコルチゾール測定は、チョウザメの顎骨が循環...

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開示事項

著者は、開示する利益相反を持っていません。

謝辞

本研究は、農林水産技術開発協力研究プログラム(プロジェクトタイトル:気候変動に伴う家畜生産性変化分析、プロジェクトNo.PJ012771)、韓国農村開発局。また、この研究は助成金(いいえ)PJ01344604) 動物栄養生理学チーム、国立動物科学研究所、RDA、ソウル、韓国。著者らは、ペルシャのジェスチャーCEOモハマド・ハッサン・サルマンザデと彼のチームが、この研究で調べた3つのチョウザメ種から魚を提供したことを感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
廃棄ラテックス手術用手袋アンセル63754090
プラットフォームスケール-電子計量 100kgBaskoolnikoo101 EM
最大24mLの配送用血清ピペットベクトン・ディキンソン・ファルコン35-7550
マイクロプレートリーダー、450nmおよび490〜492nmのリファレンスフィルターBioTek8041000
試薬リザーバーBrandTech703459
ジッパー収納ビニール袋 Cleanwrap30cm x100m
イソプロピルアルコールDaejung chemicals &金属 5035-4400
メチルアルコール大中化学品 &金属 5558-4100
チューブローテーター - MX-RL-ProDLAB Scientific 824-222217777
1.5 mL および 10 mLの Eppendorf Research PlusM21518D
 15と25 μLEppendorf Research PlusR25623C
計量ペーパー (107 x 210 mm)Fisherbrand09-898-12B
ビーズビーター、50/60 Hz 2AGeneReach Biotechnology Corptp0088
500 rpmの軌道を持つプレートローテーター杭州ミュウ機器 MU-E30-1044
24 mLを保持するための使い捨てポリプロピレンチューブHyundai Micro H20050
ヒュームフードKwang Dong IndustrialKD 901-22128175
1500 x gLabo Gene 9.900.900.729
ミニボルテックスミキサーLMSVTX-3000L 
ロッテアルミホイルロール ロッテ アルミB0722X5FK5
デジタルスケールメトラー・トレド  ME204
超純水MDMMDM-0110
ピペットチップネプチューンサイエンティフィックREF 2100.N
大型魚網池H2OHoz135 
唾液コルチゾールキット唾液測定1-3002-4
骨切断鉗子Sankyo26-188A
50 μL と 200 μLVITLAB18A68756
タオルユハン キンバリー1707921546
ティッシュペーパー (107 × 210)ユハン キンバリー41117
少なくとも

参考文献

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