このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ

5.6K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/59982

⸱

2019年8月2日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

この記事について

サマリー

この記事では、解離された一次海馬培養におけるグルタミン酸受容体(GluR)の人身売買を研究する方法を紹介する。この方法は、内因性または過剰発現受容体を薬理学的アプローチと組み合わせて標識する抗体供給アプローチを用いて、変調によってGluR表面発現を調節する分子機構の同定を可能にする。内部化またはリサイクルプロセス。

要約

外部刺激に対する細胞応答は、所定の瞬間に細胞表面で発現される受容体のセットに大きく依存する。したがって、表面発現受容体の集団は常に適応し、規制の厳格なメカニズムに従います。パラダイムの例と生物学で最も研究された人身売買イベントの一つは、グルタミン酸受容体(GluR)のシナプス発現の調節制御です。GluRsは、中枢神経系における興奮性神経伝達の大部分を媒介し、シナプスおよび神経レベル(例えば、シナプス可塑性)における生理活性依存的機能的および構造的変化を制御する。GLURを発現した表面の数、位置、およびサブユニット組成の変化は、神経機能に深く影響を及ぼし、実際には、これらの因子の変化は異なる神経因果関係に関連している。ここで提示される解離海馬原発性ニューロンにおけるGluR人身売買を研究する方法である。「抗体供給」アプローチは、表面および内部膜で発現されるGluR集団を差別的に可視化するために使用される。生細胞に表面受容体を標識し、異なる時間に固定して受容体のエンドサイトシスおよび/またはリサイクルを可能にすることで、これらの人身売買プロセスを評価し、選択的に研究することができます。これは、GluRの人身売買に影響を与える刺激および分子メカニズムに関する貴重な情報を得るために、薬理学的アプローチまたは改変された受容体の過剰発現と組み合わせて使用することができる汎用性の高いプロトコルです。同様に、他の受容体または表面発現タンパク質を研究するために容易に適合させることができる。

概要

細胞は、特定の細胞内局在度にタンパク質を動員し、その機能1に対して厳格な時空間調節を行うために、人身売買のアクティブなプロセスを利用する。異なる環境刺激に対する細胞応答は、受容体活性化によって引き起こされる細胞内カスケードに依存するように、このプロセスは、膜受容体にとって特に重要です。細胞は、受容体細胞内取引調節規則2を介して細胞表面で発現される受容体の密度、局在化、およびサブユニット組成を変化させることによって、これらの応答を修飾することができる。新たに合成された受容体を血漿膜に挿入し、既存の受容体のエンドサイトーシスおよびリサイクルと共に、表面発現受容体2のネットプールを決定する人身売買プロセスの例である。多くの分子機構は、タンパク質とタンパク質の相互作用やリン酸化、ユビキキテーション、またはパルミトイル化2などの翻訳後修飾を含むタンパク質の密売を調節するために協力する。

受容体の人身売買の調節は、高度に特殊化された構造を有する強い偏分細胞において特に必要とされる。パラダイムの例は、グルタミン酸受容体(GluR)3、4の規制された人身売買による神経機能の制御である。グルタミン酸は、主な興奮性神経伝達物質であり、シナプス神経伝達およびシナプス可塑性などの基本的な生理的神経機能を制御するために表面発現GluRを結合し、活性化する。変化したGluR人身売買が神経発達障害から神経変性疾患に至るまで、神経障害の広いスペクトルで観察されているという事実は、このプロセス5の重要性を強調している。したがって、GluRの人身売買を制御する分子事象を理解することは、研究の多くの分野で興味深い。

このプロトコルでは、抗体供給ベースの方法を使用して、一次海馬ニューロンにおける表面発現GLURのレベルを定量化し、内部化およびリサイクルの変化が観察された正味表面発現にどのように生じるかを評価する。特定の変異を持つ外因性受容体の薬理学および/または過剰発現の使用は、このプロトコルが異なる環境刺激に対するニューロン適応の基礎となる分子メカニズムを研究するための特に強力なアプローチになります。このプロトコルの有用性の最終的な例は、このようなモデルにおける表面発現の検査を通じて、環境の多因子変化(疾患モデルなど)がGluRの人身売買にどのように影響するかを調べている。

具体的な例を用いて、生理シナプス刺激を模倣する薬理学的操作[化学LTP(cLTP)]がAMPA型GluR(AMPA)の内因性GluA1サブユニットの表面発現を増加させる方法を最初に実証する。6.NMDA型GluR(NMA)のGluN2Bサブユニットの過剰発現リン模倣形態の人身売買も分析され、このプロトコルが特定の翻訳後のGluR人身売買の規制を研究するためにどのように使用できるかを示す。変更。これらの特定の例が使用されるが、このプロトコルは、抗原細胞外ドメインを有する他のGluRおよび他の受容体およびタンパク質に容易に適用することができる。細胞外ドメインに利用可能な抗体がない場合、細胞外エピトープタグ付き(例えば、フラグ、Myc-、GFPタグなど)タンパク質の過剰発現は、タンパク質標識を助けることができる。

現在のプロトコルは、特定のGluRサブタイプ密度を定量し、特定の抗体を使用して人身売買を行うための指示を提供する。このプロトコルは、1)総GluR表面発現、2)GluR内部化、および3)GluRリサイクルを研究するために利用することができる。各プロセスを個別に学習するには、セクション 1 と 2 から始め、セクション 3、4、または 5 のいずれかに進むことをお勧めします。いずれの場合も、セクション 6 と 8 (図1) で終了します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

海馬一次培養に関する研究は、ノースウェスタン大学動物ケア・使用委員会(プロトコル#IS00001151)によって検討され、承認されました。

1. ラベリング前の準備

  1. 一次海馬培養の準備と維持
    1. ポリD-リジンコーティング(0.1 mg/mL)18mmカバーメガネでメッキされた150,000個の細胞の密度で一次海馬培養物を調製します。解離された神経培養製剤のための優れたガイドは7、8で利用可能です。
      注:必要に応じて、培養物は、調製中のグリア増殖を避けるためにシトシンアラビノシド(Ara-C、DIV1から10mM)で処理することができる。
      注:フィブロネクチン(1mg/mL)またはラミニン(5mg/mL)などの代替コーティング試薬は、ポリD-リジンの代わりに使用することができる。
    2. B27および2 mM L-グルタミンを補充した神経基性培地の2mL/ウェルで37°Cおよび5%CO2で細胞インキュベーターで培養を維持する。
      注:L-グルタミンの代用品(例えば、グルタマックス)は、必要に応じて使用することができる。
    3. 毎週, メディアの半分のボリュームを削除し、補充された神経基性メディアの同じボリュームに置き換えます.
  2. オプション:変異および/またはエピトープタグ付き受容体のトランスフェクション
    注:    ニューロンは、受容体発現を可能にするために、分析時間ポイントの少なくとも3~4日前にトランスフェクトする必要があります。若いニューロン[日インビトロ6-9(DIV6-9)]の使用は、古い(DIV15-20)ニューロンよりも優れたトランスフェクション効率をもたらしますが、採用されたDIVに関係なく十分な数のトランスフェクション細胞(>20)を達成することができます。
    1. 12ウェルプレートの各ウェルについて、B27またはグルタミン補充を伴わない新鮮な神経基性媒体の100 μLの目的の構築物を含むプラスミドの1.5 μgを微小遠心管で希釈し、迅速に渦を混ぜることによって混合する。
      注:トランスフェクションを成功させるには、使用される神経基性媒体が可能な限り新鮮であり、理想的にはボトルの開封後1週間以内に行われることが重要です。
    2. 第2のマイクロ遠心管で、100μLの新鮮な神経基性媒体に適切なリポフェクション試薬の1 μLを混合し、穏やかに混合する。
      注:リポフェクション試薬混合物を渦にしないでください。新鮮なリポフェクション試薬の使用は、トランスフェクション効率を向上させることができる。
    3. 室温(RT)で5分間チューブをインキュベートします。
    4. リポフェクション試薬混合物をDNA混合物に滴下して加え、穏やかに混合し、RTで20分間インキュベートする。
    5. 各ウェルのメディアの量を1 mLの条件付きメディアに調整します。
    6. リポフェクション試薬-DNA混合物をウェルに滴下して添加する。
    7. 細胞をインキュベーターに戻し、タンパク質発現を少なくとも3~4日許可する。
      注:以下に概説する内部化およびリサイクルプロトコルの目的で、海馬ニューロンはDIV11-12でトランスフェクトされ、細胞外ドメイン(GFP-GluN2B)でGFPでタグ付けされたGluN2Bを発現する構成要素を用いてDIV15-16で画像化した。
  3. オプション:固定するまで条件付き培地中の薬物(慢性または急性)を用いた細胞のインキュベーション。
    注:    急性治療の場合は、標識する前に細胞の治療を開始してください。使用される薬物治療プロトコルに応じて、細胞はセクション2の間に薬物含有培養媒体で維持することができる。この例では、DIV21細胞は表面発現AMPAR9を増加させるためにcLTPプロトコルの対象となった。
    1. 細胞外溶液(ECS)のための交換条件付き媒体。
    2. RTで3分間ECSで300 μMグリシンを有する細胞を治療する。コントロールとして、姉妹カバースリップをECSで扱います(グリシンなし)。
    3. 細胞を37°C ECSで3倍洗浄し、ECS(グリシンなし)で細胞を20分間細胞インキュベーターに戻し、セクション2を続行します。
      注:ECS(mM):150 NaCl、2 CaCl 2、5 KCl、10 HEPES、30グルコース、0.001 TTX、0.01ストリキニン、およびpH 7.4で0.03ピクロトキシン。

2. 表面発現受容体のライブラベリング

  1. ラベル付け用のカバースリップの準備
    1. 試薬を節約し、操作を容易にするために、転写カバーはパラフィンフィルムで覆われた皿に細胞の側面を滑る。
      注:サンプルを乾燥させないことは重要です。
    2. インキュベーションおよび洗浄ステップのための37 °Cで条件付き媒体を保存し、維持する。
      注:18 mm カバースリップの場合は、抗体標識用のメディアの 75 ~ 100 μL と、内部化/リサイクル用の 120 ~150 μL のインキュベーションをお勧めします。
  2. 一次抗体による表面受容体の標識
    1. RTで15分間条件付き培養培養剤で希釈した一次抗体を用いた細胞をインキュベートする。
      注:GFPタグ付き受容体については、希釈1:1000のウサギ抗GFP抗体が用いられた。内因性GluA1については、1:200希釈時のマウス抗GluA1を用いて使用した。
    2. 真空ピペットを用いて抗体含有培体を慎重に吸引し、条件付き培養培具で細胞を3回洗浄する。
      注:条件付き媒体が利用できない場合は、1 mM MgCl2および0.1mM CaCl2を含むPBS+[リン酸緩衝生理食べ物(PBS)]を用いてすべての洗浄工程を行ってもよい。マイクロピペットを用いた手動吸引は、穏やかな真空吸引が利用できない場合に行われてもよい。

3. 表面表現(図2)

  1. 表面発現受容体の二次抗体標識
    1. PBS+で一度洗います。
    2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)と4%のショ糖をPBSで7~8分間インキュベートして細胞を固定します。
      注:メタノールインキュベーションなどの他の固定方法とは異なり、PFAはプラズマ膜を透過しないため、表面発現解析に適しています。最適な結果を出すには、作りたてのPFAを使用してください。-20 °Cでの4°Cまたは長期(30日まで)の貯蔵のPFAの短期貯蔵は十分な固定のために許容される。
      注意:PFAは既知の発癌物質である。取り扱い時には、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。
    3. 通常のPBSで細胞を3回洗浄する。
      注:あるいは、0.1 Mグリシンは、PBSの代わりにPFAを洗浄するために使用することができ、グリシンは、調製中の背景を増加させる可能性のある残りの固定剤をクエンチする。
    4. RTで30分間PBSで10%正常なヤギ血清(NGS)をインキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックする。
      注:ブロッキング時間は、ラベリングに悪影響を及ぼすことなく延長することができます。
    5. 蛍光タグ付き二次抗体をRTで1時間PBSで3%NGSで希釈してインキュベートし、一次抗体標識受容体(すなわち、表面発現)を標識する。
      注:これらの実施例では、Alexa 555-共役二次抗体の1:500希釈:GFP標識受容体に対するヤギの抗ウサギおよびGluA1用ヤギ抗マウスが用いられた。
    6. PBS 3xで細胞を洗浄します。
  2. 細胞内受容体の標識
    1. RTで5〜10分間PBSで0.25%トリトンX-100で細胞を透過化します。
      注:抗体標識の最初のラウンドがすべての表面エピトープを占めていることを確認するために、この透過化ステップは姉妹培養においてスキップすることができる。この場合、細胞内受容体に対するシグナルは得られるべきではない。さらに、前項2(すなわち、培養中の血漿膜の完全性を示す)で内部受容体が標識されていないことを確認するために、透過化工程は姉妹培養においてスキップすることができ、かつ一次抗体を、細胞内タンパク質(例えば、PSD-95またはMAP2)は、ステップ2.2.1で利用することができる。これらの条件下では、このプライマリからシグナルを取得しないでください。この場合、ウサギ抗PSD-95抗体(1:500)を用いた。
    2. RTで30分間PBSで10%のNGSでブロックします。
    3. セクション2.2で使用されるのと同じ一次抗体を用いて透過性細胞をインキュベートすることにより細胞内受容体を標識し、RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した。
      注:細胞内受容体を標識するための抗体希釈は、表面発現受容体の標識に必要とされるものと異なっていてもよい。GluA1の例では、同じ抗体希釈(1:200)が用いられた。
    4. PBSで細胞を3倍洗う。
    5. RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した第2の蛍光タグ付き二次抗体を有する標識。
      注:これらの実施例では、ヤギの抗マウスAlexa 647結合二次抗体(GluA1用)の1:500希釈が用いられた。
    6. PBSで細胞を3倍洗う。

4. 内部化 (図3)

  1. 抗体標識表面受容体の内部化
    1. 表面発現受容体および抗体洗浄(セクション2.2)の標識後、抗体なしで条件付き培地中の細胞を維持し、インキュベーター(37°C)に戻して内部化を可能にする。
      注:NMDA受容体の場合、内部化のために30分が推奨される。対照として、姉妹培養は、内部化プロセス中に4°Cで条件付き培養媒体で維持されてもよい。最小限の受容体の内部化は、これらの条件下で発生する必要があります。.
  2. 表面受容体の標識
    1. PBS+で細胞を一度洗います。
    2. PBSで4%のPFAと4%のショ糖を7~8分間固定します。
      注意:PFAを取り扱う際には、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。
    3. 通常のPBSで細胞を3倍洗います。
    4. 非特異的結合を防ぐためにRTで30分間PBSで10%のNGSをブロックします。
    5. 蛍光タグ付き二次抗体を有するサンプルを、RTで1時間PBSで3%NGSで希釈して、一次抗体標識受容体(すなわち、内部化されなかった表面発現受容体)を標識する。
      注:この例では、Alexa 555-共役ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500)を標識に用いた。
    6. PBSで細胞を3倍洗う。
  3. 内在性受容体の標識
    1. PBSで0.25%トリトンX-100で細胞を透過性5〜10分間。
    2. RTで30分間PBSで10%のNGSを持つインキュベーションによる非特異的結合をブロックする。
    3. RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した蛍光タグ付き二次抗体を用いたサンプルをインキュベートし、内在抗体標識受容体を標識する。
      注:この例では、Alexa 647結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500)が標識に使用されます。
    4. PBSで細胞を3倍洗う。

5. リサイクル (図4)

  1. 抗体標識表面受容体の内部化
    1. 表面発現受容体および抗体洗浄(セクション2.2)の標識後、抗体なしで条件付き培地中の細胞を維持し、インキュベーター(37°C)に戻して内部化を可能にする。
      注:NMDA受容体の場合、内部化のために30分が推奨される。
  2. 安定な表面発現受容体の遮断
    1. 内部化されていない表面発現受容体に付着した一次抗体上のエピトープを遮断するには、非結合Fab抗IgG(H+L)抗体断片(セクション2.2で使用される一次に対して)を有する細胞をインキュベートし、条件付き培地(条件付き培地で希釈)RTで20分の20 μg/mL)。この治療は、二次抗体との将来の相互作用を防ぎます。
      注:この例では、ヤギの抗ウサギファブ断片が使用された。
      注:対照実験:表面発現受容体の完全な遮断が起こったことを確実にするために、姉妹カバースリップはFabの有無にかかわらずインキュベートすることができる。培養はFab処理の直後に固定されるべきであり、両方の培養物はAlexa 555結合二次抗体でインキュベートされる。Fabインキュベート細胞におけるAlexa 555シグナルは、適切な抗体ブロッキングを示さない。
    2. 条件付き培養物で細胞を3倍洗う。
    3. 80 μMダイナソーレを含む条件付き培養培養培養培養で細胞をインキュベートし、細胞のさらなる内部化を防止し、細胞をインキュベーター(37°C)に戻し、内部化された受容体のリサイクルを可能にします。ダイナソールは、ダイナミンを阻害し、したがって、内部化を防ぐGTPase阻害剤です。
      注:NMDARリサイクルのために45分をお勧めします。Dynasore は、ダイナミン依存の内部化プロセス (NMDD の内部化など) を排他的にブロックします。しかし、他のシナプスタンパク質(ダイナミン非依存)の内部化は、ダイナソーレの存在下で依然として起こり得る。
  3. リサイクル受容体の標識
    1. PBS+で細胞を一度洗います。
    2. PBSで4%のPFAと4%のショ糖を7~8分間固定します。
      注意:PFAを取り扱う際には、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。
    3. PBSで細胞を3倍洗う。
    4. 非特異的結合を防ぐためにRTで30分間PBSで10%のNGSをブロックします。
    5. RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した最初の蛍光タグ付き二次抗体を有する標識細胞。
      注:この例では、Alexa 555-共役ヤギ抗ウサギ抗体(1:500)を標識に使用した。
    6. PBSで細胞を3倍洗う。
      注:PBS(5-10分)で長い洗浄は、準備の背景を減らすのに役立ちます。
  4. 内在性受容体の標識
    1. PBSで0.25%トリトンX-100で細胞を透過性5〜10分間。
    2. RTで30分間PBSで10%のNGSでブロックします。
    3. RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した第2の蛍光タグ付き二次抗体を有する標識。
      注:この例では、Alexa 647結合ヤギ抗ウサギ抗体(1:500)を標識に使用した。
    4. PBSで細胞を3倍洗う。

6. サンプルの取り付けとイメージング

  1. 適切な取り付け媒体の12-15 mLにセル側を静かに置くことによって細胞を取り付ける。
    注:過剰な取り付けメディアの吸引は、画像の品質を向上させます。
  2. 適切な共焦点顕微鏡上の画像細胞。
    注:ニューロンの厚さ全体を含む、0.35 μm ステップで 60 倍の倍率で Z スタックを画像化することをお勧めします。

7. 時間に関する考慮事項

  1. これは、いくつかの点で停止できる長いプロトコルです。必要に応じて、湿気のあるチャンバ内で4°Cで一晩ブロッキングおよび一次抗体インキュベーションステップを行う。
  2. あるいは、必要に応じて、マイクロ波組織プロセッサを使用して、固定後のインキュベーション時間を大幅に短縮します。すべてのステップで、「オン」設定のために30°Cで150 Wを使用してください。
    1. ブロックするには、プロセッサを2分「オン」、1分「オフ」、2分「オン」で実行します。
    2. 一次および二次抗体のインキュベーションステップの場合は、プロセッサを3分「オン」、2分「オフ」、3分「オン」で実行します。
      注:上記の変更をプロトコルに加えることで、品質に違いはありません。

8. 画像解析

  1. 複数のファイル形式と互換性があるため、画像解析を行うには、FIJI を使用することをお勧めします。データについては、ニコンND2ファイル形式の画像を取得しました。
  2. マクロ スクリプトは、FIJI によって事前に選択された異なるパラメータを簡単にバッチ定量化するために用意されています。マクロには、次の手順が含まれています。
    注:これらの例では、「集積強度」を測定した。
  3. FIJI と別々のチャネルでイメージ ファイルを開きます。
  4. Z は、各チャネル スタックを最大強度投影として投影します。
  5. 各チャネルのしきい値を下げる設定を行います。
    注:しきい値は、実験データセットごとに経験的に決定する必要があります。各チャネルは個別の低いしきい値を持つことができますが、同じデータ・セットのすべてのイメージについてチャネルしきい値を一貫して維持できることが重要です。
  6. 3 ~ 5 個のセカンダリ デンドライトまたは三次デンドライトを選択し、対象地域 (ROI) として保存します。
  7. 表面および細胞内チャネルにおける各ROIの統合密度を測定します。
  8. 表面チャネルの統合密度値を細胞内チャネルで割ることによって、各ROIの信号を正規化します。
  9. すべての制御および実験画像の測定を繰り返し、実験値を正規化して値を制御します(GluN2B WTまたは非グリシン条件)。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

グルタミン酸受容体の密売を研究するこのプロトコルは、細胞表面で発現される受容体と内部膜で発現される受容体の差分標識に基づいている。分離は、膜透過前後の受容体を標識することによって達成され、同じ一次抗体を用いて、異なるフルオロフォアに結合した二次抗体を用いる。プロトコルを含むオプションの手順で概説されているように、これは内部化やリサイクルなどの異なる受容体の人身売買プロセスを尋問するための非常に汎用性の高い方法であり、研究者のニーズに簡単に適応することができます(図1).

まず、神経表面で発現する受容体の定量化方法が提供される。このプロトコルは、基底表面発現の定量化を可能にするだけでなく、異なる薬物または突然変異が表面発現受容体の基底レベルを変化させる分子機構を研究する。表面発現受容体は、透過化前に一次抗体と二次抗体の両方をインキュベートすることによって最初に標識された。0.25%トリトンX-1...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

細胞とその環境との相互作用(例えば、他の細胞との通信、異なる刺激への応答など)は、細胞表面における受容体の正しい発現に大きく依存する。表面発現受容体含有量の迅速かつ微調整された調節は絶えず変化する環境への適切な細胞応答を可能にする。ニューロンの特定のケースでは、シナプス発現受容体の数、局在化、およびサブユニット組成の変化は、シナプス伝達、シナプス可塑性、シナプス形成、シナプス剪定3に大きく影響します。 5,10.したがって、受容体表面発現の正確な分析とその調節の根底にあるメカニズムは、研究の重要なトピックである。

受容体表面発現を研究できるモダリティの数が存在する。一般に、これらは、(i)表面発現受容体集団の生化学的単離、(ii)表面における受容体を可視化するイメージング技術、および(iii)受容体の結果を監視する機能的手法の3つの主要なカテゴリーに分類される。活性 化。これらのアプローチは相補的...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

我々は、ニコンA1共焦点顕微鏡の使用と実験の計画と分析における彼らの支援のためのノースウェスタン先端顕微鏡センターに感謝します。本研究は、NIGMS(T32GM008061)(A.M.C.)、NIA(R00AG041225)、および脳行動研究財団(#24133)のNARSAD若手研究者助成金(A. S.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
φ18mm#1.5厚手カバーグラスNeuvitroGG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondaryLife TechnologiesA21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondaryLife TechnologiesA21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mousesecondary Life TechnologiesA21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondaryLife TechnologiesA21245
B27Gibco17504044
CaCl2SigmaC7902
Corning Costar 平底細胞培養プレートCorning3513
DynasoreTocris2897
GlucoseSigmaG8270
GlycineTocris0219
ヤギ抗ウサギ Fab フラグメントSigmaSAB3700970
HEPESSigmaH7006
KClSigmaP9541
L-GlutamineSigmaG7513
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
マウス抗GluA1抗体ミリポアMAB2263
NaClSigmaS6546
神経基礎メディアGibco21103049
NGSAbcamAb7481
ParafilmBemisPM999
PBSGibco10010023
Pelco BioWaveTed Pella36500
PFAAlfa Aesar43368
PicrotoxinTocris1128
Poly-D-lysine HydrobromideSigmaP7280
ProLong Gold Antifade MountantLife TechnologiesP36934
Rabbit anti-GFP antibodyInvitrogenA11122
Rabbit anti-PSD-95 antibodyCell Signaling2507
ストリキニーネトクリス2785
ショ糖ΣS0389
スーパーフロストと顕微鏡スライドフィッシャー12-550-15
トリトン X-100シグマX100
TTXトクリス1078

参考文献

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896(2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067(2009).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

解離海馬培養表面受容体ラベル化受容体の内部移行受容体のリサイクル共焦点顕微鏡イメージング一次抗体インキュベーションFabブロッキングプロトコルPFA固定法
解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。