骨置換材料における骨成長と新生血管の評価のためのウサギにおける骨増強の卵子モデル

骨増強の石灰化モデルは、口腔および頭蓋骨外科領域におけるガイド付き骨再生(GBR)の概念を最適化することを目的として90年代に開発されました。このモデルの基本的な原理は、頭蓋骨の皮質部分の上に垂直に新しい骨組織を成長させることです。これを行うには、反応器(例えば、チタン-ドーム、-シリンダーまたは-ケージ)は、移植片によって行われる骨再生を保護するために頭蓋骨に固定される(例えば、ヒドロゲル、骨置換など)。このモデルの助けを借りて、チタニウムまたはセラミックケージ1、2、3、4、5、6、GBRの膜7、8、9 ^,10, 骨源因子^{11,12,13,14,15,16,17}, 新しい骨代用品^{12,16,17,18,19,20,21,22,23,24歳,25名,26歳,27歳,28歳,29}または骨再生^{プロセス30}中の新生血管形成のメカニズムを評価した。

翻訳の観点から見ると、石灰化モデルは、^顎31のクラスIV欠陥と比較することができる1つの壁欠陥を表す。目的は、内因性骨壁からの横面サポートなしで、皮質領域の上に新しい骨を成長させる。モデルは従って非常に厳しく、骨の皮質部分の上の縦の骨伝導の本当の潜在性を評価する。本明細書に記載のモデルが主に骨代用における骨伝導の評価に専念している場合、骨形成および/または骨化誘導も評価され、血管形成1、2、3、および ^4,5,6,7,^{8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24},^{25,26,27,28,29,30}.

本質的に倫理的、実用的、経済的な理由から、骨代謝と構造が^人間32と比較して非常に関連しているウサギで産石体モデルが開発されました。上記に引用された30の参考文献のうち、80%がウサギの石化モデル1、2、3、4、5、6、7、8^{を使用した,9,10,11},^{12,13,14,15,17,22, 23,26,27},^28,29,30,33,したがって、この動物モデルの関連性を実証する。2008年、ブゼンレヒナー群は、8つの骨置換物を同時^に20個(ウサギとの2つの骨置換物と比較して)比較できるように、子牛モデルをブタに移した。一方、うさぎの子牛体モデルを羊に移しました。簡単に言えば、チタンドームは羊の頭蓋骨の上に置かれ、新しい3Dプリント骨置換物の骨伝導を特徴付けた。これらの研究は、我々は石灰化モデルとその^分析16、21を開発し、習得することができました。

最後の3つの研究は、16、20、21、他のいくつかの調査と一緒に12、17、18、19、22^を引用しました。 ^23,24,26,27,^28,29, スクリーニングおよび特性としての石灰化モデルの大きな可能性を確認モデル。しかし、得られた結果は非常に満足できるものの、(1)チタンドームの使用は、X線拡散を妨げ、次に生きたマイクロCTの使用を妨げるといういくつかの制限を指摘しました。これらは組織学的処理の前に取り除くことができませんでした, 研究者は、ポリ(メチルメタクリレート)樹脂(PMMA)にサンプルを埋め込むために強制しました.したがって、結果として得られた分析は、主に地形に限定されました。(2)特に動物の費用、動物の物流、メンテナンス、手術に関連する費用が高い。(3) 大型動物に対する倫理的認可の取得が困難であること。

Polo,et al.²⁶による最近の研究は、ウサギのモデルを大幅に改善した。チタンドームは、材料の一定量で充填することができるクロース可能なシリンダーに置き換えられました。これらのシリンダーの4はウサギの頭蓋骨に置かれました。完成時にシリンダーを取り外して生検が金属フリーになり、サンプル処理に関する柔軟性が大幅に向上しました。ウサギの子牛モデルは、低コスト、容易な動物処理、サンプル処理の容易さと同時試験のために魅力的になりました。これらの最近の開発を活かし、チタンをPEEKに置き換えてシリンダーを製造することで、X線拡散や生きた動物へのマイクロトモグラフィーの利用を可能にすることで、モデルをさらに改良しました。

この記事では、麻酔と手術プロセスについて説明し、このプロトコルを使用して得られる出力の例、すなわち(免疫-)組織学、組織体学、生体および生体微小トモグラフィーを示し、骨のメカニズムを評価します。骨代替材料によって支えられた新しい骨合成を再生し、定量化する。

スイスの法的要件に従って、プロトコルは学術委員会によって承認され、州および連邦獣医機関(認可n°GE/16/16およびGE/100/18)によって監督されました。

1. 特定の装置および動物

1. シリンダー
   1. 内径5mm、外径8mm、高さ5mm(図1)を持つ、PEEKの横安定化タブを備えたマシンシリンダー。
   2. シリンダーの上部(厚さ1mm)に正確にクリップできる設計の機械PEEKキャップ。
   3. 手術前にオートクレーブによってPEEKシリンダーおよび帽子を殺菌する。
2. ネジ
   1. 自己掘削マイクロネジ(市販の純チタン(グレード5)製)を使用して、シリンダー(直径1.2mm、長さ4mm)を固定します。手術前にオートクレーブで殺菌する。
3. 動物
   1. 生後3ヶ月のニュージーランドの白ウサギ(オスまたはメス)を購入し、それぞれ約2.5kgの体重を持つ。
      注:ジュネーブ大学で飼育してウサギを得ました。

2. 手術

1. 外科用トレイ
   1. メス、はさみ、2つの鉗子、台座エレベーター、注射器(1、2、5、50 mL)、外科モーター、円形の外科バー(0.8 mmの直径)、針、無菌生理生理生理物、4つのシリンダー、8本のねじ、およびドライバーを準備しておいてください。
2. 前臨床治療
   1. 手術の1週間前に動物を順応させる。
   2. 手術後3日まで手術の2時間前に開始する予防抗生物質(口ごと5-10mg/kg(PO))を毎日提供する。
3. 麻酔と挿管
   1. ケタミンの筋肉内(IM)注射によって動物を鎮静する (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0.5 mL/kg) + キシラジン (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0.15 mL/kg).動物が眠るのを20分待つ
      深く(完全な筋肉のアトニー)。
      注:この前投薬は、シンプルで速く、痛みのない挿管プロセスを可能にします。深い鎮薬と麻酔は、ステップ2.3.8に記載されているように誘導される。
   2. 静脈内(IV)カニューレを耳から静脈の静脈に入れ、挿管が完了するまで閉じたままにしておきます。
      注:このIVラインは、それぞれ深部鎮鎮薬と麻酔のためのフェンタニルとプロポフォールを浸透させるのに役立ちます(ステップ2.3.8を参照)。
   3. 挿管が行われるまで純粋な酸素で5%のセボフルランを供給することにより、麻酔を維持します。
      注:このステップは、動物が覚醒の兆候(眼の動き、筋肉の収縮)を示している場合にのみ必要です。
   4. 10%リドカインを噴霧することにより、気管を局所的に麻酔する。ウサギを傾向のある位置に置き、垂直方向の延長で頭を維持します。
   5. 管内の気流が聞こえるまで、小径(2.5mm)の最初の気管チューブをウサギの気管にスライドさせます。これは喉頭を開き、決定的な管の挿入を容易にする。
   6. チューブの位置を気管に固定するために、チューブにガイド(挿管カテーテル)を挿入します。小径チューブを取り外し、ガイドの決定的な気管チューブ(4.9mm)をスライドさせます。
   7. ガイドを取り外し、気管内チューブの端にあるバルーンを膨らませ、気管にデバイスを密封してブロックします。チューブは所定の位置に留まるが、額に結ばれたレースを使用して固定することができる。 直ちに換気(7 mL/kg、周波数40/分)純粋な酸素で3%のセボフルランを持つ動物。
   8. 継続的にパーフューズ(耳静脈)フェンタニル(0.01 mg/mL、2-4 mL/h)を鎮鎮鎮を誘発し、2-4 mg/kg(2%)プロポフォール(20mg/mL、4-8 mL/h)は麻酔を誘発し、リンガーの酢酸塩を4mL/kg/hで維持し、等容性を維持する。
   9. 直腸温度プローブを配置します。また、プロセス全体の間に心臓機能、温度および酸素飽和度を監視します。
   10. 自律呼吸を監視することにより、麻酔の深さを制御します。動物が自律呼吸の徴候を示す場合は、プロポフォールとフェンタニルの小さなボーラスを分配する。
4. サイトの準備
   1. 手術台の上にマットレスパッドで覆われた加熱パッド(39°C)にウサギを置きます(火傷を避けるために)。頭皮を剃る。
   2. 刺激や乾燥を避けるために、目に潤滑ゲルを塗布してください。ポビドネヨウ素(10%)で皮膚を洗い流して部位を消毒する。その後、生殖不能の外科ドレープでウサギをドレープし、頭蓋骨のアクセス領域を切り取ります。
   3. ポビドネヨウ素で手術部位を消毒する(10%)二度目だ刺激や乾燥を避けるために、目に潤滑ゲルを塗布してください。
   4. 完全な外科用皿を置くドレープテーブル(無菌ドレープ)を準備する。
5. 手術部位開口部
   1. 頭蓋骨に2%(1mL)の皮下(SC)注射で局所麻酔する。
   2. 軌道から外眼突起(長さ約4cm)まで、腺矢状線に沿って皮膚(メスで)を切開する。骨膜が切開されていることを確認します。
   3. 切開の両側の骨膜(骨膜エレベーター付き)を穏やかに上昇させる。滅菌生理生理で部位をすすいでください。
6. シリンダー配置
   1. 頭蓋骨の中央分離帯と冠状縫合糸を見つけます (図 2A,B)。これらの解剖学的線は十字を形成することに注意してください。円柱は十字によって定義された各象限に配置され、円柱のエッジが縫合糸の上にないようにします(図2C)。
   2. 最初の円柱を左上の象限(左前頭骨)に置き、デバイスを平らに置くようにします。強い手圧で位置に固定し、抵抗が感じられるまでマイクロスクリューをねじ込みます。ネジヘッドがシリンダタブの表面と同じであることを確認します。
   3. 他のタブで同じ手順を繰り返し、シリンダーを頭蓋骨にしっかりと固定します。シリンダーが骨に密断されていることを確認します。
   4. 右上四半期(右前頭骨)、左下四半期(左頭頂部骨)、右下四半期(右頭頂部骨)の手順を繰り返します。
7. シリンダーが外接する領域内の5つの髄質内孔の骨掘削(図1)
   1. シリンダが外接する領域の中央に、骨に丸い穴を開けて生理物灌漑(直径0.8mm、奥行き〜1mm)の下に閉塞内穴を開けます。出血が現れることを確認します。
   2. 2 本のタブ ネジを通過する軸に沿って、シリンダの内側のエッジで、さらに 2 つの内側の穴をドリルします。垂直軸に沿って、円柱の内側のエッジでさらに 2 つの髄質内穴をドリルします。出血が現れることを確認します。
   3. 他の 3 つのシリンダ内で操作を繰り返します。
8. 材料サンプルとキャッピングでシリンダーを充填(図3)
   1. 製造元の指示または材料仕様に従って、所望の骨代替材料を準備します。
   2. 最初の円柱を材料サンプルでつばに塗り、キャップを取り付けて円柱を閉じます。他の3つのシリンダーでプロセスを繰り返します。
9. 手術部位閉鎖
   1. シリンダーの上の皮膚を断続的な非吸引性縫合糸で閉じます。
   2. 創傷にスプレー可能なドレッシングを適用します。

3. 術後治療

1. 鎮呼吸と麻酔(プロポフォールとフェンタニル灌流停止)の供給を停止し、自律呼吸の回復を確認します。
2. 動物が自律呼吸を回復したら、換気を止めてください。完全な目覚めの前に純粋な酸素の下で動物を維持します。
3. ブプレノルフィン塩酸塩SC(0.02 mg/kg、0.03 mg/mL、0.67 mL/kg)を注入し、手術後の鎮食剤として3日間6時間ごとに注射を繰り返します。
4. 水と完全な供給と通常のハウジングに動物を転送します。
5. 創傷治癒の約10日後に縫合糸を取り除く。

ここに記載されるモデルは、骨置換における骨伝導の評価に専念する。骨置換物の骨形成および骨化誘導(前)細胞化または生理活性分子を搭載した場合、血管形成1、2、3、4、ならびに評価されてもよい。5,6,7,8,9,10歳,11歳,12歳,13歳,14歳,15歳,16歳,17歳,18歳,19歳,20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27歳,28歳,29歳,30.運動学的研究は、分析するメカニズムおよび出力に応じて、手術後3日から3ヶ月まで使用することができる。早期および中間時間に説明を可能にする古典的なタイムラインは:2、4、6、8および12週間です。重要な結果を得るためには、1 回の時点で最低 6 サンプルが必須です。テストされる各サンプルは、各位置に少なくとも1回、時間ポイントごとに頭蓋骨に配置する必要があります(ランダムな割り当て)。最後に、シャムサンプル(例えば、凝固血液で満たされたシリンダー)は、プロトコル34に含まれなければならない。

手術が完了すると、生きた動物の骨断層撮影を使用して、骨の成長を異なる時点で監視することができます。図4A、Bに例を示します。追加の分析は、動物を犠牲にする必要があります (150 mg/kg ペントバルビタールの致命的な静脈内注射 (100 mg/mL).安楽死後、サンプルを切除し、シリンダーを慎重に除去する(図5)。生検は、リン酸緩衝生理食べ物と4%ホルムアルデヒドの溶液で固定される。骨の成長は、マイクロトモグラフィーを用いて評価することができる(図4 C,D)。試料はまた、(免疫-)組織染色のために処理され得る。その後、ヒストモルフォメトリック分析と特定染色がより具体的に分析を完了することが可能です(図6)。

図1:PEEKシリンダーの仕様。ねじ取り用の横安定タブに2つの穴(直径0.8mm)を掘削しました。円柱で区切られた領域内の頭蓋骨に掘削される5つの髄内穴(直径0.8mm)の位置は、赤い円を使用してマークされます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ウサギの頭蓋骨の代表的な画像と円柱の配置。左右の頭頂部と前頭骨を描いたウサギの頭蓋骨の中央分離帯と冠状動脈縫合糸を示す写真(A,B)。縫合糸の両側にシリンダを配置する(C)。スケールバー = 5 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:固定、充填、キャップされたシリンダーの代表的な画像。チタンネジでウサギの頭蓋骨に固定された4本のシリンダーを示す写真。各シリンダで区切られた領域内で、5つの髄内孔(直径0.8mm、深さ〜1mm)を丸いバーで灌漑下で掘削し、骨細胞の移動を可能にした。シリンダーは、キャッピングの前に異なる骨代替サンプル(キャリブレーションされたボリューム)で満たされました(1つの閉じたシリンダーのみが表示されます)。スケールバー = 5 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:微小断層(マイクロCT)解析からの代表的な画像。骨代替によって行われた骨の成長を評価する最終的な目標で、4シリンダーはチタンネジでウサギの頭蓋骨に固定され、骨代替材料で満たされました。(A) ライブイメージング:12週間でシリンダーの2次元横スキャン(14分、99kV/88 μA、解像度20μm)。(B)4週間のライブマイクロCT解析からの立体(3D)再構成(赤い円:円柱の骨代用品、赤い矢印:円柱が凝固した血液で満たされる制御)。(C,D)安楽死(12週)後、固定およびマイクロCT分析の前にシリンダーを除去した。(C) 2D 横断スキャン (57 分, 99 kV/88 μA 10 μm の解像度) とシリンダー内の全新規骨の 3D 再構成 (D)骨代替粒子(赤色)、新しい骨(緑)および骨床(黄色)が示されている。スケールバー = 2 mmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:4週間における生検の代表的な画像。安楽死(4週間)後、サンプルをブロック断面し、4%ホルマリン、マイクロCT分析および組織学的処理で固定する前にシリンダーを除去した。スケールバー = 5mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:(免疫-)組織学的セクションの代表的な写真。骨の代用品によって行われた骨の成長と新生血管を評価する最終目標で、4シリンダーはチタンネジでウサギの頭蓋骨に固定され、骨の代用品で満たされました。安楽死(12週)の後、固定および組織学的処理の前にシリンダーを除去した。(A) マッソン・ゴールドナー染色(50倍):骨置換は、緑色の新しい骨に囲まれたモーヴ粒子として現れる。(B) スライスをスキャンし、骨代替材料のデジタル抽出のために処理し、新しい骨(赤色)を容易に定量できるようにした。(C)CD31(矢印)の免疫染色は、内皮細胞および新生血管化プロセスの典型的なマーカーである。(D)いくつかの新しい毛細血管がCD31(矢印)を高発現する高度に新生血管化したゾーンの免疫蛍光染色(緑色)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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