改変非縫合カフ技術を用いたマウス子宮頸動脈大動脈移植モデル

サマリー

ここでは、子宮頸部マウスモデルにおける非縫合カフ技術を用いたマウスにおける異所性大動脈移植のプロトコルを提示する。このモデルは、慢性同種移植片血管症(CAV)の基礎病理を研究するために使用することができ、その形成を防ぐために新しい治療薬を評価するのに役立ちます。

要約

強力な免疫抑制プロトコルの導入により、急性拒絶反応の予防と治療において明確な進歩が可能である。しかし、移植された固体臓器の長期的な結果のわずかな改善のみが過去数十年間観察することができた。この文脈において、慢性同種移植片血管障害(CAV)は依然として心臓、腎臓および肺移植における後期臓器不全の主な原因を表す。

これまでのところ、CAV開発の根本的な病因は不明のままで、効果的な治療戦略が現在欠落している理由を説明し、基礎となる病態生理学を研究するために関連する実験モデルの必要性を強調し、CAV形成。以下のプロトコルは、改変された非縫合カフ技術を用いたマウスヘテロトピック子宮頸動脈移植モデルを説明する。この技術では、胸部大動脈のセグメントが右一般的な頸動脈に配置される。非縫合カフ技術を使用することで、容易に学び、再現可能なモデルを確立することができ、縫合された血管マイクロ解毒の可能な不均一性を最小限に抑えます。

概要

過去60年間にわたり、固体臓器移植は実験的な手順から末期臓器不^全1の治療のための標準的なケアへと進化してきた。抗菌剤の改善、外科技術、免疫抑制連隊の進歩により、固形臓器移植の早期成功率は過去数十年にわたって有意に増加^した2.

しかしながら、長期移植片生存率は同様に改善^{されていない3.}CAVの開発は、長期生存を制限する主な^{要因4、5、6}である。この病理は、平滑筋細胞からなる同心円錐形層の形成によって特徴付けられるもので、移植された固体器官の血管の進行性の狭窄および連続した不灌流につながる。心臓移植レシピエントにおいて、CAV病変は移植^後3年後の患者の最大75%で診断することができる7。

CAVの病態生理学はまだ完全には理解されていない。これは、多数の免疫学的および非免疫学的因子に関連しているようで、その後の内皮活性化および^{機能不全8}による内皮損傷につながる。これまでのところ、CAVの予防のための因果治療オプションは存在せず、CAVの形成および潜在的な治療を研究するために再生可能な小動物モデルの必要性を強調する。

マウス大動脈移植モデルを用いると、病変のようなCAVは移植後4週間で見ることができる。これらの病変は、主に血管平滑筋細胞からなる、それによって、ヒト病理に似ている。多種多様なトランスジェニックマウスとノックアウトマウスのため、移植関連病理におけるマウスモデルの使用は、新しい治療オプションを特定し、その発達を理解するユニークな機会を提供します。しかし、移植された血管の直径が小さいため、マウスモデルの使用は、一般的に長い学習曲線および初期の高い合併症^率9に関連している。非縫合カフ技術の導入により、操作のこの最も困難な部分が容易になり、アナストモシスの直径が一定に保た^{れます10、11。}

プロトコル

すべての実験は、ドイツの動物福祉法(TierSchG)のガイドラインに従って行った。(AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015)

1. 動物用住宅

1. 実験では、レシピエント動物としてC57BL/6マウスを有する20〜25gの男性C57BL/6およびBALB/cマウスを、ドナー動物としてBALB/cマウスを使用します。
2. 健康監視のためのFELASAガイドラインに従って、バリア病原体のない施設で動物や家を購入する^12.
3. 濃縮ネスティング材料を持つ標準的なマクロロンケージにマウスを保管してください。12時間の昼/夜のサイクルで水とペレット食品へのアドリビタムアクセスを提供します。
4. 室温を22±2°C、相対湿度を55±5%に保ちます。

2. 受取人の準備

1. まず、ミダゾラム(5mg/kg;5mg/mL)、メデトミジン(0.5 mg/kg;1mg/mL)およびフェンタニル(0.05 mg/kg;0.05 mg/mL)の腹腔内注射でレシピエント動物(C57BL/6)を麻酔する。
   メモ:麻酔の正しい深さに達する必要があります 5- 10 分で.
   1. 後ろ足を鉗子でつまんで反射神経をチェックし、麻酔の深さを確認します。
2. 小動物用の電気毛抜きで頸部横領域のすべての毛髪をクリップし、綿棒で眼軟膏を塗布して、処置中に目が乾燥するのを防ぎます。
3. 顕微鏡の下の加熱パッドの上に動物をスフィンの位置に置き、皮膚感受性石膏ストリップで手術台に脚を穏やかにテープで留める。
4. 頭を後ろに傾け、アルコールで手術場を数回スクラブします。
5. 小さなはさみで右下下下に頸部切開から皮膚切開を行います。
6. 血管ペディクルの双極焼灼を介して顎下腺の右下葉を取り除き、その後のマイクロはさみで切除する。
7. 上部と下部の双極性焼灼を介して右胸鎖ドマスト筋を取り除き、その後マイクロシブで切除し、一般的な頸動脈にアクセスします。
8. 周囲の結合組織を細かい鉗子で引き離すことによって、一般的な頸動脈を可能な限り遠くまで、そして近接的に動員する。
9. 一般的な頸動脈の中央付近の間の距離を最小限に抑えて2つの7-0シルク合字を結び、合字間の細かいマイクロはさみで一般的な頸動脈を横断します。
10. 近位の結びつき端を袖口に通し、小さな動脈クランプで固定します。
    注:この手順で使用した袖口は、外径0.610mm、壁厚さ0.0254mmのポリイミドのチューブからマイクロシザーで切断されました。完成した袖口の長さは半分で、カフスプロセスに使用され、フルシリンダーで、残りの半分はハーフシリンダーです。
11. 合字を細かいマイクロはさみでできるだけ取り除き、血管壁に損傷を与えないように注意しながら、30G針でヘパリン化生理線(50 IU/mL)でルーメンを洗い流します。
12. 細かい血管拡張剤を使用して開いたルーメンをディストし、ポリイミドチューブの上にそっと引っ張ることによって、カフの上に頸動脈の切り株をエヴァート。
13. すぐに緩く前に結ばれた7-0シルクループで永遠の頸動脈を固定します。
    注:カフ処理をより滑らかで簡単にするために、手術前に直径約1.5mmの4 7-0シルクループをゆるくプレタイ。
14. 頸動脈のもう一方の端で同じ手順(2.10-2.13)を実行します。
15. レシピエント動物を脇に置き、大動脈セグメントが剥離するまで生理食合い場に潤いを与えます。

3. ドナー操作

1. ドナーマウス(BALB/c)をレシピエント動物と同じ方法で麻酔する。
   1. 後ろ足を鉗子でつまんで反射神経をチェックし、十分な麻酔を確認します。
2. 小動物用の電気毛切りク切りで腹部および胸部領域のすべての毛髪をクリップし、綿棒で眼軟膏を塗布して、処置中に目が乾燥するのを防ぎます。
3. 顕微鏡の下の加熱パッドの上に動物をスフィンの位置に置き、皮膚感受性石膏ストリップで手術台に脚を穏やかにテープで留める。
4. アルコールで手術場を数回スクラブします。
5. 小さなはさみで中腹腹開腹を行い、腸をわずかに上に押して下大静脈(IVC)を露出させる。
6. 30G針を使って1mLのヘパリン化生理行きに劣った大静脈(IVC)を注入する。
7. 腹部大動脈とIVCを小さなはさみで腎動脈の下に切り取り、ドナー動物を排泄する。ゆるやかに血液を吸収するために腹部に圧縮を置きます。
8. はさみで肋骨の両側転用で胸郭切除を行い、前胸壁を外科的クランプで頭蓋を傾けて、メディスティヌムを露出させる。
9. IVCと食道をマイクロハサミで横隔膜の真上に切ります。
10. 切り取られたIVC/食道を保持する鉗子でそれらを上方に傾け、その後、後方の胸部の胸部大腸へのアクセスを得るために、彼らのベースからマイクロシザーでそれらを切除することによって、心臓と肺を取り除きます。
11. 肋間動脈に損傷を与えないように注意しながら、周囲の結合組織と脂肪を細かい鉗子で引き離すことによって、周囲の組織から胸部大動脈を動員する。
12. 双極性焼灼鉗子で胸部大動脈からすべての枝を焼灼し、マイクロはさみを使用して横隔膜と大動脈弓の間の大動脈セグメントを切除する。
13. 切除した大動脈セグメントを30G針でヘパリン化生理食合いで洗い流し、血管壁に損傷を与えない注意を払いながら、残りの血液や血栓を除去し、移植片をレシピエント動物に移す。
    メモ:転送中に受領者のおよそ正しい位置に大動脈移植片を直接置きます。レシピエント動物の移植片の異なる端部を混乱させる問題がある場合は、遠位端の周りの緩い合字が役立つ可能性があります。

4. 着床

1. 細かい鉗子で常に閉じる頸動脈の上に近位カフの上にドナー大動脈セグメントの近位端を引っ張り、すぐに緩く固定された7-0シルクループでそれを固定します。
2. 遠位、大動脈移植片の自由な端をマイクロはさみでトリムし、移植片の長さが2つの袖口間の距離に収まるようにする。
3. 大小突起のもう一方の袖口で手順 4.1 を繰り返し、アナストモシスを完了します。
4. 逆行性灌流を可能にするために遠位クランプを取り外します。
5. 止血を達成した後、近位クランプを取り外してアナストモシスを完了します。
6. 最後に、6-0連続縫合糸で創傷を閉じます。

5. 術後ケア

1. 手術後の最初の6時間でマウスを注意深く監視し、移植後の最初の72時間は1日数回監視して合併症を即座に検出します。
2. 術後鎮痛の場合は、移植直後にブプレノルフィン(0.05-0.1 mg/kg)を移植したマウスを皮下に注射し、72時間ごとに12時間ごとに適切な長期鎮痛を提供する。

6. 大動脈移植片の説明

1. ミダゾラム(5 mg/kg;5 mg/mL)、メデトミジン(0.5 mg/kg;1mg/mL)およびフェンタニル(0.05 mg/kg;0.05 mg/mL)の腹腔内注射で移植動物を麻酔する。
   1. 後ろ足を鉗子でつまんで反射神経をチェックし、十分な麻酔を確認します。
2. 小動物のための電気毛切りク切りと腹部、胸部および子宮頸部領域のすべての髪をクリップします。
3. 顕微鏡の下の加熱パッドの上に動物をスフィンの位置に置き、皮膚感受性石膏ストリップで手術台に脚を穏やかにテープで留める。
4. アルコールで手術場を数回スクラブします。
5. 小さなはさみで中腹腹開腹を行い、腸をわずかに上に押して下大静脈(IVC)を露出させる。
6. 30G針を使って1mLのヘパリン化生理行きに劣った大静脈(IVC)を注入する。
7. 腹部大動脈とIVCを小さなはさみで腎動脈の下に切り取り、ドナー動物を排泄する。ゆるやかに血液を吸収するために腹部に圧縮を置きます。
8. 移植手術中に行われた皮膚切開に対応する小さなはさみで、頸部切開から右下下下下に皮膚切開を行います。
9. 遠位および近位カフと一緒に移植された大動脈移植片を識別し、鉗子で周囲の組織を取り除く鈍い。
10. マイクロはさみを使用して、2つの袖口の端と一緒に大動脈移植片を剥離するために、袖口で大動脈移植片に共通の頸動脈遠位および近位を切断する。
11. 大動脈セグメントを半分に切断し、さらなる分析(凍結断面、パラフィン埋め込み断面、スナップ凍結^{材料)13、14}のために検体を保持する。

結果

完全MHCミスマッチ移植モデルでは、移植後4週間で同心円錐層が見られる(図2)。この層は、主にSM22(成熟血管平滑筋細胞の選択的マーカー)に対する免疫組織学的染色として血管平滑筋細胞から成り立つ。前に述べたように、これらの血管平滑筋細胞は、慢性同種移植片血管症に見られる病変に対する病理学的である。さらなる分析のために、大動脈セグメントは、エラスティカ・ファン・ギーソン染色によって切り分け、染色されるべきである。ここで、ネオインチマル層は、内部弾性膜の弾性繊維と容易に分化することができ、チュニカ内膜をチュニカ媒体から分割する。

このモデルにおける潜在的な治療効果を評価するために、ネオインチマ-メディア比、ならびに発光断面領域狭窄は、それらの断面^{試料13、15}で測定することができる。説明した非縫合大動脈移植の改変モデルでは、300以上の大動脈移植で>91%の技術的成功...

ディスカッション

慢性同種移植片血管障害は、心臓の固形臓器移植後の後期移植片喪失の主な原因であり、腎および肺同種移植片の可能性が高^い8.これまでのところ、CAVの形成を防ぐために因果治療レジメンを開発することはできなかった。

CAVの病態生理学は多因子であり、免疫学的および非免疫学的^側面16を含む。移植におけるげっ歯類モデルの使用は、固体臓器移植における同種移植片拒絶プロセスの基礎となる病態生理学を理解する上で不可欠であり、拒絶反応を防ぐ新しい治療アプローチを同定するのに役立った¹⁷.CAVは、血管平滑筋細胞からなる新生層の形成を特徴とし、臓器^機能7のその後の悪化に伴う移植臓器の血管の連続狭窄および不正融合につながる。

記載されたマウス大動脈移植モデルでは、同心円状の新心形成は、移植後4週間で完全にMHC(H-2d〜H-2b)のミスマッチ胸部大動脈移植片で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Balb-c マウス (H2-d)	Charles River	Strain# 028	ドナー動物
双極焼灼システム	ERBE	ICC 50 / 20195-023	双極焼灼
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Strain# 027	レシピエント動物
Halsey 針ホルダー	FST	12501-12	針ホルダー
Halsted-Mosquito Forceps	AESCULAP	BH111R	カーブ クランプ
メディカル ポリイミド チューブ	ノードソン メディカル	141-0031	カフ素材
マイクロ セリフ	FST	18055-04	マイクロ ベッセル クリップ
マイクロ アドソン フォーセプス (鋸歯状)	FST	11018-12	標準鉗子
マイクロ セリファイン クランプ 鉗子	FST	18057-14	クリップアプリケーター
S&T鉗子 - SuperGripチップ(角度45°C;)	S&T	00649-11	ファインフォーセプス
S&T血管拡張鉗子 - 角度付き10°;(先端径0.2mm)	S&T	00125-11	血管拡張器
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	光
立体顕微鏡	ZEISS	SteREO Discovery.V8	顕微鏡
学生用細かいはさみ / 手術用はさみ - シャープ - 鈍い	FST	91460-11 / 14001-12	標準はさみ
Vannas-Tübingen スプリングハサミ (湾曲、8.5 cm)	FST	15004-08	マイクロシザーズ (湾曲)
Vannas-Tübingen スプリングハサミ (ストレート, 8.5 cm)	FST	15003-08	マイクロシザーズ (ストレート)