方法論記事

シトシン・グアニン・グアニン・トリヌクレオチドを脆弱なX精神遅滞-1遺伝子で繰り返す堅牢なポリメラーゼ連鎖反応性アッセイ

DOI：

10.3791/59963

⸱

2019年9月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脆弱X精神遅滞-1遺伝子で繰り返されるシトシン・グアニン・グアニン・トリヌクレオチドを定量化するための正確で堅牢なポリメラーゼ連鎖反応ベースのアッセイは、脆弱X症候群および脆弱X関連の分子診断およびスクリーニングを容易にするより短いターンアラウンド時間と機器への投資を伴う障害。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脆弱X症候群(FXS)および関連疾患は、脆弱X精神遅滞-1(FMR1)遺伝子プロモーターの5'非翻訳領域(UTR)におけるシトシン・グアニン(CGG)トリヌクレオチド繰り返しの拡大によって引き起こされる。従来、遺伝子解析装置上の毛細血管電気泳動断片分析は、FMR1のCGG繰り返しのサイジングに使用されるが、繰り返し数が200を超える場合の正確な測定には追加のサザンブロット分析が必要である。ここでは、FMR1のCGG繰り返しを定量するための正確で堅牢なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの方法を提示する。この試験の最初のステップは、脆弱なX PCRキットを用いたFMR1プロモーターの5'UTRにおける繰り返し配列のPCR増幅であり、続いてマイクロ流体キャピラリー電気泳動器具上のPCR製品およびフラグメントサイジングの精製、分析ソフトウェアを使用して既知の繰り返しを参照して、CGG繰り返しの数の後続の解釈。このPCRベースのアッセイは再現可能であり、200以上の繰り返し数(完全突然変異として分類)、55から200(変異)、46から54(中間)、および10を含むFMR1プロモーターのCGG繰り返しの全範囲を識別することができる45(通常)。これは、堅牢性と迅速な報告時間を持つFXSおよび脆弱なX関連障害の分類を容易にする費用対効果の高い方法です。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脆弱X症候群(FXS)および脆弱X関連疾患、例えば、振戦および運動失調症候群(FX-TAS)、および原発性卵巣不全(FX-POI)は、主にシトシン・グアニン・グアニン(CGG)トリヌクレオチド繰り返し拡張によって引き起こされる5'Xq27.31,2の脆弱X精神遅滞-1(FMR1)遺伝子の領域(UTR)。FMR1エンコードタンパク質(FMRP)は、mRNAの代替スプライシング、安定性、樹状輸送を調節または合成を調節することにより、神経発達およびシナプス可塑性に機能するポリリボソーム関連RNA結合タンパク質である。部分的な後転来タンパク質の3、4、5、6、7.

>200のCGG繰り返しサイズを有する動的変動は、FMR1プロモーター8の異常な過メチル化およびその後の転写サイレンシングを誘発する完全な突然変異として記述される。FMRPタンパク質の欠如または欠乏は、正常な神経発達を破壊し、FXS9を引き起こし、中等度から重度の知的障害、発達遅延、過活動行動を含む様々な臨床症状によって特徴付け、貧しい接触と自閉症の症状10,11,12.女性FXS患者のプレゼンテーションは、一般的に男性のそれよりも穏やかです.55 から 200、45 から 54 までの CGG 繰り返しサイズは、それぞれ前変異および中間ステータスとして分類されます。不安定度が高いため、CGGは、親から子孫13、14に伝染すると、おそらく変異または中間対立遺伝子のサイズを繰り返す。したがって、変異アレエレを有するキャリアは、繰り返し拡大のためにFXSの影響を受ける子供を持つ危険性が高く、場合によっては、中間ア列は、2世代15の完全な突然変異範囲にその繰り返しサイズを拡大することができます。 16.さらに、変異を有する男性はまた、遅発性FX-TAS17、18、19を発症するリスクの増加を伝え、一方、変異女性はFX-TASとFX-POI20の両方に対して素因がある。 21、22。近年、発達遅延や社会行動の問題を伴う自閉症スペクトラム障害が、FMR1アエレメント23,24の変異を有する小児において提示されていると報告されている。

正確なCGG繰り返しサイズを決定することは、FXSおよび脆弱X関連障害25,26の分類および予測に大きな意義がある。歴史的に、フラグメントサイジングとサザンブロット解析を伴うCGGリピート領域特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、FMR1 CGGリピート27の分子プロファイリングのゴールドスタンダードとなっています。しかし、従来の特定のPCRは、100から130以上の繰り返しを有する大きな変異に対して感受性が低く、完全な突然変異27、28を増幅することができない。さらに、繰り返しサイジングのための従来の遺伝子アナライザ上の毛細管電気泳動は、200以上のCGG繰り返しを持つFMR1 PCR製品を検出するのに失敗します。サザンブロット解析は、正常から完全な突然変異繰り返し数まで、より広い範囲の繰り返しサイズの区別を可能にし、(男性で)完全な突然変異を確認し、完全な突然変異を持つヘテロ接合性アエレを区別するために広く使用されてきました。明らかに通常の繰り返しサイズを持つホモ接合性のアエレ(雌)。ただし、繰り返しを定量化する解像度は限られています。さらに重要なのは、この段階的なテスト戦略は、労働集約的で時間がかかり、コストがかからないことにあることです。

ここでは、FMR1のCGG繰り返しを定量するための正確で堅牢なPCRベースの方法を提示する。この試験の最初のステップは、脆弱X PCRキットを使用してFMR1プロモーターの5'UTRにおける繰り返し配列のPCR増幅です。PCR製品は精製され、断片サイジングはマイクロ流体毛細血管電気泳動器具上で行われ、その後のCGG反復回数の解釈は、既知の繰り返しに基づく基準を参照して分析ソフトウェアを使用して行う。PCR フラグメントの長さは、CGG の繰り返し回数に直接比例するという根拠。PCRシステムには、高度にGCリッチなトリヌクレオチド反復領域の増幅を促進する試薬が含まれる。このPCRベースのアッセイは再現可能であり、FMR1プロモーターのCGG繰り返しのすべての範囲を識別することができる。これは、FXSおよび脆弱X関連障害の分子診断およびスクリーニングに幅広い応用を見出すことができる費用対効果の高い方法であり、機器への投資の時間と投資を少なくし、より広い範囲の臨床で利用することができる研究 所。

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プロトコル

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香港合同中国大学(参考文献:2013.055)

1. PCR増幅

  1. 開始前に、PCRバッファーミックス、サンプル希釈剤およびDNAサンプル(試験および参照DNAの両方)を-20°C冷凍庫から取り除き(材料の表を参照)、すべての試薬とDNAが完全に解凍されていることを確認するために室温で20〜30分間保管してください。渦と使用前に簡単にスピンダウン.
  2. 分光光度計を用いてDNAサンプルの濃度を測定する(材料の表を参照)。DNA濃度は25 ng/μLでなければなりません。必要に応じて、適切な濃度に希釈サンプルで希釈します。
    注:DNAを抽出し、タンパク質や高塩濃度などの干渉物質を除去するために精製する必要があります。非分解性の高品質DNAは、その後のPCR増幅および分析に使用する必要があります(A260/A280:1.8~2.0およびA260/A230:>1.0)。
  3. PCRプレートまたは0.2 mL PCRチューブのウェルにラベルを付け、参照および試験されたDNAサンプルを識別します。
  4. 試験サンプル、2つの参照サンプルおよび陰性制御サンプルに必要なPCR反応の数を計算します。PCRバッファーミックスの15 μL、サンプル希釈剤の2.6 μL、各反応に対するポリメラーゼ0.4μLを加えてPCRマスターミックスを調べます。
    注:サンプル希釈剤を使用した負の制御は、PCR性能を監視するために不可欠です。室温でPCRマスターミックスを準備し、氷の上にピペットしないでください。PCR バッファ ミックスは粘性です。チューブを混ぜてから、使用前に短時間スピンダウンします。
  5. PCRマスターミックスをステップ1.4から10~20sで渦を組み、スピンダウンします。各ウェルまたはチューブに混合物の18 μLをゆっくりと分配します。
  6. 渦とDNAサンプルをスピンダウンします。各DNAのピペット2μLを適切なウェルまたはチューブに入れ、最終的なPCR体積を20μLの最終PCR量に対して5回上下にピペットで混合します。
    注:反応あたりのDNAの総量は50-100 ngでなければなりません。DNA量が20μL PCR反応当たり150ngを超える場合、大きな反復アレルの増幅が不十分になる可能性がある。より低濃縮DNAの場合、PCRマスターミックス中のサンプル希釈剤の量をDNA溶液に置き換えることができます。
  7. 粘着板シーラー、またはチューブキャップでプレートを密封します。
  8. 密封されたPCRプレートまたはチューブを熱蓋付きのサーマルサイクラーに入れます。次の設定でプログラムを実行します: 95 °C 5 分、35 s の 98 °C での 25 サイクルの脱伝、35 s の 59 °C でのアニーリング、および 72 °C での拡張を 4 分間実行します。72 °Cで10分間の最終工程を行い、PCR製品をサイクラーで4°Cに保持し、さらなる処理のために除去します。
  9. PCR増幅後、製品を直ちに精製・分析するか、一晩+2~+8°Cに保存してください。あるいは、製品は-30〜-16 °Cで最大30日間保存することができます。

2. PCR製品の精製

  1. インキュベーターシェーカーを65°Cに予熱します。
  2. 各PCR反応について、セクション1から各PCR製品の20 μLに1x TEバッファーの80 μLを追加します(材料表を参照)。
  3. マルチチャンネルピペットを使用して、サンプル混合物をPCRクリーンアッププレート(材料の表を参照)に移します。
  4. プレートを覆い隠し、インキュベーターシェーカーに入れ、1,200rpmで10分間振りながら65°Cでインキュベートします。
  5. インキュベーションの後、真空器械を250 mbar(または25 kPa、188 mmHg、Hgの7.4)に設定し、15分間フィルターを通して溶液を吸引する。
  6. インキュベーターシェーカーを25°Cまで冷却します。
  7. 最初の吸引の後、真空をオフにし、各ウェルに1x TEバッファの50 μLを追加します。混ぜないでください。ステップ2.5の真空設定を使用して10分間溶液を吸引します。
  8. ペーパータオルの積み重ねにしっかりと押して、フィルタープレートの底部を乾かします。
  9. 各ウェルの底部中央に1x TEバッファの20 μLを追加します。プレートをインキュベーターシェーカーに入れ、1,200rpmで5分間振りながら25°Cでインキュベートします。
  10. インキュベーション後、ステップ2.9から新鮮な96ウェルPCRプレートに各精製PCR DNAの>15 μLを移管します。精製されたDNAは、直接分析することができ、または別の方法で必要になるまで-30〜-16°Cで保存することができる。

3. PCR製品のフラグメントサイジング

  1. 開始前に、DNA色素濃縮物、DNAゲルマトリックス、DNAマーカー、DNAラダー、精製DNAサンプルをステップ2から30分間室温まで平衡化します。
  2. プライミング ステーションを設定します。
    1. 試薬の新しいバッチを使用する場合は、注射器を交換してください(材料の表を参照)。
    2. ベースプレートを調整し、シリンジクリップのレバーを離し、上の位置までスライドさせます。
  3. サイジングソフトウェアを起動し(材料の表を参照)、ゲル染料ミックスを準備します。
  4. 渦色染料は10sのために濃縮し、スピンダウンします。ゲルマトリックスバイアルに25μLの色素を加えます。混合溶液をよく渦にし、スピンダウンします。
    1. ゲル色素ミックスをスピンフィルターに移します。スピンフィルターをマイクロ遠心分離機に入れ、室温1,500xg±20%で10分間スピンします。
      注:光から染料で溶液を保護し、使用後4°Cで保存してください。ゲル染料ミックスは、一度調製すると約15チップに使用できます。ゲル色素ミックスを使用する前に毎回30分間室温まで平衡させます。
  5. ゲル染料ミックスをロードします。
    1. 新しいDNAチップを プライミングステーションに挿入します。「G」とマークされたウェルにゲル色素ミックスの9 μLを追加します。プランジャーが1 mLマークに配置されていることを確認してから、プライミングステーションを閉めてください。
    2. シリンジ プランジャーをクリップに保持するまで押し下けます。正確に30 sを待ってから、クリップを離します。5 s を待ってから、プランジャーをゆっくりと 1 mL の位置に戻します。
    3. プライミングステーションを開き、「G」とマークされたウェルに9 μLのゲル色素ミックスを追加します。
  6. はしご記号でマークされたウェルに5 μLのマーカーを追加し、12個のサンプルウェルのそれぞれに5 μLのマーカーを追加します。井戸を空のままにしないでください。
  7. はしご記号でマークされた井戸にDNAはしごの1 μLを追加します。ステップ3.1または1μLの超純水(未使用ウェル)から1μLのPCR製品(使用済み井戸)を各12のサンプルウェルに追加します。指定された設定(2,400 rpm)で1分間、渦ミキサーと渦のアダプタにチップを水平に入れます。
  8. バイオアナライザ装置にチップを挿入し、5分以内にチップを動かします。
  9. アッセイが完了したら、使用済みのチップを直ちに取り外します。
  10. 電極クリーナーの井戸の1つに350 μLの脱イオン水をゆっくりと加えます。バイオアナライザの蓋を開け、電極クリーナーを入れます。蓋を閉じ、約10s.蓋を開き、電極クリーナーを取り外します。電極上の水が蒸発し、蓋を閉じるのを許可するために、別の10sを待ちます。

4. フラグメントサイジング結果の分析

注:参照サンプルは、未知のサンプルと同じバッチ内の同じサーマルサイクラーとバイオアナライザによって増幅および分析する必要があります。

  1. バイオアナライザの実行が完了したら、各実行のピーク データを .csv テーブル ファイルとしてエクスポートして、後続の分析を行います。
  2. 解析ソフトウェアを起動し、エクスポートされた .csv ピーク テーブル ファイルをステップ 4.1 から開きます。
  3. [QC]メニュータブを使用して、2 つの参照サンプルから 4 つの点(プロット上の青いひしばみとして表示)に適合した回帰線を確認します。回帰行の R2値は >0.98 (通常の値は 0.999 を超える) である必要があります。
  4. [結果]メニュータブで、フラグメントの長さが参照サンプルから派生した線形回帰標準曲線に対して自動的にプロットされる各サンプルの繰り返しサイズを確認します。ソフトウェアはまた、異なるガイドラインに従って各サンプルの分類を提供します。
  5. [エクスポート]メニュータブを使用して、繰り返し番号と診断分類を含む各サンプルの結果レポートと、各実行のサンプル情報と QC レポートの概要をエクスポートします。
    注:分析ソフトウェアは、米国医学遺伝学会(ACMG)または臨床分子遺伝学会/欧州人間遺伝学会(CMGS/ESHG)ガイドライン、および定義済み分類などのカスタム分類ガイドラインを使用することができます条件。

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結果

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変異雌参照試料(NA20240、リピートサイズ30及び80)及び全変異雌参照試料(NA20239、20及び200の繰り返しサイズ)のサイジング結果をそれぞれ図1Aおよび図1Bに示す。典型的には、フラグメントサイズプロファイルには、2つのマーカーピーク(下位マーカー50塩基対[bp]および上位マーカー10,380bp)が含まれる。通常、約 95 bp のサイズのプライマー複合体ピークがあります。参照サンプルを通じて、図1Cに示すように、4点の線形回帰標準曲線を構築することができます。

臨床正常、中間、突然変異、および完全突然変異サンプルの代表的なサイズの特徴を図 2A-Dに示す。特に、2つの膨張した断片ピークと1つの正常ピークを有するモザイク完全突然変異が図2E

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ディスカッション

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FXSはトリソミー21に次いで2番目に多い知的障害の原因であり、X連結精神遅滞30の約半分を占めており、男性4,000人に1人、女性8,000人に1人に影響を及ぼす可能性がある。さらに重要なことは、250~1,000人の女性のほぼ1人が変異を持ち、この頻度は男性26、31、32、33の250-1,600の1である。子孫に変異アエレを伝達する際にCGGが完全突然変異に繰り返されるリスクが劇的に上昇するので、例えば、母体の繰り返しサイズが100-20014の場合は4%から98%まで上昇し、CGGの判定より広い範囲で繰り返しサイズは、FXSの診断と生殖計画のための変異キャリアのスクリーニングを容易にすることができる。ここで紹介するPCRベースの方法は、FMR1プロモーターの5'...

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、NSFC緊急管理プロジェクト(助成金第81741004号)、中国国家自然科学財団(助成第81860272号)、広西省科学技術財団の主要研究計画(助成)の助成金によって支援されました。グラント・ノーAB16380219、中国ポストドクター科学財団助成金(助成金第2018M630993)、広西自然科学財団(助成金第2018GXNSFAA281067)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Agilent 2100 バイオアナライザー機器:0.2 mL PCR チューブAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 バイオアナライザー機器:1x TE バッファー、pH 8.0、Rnase フリーAmbionAM9849
Agilent 2100 バイオアナライザー機器:2100 バイオアナライザー機器AgilentG2939AA
Agilent 2100 バイオアナライザー機器:96ウェルPCRプレートサーモフィッシャーAB0800
Agilent 2100 バイオアナライザー機器: 電極カートリッジAgilent2100 バイオアナライザー機器の供給
Agilent 2100 バイオアナライザー機器: IKA ボルテックスミキサーアジレント2100 バイオアナライザー機器の供給機器
Agilent 2100 バイオアナライザー機器: サイジングソフトウェア 2100 エキスパートソフトウェアアジレント2100 Bioanayzerの器械の供給装置
Agilent 2100 Bioanalyzerの器械: テスト チップAgilent2100 Bioanayzer器械
供給装置 Agilent DNA 7500のキットAgilent5067-1506フラグメントのサイジ
ングのための Agilent DNA 7500のキット: DNA 7500 梯子 (黄色の帽子)Agilentキット: Agilent DNA 7500のキット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (カタログ番号: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (カタログ番号: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (カタログ番号: 5067-1506)
Agilent DNA 7500キット:DNAゲルマトリックスバイアル(赤いキャップ)AgilentInキット:Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500キット:電極クリーナーAgilentInキット:Agilent DNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500キット:スピンフィルターAgilentDNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
Agilent DNA 7500キット: シリンジAgilentDNA 7500キット(カタログ番号:5067-1506)
チッププライミングステーションAgilent5065-44012100 Bioanayzer機器
Cubee Mini遠心分離機GeneReachaqbd-i
フィルタープレート真空 マニホールド マニホールドメルクミリポアMSVMHTS00フィルタープレート真空用真空計 PCR製品精製用マニホールド
フィルタープレート真空 マニホールド:シリコンストッパーメルクミリポアXX2004718フィルタープレート真空マニホールド
フィルタープレート真空 マニホールド:真空ポンプメルクミリポアWP6122050フィルタープレート真空 マニホールド
フィルタープレート真空 マニホールド:廃棄物収集容器メルクミリポアXX1004705フィルタープレート真空マニホールド
FragilEase Fragile X PCRキットPerkinElmer3101-0010PCR増幅用
機器 の

参考文献

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