自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成

望ましくないオフターゲット効果のリスクが減少する可能性が高いことを考えると、抗原特異的免疫療法(ASI)はT1Dなどの自己免疫疾患に対する有望な治療法です。蓄積された証拠は、(プレプロ)インスリンに対する免疫応答がT1D¹において特に重要であるかもしれないことを示唆している。過去10年間、当社を含む複数のグループからの研究は、特定のMHCクラスII分子(B:9-23/MHCII)によるインスリンB鎖アミノ酸9~23を含むエピトープの提示がT1Dの開発において重要な役割を果たしていることを強く示唆している。マウスとヒト^2,3,4,5.B:9-23/MHCII複合体を選択的に標的にするために、mAb287という名前のモノクローナル抗体を生成し、他のペプチド6を含むホルモンインスリンまたは複合体に対する交差反応性を有^しない。MAb287はインビトロでの抗原提示をブロックし、mAb287を糖尿病前NODマウスに毎週投与すると、処置されたマウス6の35%におけるT1Dの発達を遅らせた。生体内の抗原の提示をブロックするためには、通常、高い循環濃度を維持するために頻繁な注射が必要である。我々は、T細胞を再プログラムするためにAb287の高い特異性を利用してこの困難を克服し、それによってT1D⁷に対する抗原特異的T細胞療法を改善できると仮定した。

細胞傷害性T細胞は、彼らの認知リガンドの単一のコピーが8、9、10を発現した場合、その標的^を殺すことができると報告されている。従って、B:9-23/MHCII特異的CD8T細胞は、親抗体よりも不要な抗原提示を排除する上で高い効率を有することが期待され、その効果を発揮するために同じAPC上の複数の複合体に結合する必要が生じやすい。CAR T細胞は、複数のヒト癌11、12、13の治療に使用されており、また、自己^免疫14においても有効であり続けであり、かつ有効でありうる。しかしながら、病原性ペプチド-MHC複合体に対する特異性を持つCAR-T細胞は、これまでT1Dの進行を修飾するために使用されていない。以下に説明する最適化されたCD8 T細胞伝達技術を用いて、我々は最近、これが実際に実行可能なアプローチ7を表す原理の証明を示した。

このプロトコルでは、効率的かつ合理化されたトランスダクションおよび拡張方法の概要を説明する。我々のプロトコルは、高効率のマウスCD8 CAR T細胞の生成を必要とする他の研究にも適用可能である。

マウスはトランスジェニックマウス施設で特定の病原体を含まない条件下で維持され、すべての動物実験はベイラー医科大学動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。

注:実験では、ウイルスとT細胞を並行して準備する必要があります。表 1は、プロトコルの概要を示しています。主要な試薬とバッファーは、材料の表に記載されています。我々は、このプロトコルにおけるAPCの特定の集団を対象とするCAR-T細胞の生成と拡大に焦点を当てる。

1. 単鎖Fab抗体(scFab)-CAの生成と検証

注:CA は通常、抗原ターゲティング ドメイン、スペーサー/膜ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインの 3 つの重要なドメインを含みます。各CARの正確な設計は、意図されたターゲットに依存するので、レトロウイルスの生成に関連する構造体の主要な特徴とは別に、このプロトコルでは詳細に説明されません。以下に説明するスタディに使用される CA の全体的な設計を図 1に示します。簡単に言えば、標的ドメインは、半剛性リンカーによって連結された親モノクローナル抗体からの重鎖の全軽鎖および可変およびCH1ドメインを含む。スペーサ/膜ドメインはマウスCD28からであり、シグナリングドメインはマウスCD28、CD137(4-1BB)、およびCD247(CD3)からの要素を含む融合である。これらの要素は、スプライスオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または適切な「遺伝子ブロック」の合成などの標準的な分子生物学手順によって組み立てられる。mAB287 CARの生成の詳細は、Zhangら7.cDNA配列は、要求に応じて著者から得ることができます。

1. CAR コンストラクトの組み立て
   1. 標的単鎖Fab抗体(scFab)と結合スペーサー/シグナリングドメインを別々に合成し、最終的な構築物を組み立てる「3点」ライゲーション^技術15を用いて最終構成を組み立てる(図1)。
      注:CARインサートの主な要件は、レトロウイルス発現ベクターpMSCV-IRES-GFP II(pMIG II)、または関連する誘導^体15へのライゲーションを可能にする側面制限エンドヌクレアーゼサイトを含むべきである。適切。
2. CAR サーフェス式の検証
   1. 標準プロトコルによって生成されたpMIG II由来レトロウイルス粒子を用いてハイブリドーマ細胞をトランスデュースする(例えば、Holst et al.^16)。
   2. CARベク^トル17からGFPの発現を検出するフローサイトメトリー分析を実行する。
   3. マウスκ鎖に対する標識抗体を用いたトランスプリドハイブリドーマのCARの染色表面発現(例えば、クローンRMK-45)17。
      注: ¹⁸.
3. CAR 特異性の検証
   1. 適切なプレート結合または細胞抗原を用してトランスプリエドマ細胞を刺激する。一晩共培養後、上清と分泌サイトカインを採取し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)7によりアッセイした。
      注:理想的には、各 CAR は、トランスダクションに使用する前に個別に検証する必要があります。この手順では、実験を一時停止し、後で再開できます。

2. ウイルス産生細胞のトランスフェクション(-4~3日目)

注:レトロウイルスは、フェニックス-ECO細胞を使用して生成されます (材料の表を参照)^19,20.感染の可能性のある薬剤の生成に適切な予防措置を使用する(好ましくは、指定されたBSL-2キャビネットとトランスフェクト/トランスネクテッド細胞を培養するための別個のインキュベーターを含む)。

1. フェニックス細胞の解凍(日-4)
   1. 解凍 2 x 10⁶フェニックスエコセル.複数のトランスダクションが計画されている場合は、フェニックスセルの数をスケールアップします。
   2. 10cmの組織培養皿に10mLの培地(10%胎児子牛血清(FCS)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM))でプレートする。
2. パッセージフェニックス細胞(日-3)
   1. 培地を取り出し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食生(DPBS)を5mLで洗浄します。
   2. 0.25%トリプシンの3mLを加え、37°Cで10%CO2雰囲気下で3分間インキュベートします。
   3. 細胞を収穫し、200 x gで3分間遠心分離によってペレットを収穫する。10 mLの新鮮な培地で細胞を再プレートし、37°Cでインキュベートします。
3. フェニックス細胞の照射(1日目の午後)
   1. さらなる細胞分裂を最小限に抑えるために、ステップ2.2に記載されているようにフェニックス細胞を集め、培地の5mLで再中断し、氷上にガンマ照射細胞(1000rad)を照射する。
      注:人的暴露を避けるために放射線作業には注意が必要です。
   2. 照射した細胞を遠心分離し、新鮮な培地で再中断し、2 x 10⁶細胞(培地10mL)/プレート/CARでプレートを再濁させ、インキュベートする。
4. トランスフェクション(0日目~朝)
   1. フェニックス細胞から上清を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の5mLで洗浄し、単層を乱さないようにプレートの側壁に7mLの還元血清培地(例えば、Opti-MEM)を慎重に追加します。細胞をインキュベーターに戻します。
   2. 14 mLの丸い底部ポリプロピレンチューブを2本取り、それぞれに1.5mLの減血液培地を加えます。1つのチューブに40 μLのトランスフェクション試薬を加えます(材料の表を参照)。
   3. 他のチューブに、Ab-CARプラスミド(ステップ1で生成)の15 μgと5 μgのエンベロープおよび包装プラスミド(5 μg pCL-Eco)を加えます。チューブを室温で5分間インキュベートします。
   4. ステップ2.4.2からチューブの側面に接触することなく、第2のチューブにドロップワイズでトランスフェクション試薬混合物を追加し、溶液を上下に3回ピペッティングして混ぜます。室温で少なくとも20分間インキュベートする。
   5. フェニックス細胞に3mLの混合物を滴下し、組織培養インキュベーターに入れます。
   6. 4-5 hの後、FCSの1 mLを追加します。37°Cで一晩培養する。
5. 中程度の変更(1日目)
   1. プラスミド/トランスフェクション試薬複合体を含む上清を取り除き、感染性物質を取り扱うための制度上の手順に従って処分する。細胞に新鮮な、事前に温められた培地の4 mLを追加します。
6. トランスダクション用収穫ウイルス(2日目)
   1. 滅菌注射器でフェニックス細胞からウイルス含有培地を回収し、残留細胞の破片を除去するためにフィルター(0.45 μm)を取り出し、新しいチューブに集めます。
   2. 200 IU/mLの最終濃度にrhIL-2ストックを追加します。直ちにウイルスを使用して誘導を行います(ステップ5.3)。フェニックス細胞に4mLの新鮮な培地を加え、インキュベーターに入れ。
7. 繰り返しウイルス収集(3日目)
   1. 手順 2.6 を繰り返しますが、新鮮な培地を追加する代わりに、感染性廃棄物としてフェニックス細胞を廃棄します。この上清はステップ5.4で使用される。

3. 一次CD8 T細胞の分離と活性化(1日~0日)

注:以前は、4~5週間で雌のNODマウスからCD8T細胞を採取し、21,22日に入り口から点数を採取する。IACUC承認プロトコルに従ってすべてのマウスを処理します。CD8 T細胞は、市販の陰性選択キットを用いて脾細胞から濃縮される。

1. CD3/CD28抗体を使用したコーティングプレート(1日目)
   1. 抗マウスCD3とCD28抗体の混合物の1 mL(PBSでは1μg/mLの両方)を24ウェルプレートの各ウェルに加え、一晩4°Cでインキュベートします。
   2. 翌日、マウスCD8T細胞を添加する前に、無菌PBSの1mLでプレートを3回洗浄する(ステップ4.1)。
      注:コーティングされるウェルの数は、必要な活性化されたCD8 T細胞の総数に応じて、実験ごとに異なります。
2. 脾細胞の採取(0日目)
   1. CO2吸入を用いて4〜5週齢の2匹のNOD雌マウスを安楽死させ、その後首を切り落とす。脾臓を収穫し、氷上の細胞培養皿に10 mL PBSに浸漬セルストレーナーに置きます。
   2. 細胞培養フードで、各脾臓を3~5個に切り、3または5 mLのシリンジの無菌プランジャーで組織を押し、脾臓の断片を強制的に分離し、細胞が金網を通過できるようにします。
   3. 1:4希釈赤細胞リシスバッファー(1脾臓に対してPBS3mLの3mLのリシスバッファーの1mL)で脾細胞を再濁させ、室温で5分間インキュベートして赤血球を静かに除去する。
   4. 次いで、血球計で細胞を計数するためのトリパン青色色素溶液で細胞懸濁液の10μLを希釈し、7分間350xgで遠心分離により残りの細胞をペレット化する。
3. CD8 T細胞の濃縮(0日目)
   1. メーカーの指示に従って、マウスCD8 T細胞絶縁キットを使用して、負の選択によってCD8 T細胞を濃縮します。
      注:高純度を確保するために、添加するビオチン化抗体の体積を計算する際に常に細胞数を切り上げます(例えば、計算された9.1 x 10⁷細胞に対して10⁸細胞に対して推奨される試薬の体積を使用してください)。
   2. 1 x 10⁸細胞あたりの400 μLの緩衝液および100 μLのビオチン抗体カクテルで細胞ペレットを中断し、冷蔵庫(4°C)で5分間よく混合してインキュベートし、抗体結合を可能にする。
   3. 300 μLの標識バッファーと200μLの抗ビオチンマイクロビーズを1 x 10⁸セルにつき加え、よく混合し、4°Cで10分間インキュベートします。
   4. マイクロビーズのバインドを待っている間、分離列を区切り文字に設定します。ラベリングバッファーの3 mLで洗い流してカラムを洗います。
   5. 40 μmセルストレーナーを通してビーズ/セル混合物の1000 μLを通過してから分離カラムにロードし、細胞凝集体を除去します。カラムフロースルーを予冷やした15 mLチューブに集めます。
   6. 製造元の指示に従ってカラムを洗い、すべての排水を同じチューブに集めます。細胞数(ステップ3.2.4と同じ)を決定し、350 x gで5分間遠心分離で集める完全なT細胞培地(FCSを含むRPMI-1640、2-メルカプトエタノール、rhIL-2(200 U/mL)、mIL-7(0.5ng/ITSL)の2mLで再中断して細胞を洗浄する、HEPESおよびペニシリン連鎖マイシン)および遠心分離を350 x gで5分間。
   7. 予温められた(37°C)完全なT細胞培地で細胞を0.25-0.5 x 10⁶/mLの濃度で再中断する。

4. T細胞活性化(0~2日目)

1. ステップ3.1.2からCD3/CD28抗体コーティングされた24ウェルプレートの各コーティングウェルに細胞懸濁液(0.25-0.5 x 10⁶/mL)の2mLを追加します。細胞を均等に分配するために旋回運動を使用してください。
   注:旋回モーションを使用してセルを追加して均等に分散し、エッジ効果を最小限に抑えます。細胞がウェルの端に沿ってクラスター化すると、伝達速度と細胞生存率の両方が減少します。
2. 対照として、同じ数のCD8 T細胞をプレートの単一の非コーティングウェルにプレートする。10%CO₂ガス化インキュベーターを用いて37°Cで細胞をインキュベートし、48時間使用します。
   注:48時間後、顕微鏡を用いて活性化を確認できる。活性化された細胞は、抗CD3/CD28抗体に遭遇しなかった細胞よりも大きくなります。

[図2はこちら]

5. 活性化CD8 T細胞の経度(1~3日目)

注:このプロトコルは、スピントランスダクション方式を使用します。37°Cの内部温度を維持することができるスイングアウトローターおよびティッシュ培養板のアダプターが付いている遠心分離機は要求される。最大の効率を確保するために、トランスダクションの日に、ウイルスを収集する前に遠心分離機を37°Cに事前に温めます。

1. 準備ヒトフィブロネクチン断片コーティングプレートの(1日目から2日目)
   1. 1日目に、24ウェルプレートのウェルにフィブロネクチン(PBSで50 μg/mL)のフィブロネクチン0.5mLを加え、4°Cで一晩インキュベートします。
      注:通常、トランスフェクトされたフェニックス細胞のプレートごとに2つのフィブロネクチンコーティングウェルが必要です。
   2. 2日目にフィブロネクチン溶液を取り出し、PBSで2%ウシ血清アルブミン(BSA)の1mLに置き換える。室温で30分間インキュベートし、非特異的結合部位を「ブロック」します。
   3. 処理されたウェルを無菌PBSの1 mLで洗浄します。洗浄液を取り除くと、プレートは使用する準備ができています。または、1週間まで4°Cで密封し、保存することができます。
2. 活性化CD8 T細胞の回収(2日目)
   1. 活性化されたCD8 T細胞を収穫し、トリパンブルーまたは適切な自動化された器具を使用して細胞生存率をカウントおよび計算する。
   2. 遠心分離によって細胞を収集し、5 x 10⁶生存細胞/mLで再中断してトランスダクションします。CO2インキュベーター内の完全なT細胞培地中の培養中の細胞の小さなアリコートを維持し、トランスプリケート細胞のその後の蛍光活性化細胞選別に対する制御を提供する(ステップ6)。
      注:48時間の活性化後、細胞の総数は約1.5倍増加し、生存率は95%を超えるはずです。
3. トランスダクション(2日目)
   1. フィブロネクチンコーティングプレートに、活性化CD8細胞懸濁液(0.5 x 10⁶細胞)を100μL添加します。次に、ウイルス含有培地の1.5~2mL(ステップ2.6から)を各ウェルに加えます。渦巻く動きを使って混ぜて細胞を均等に分配する(図2)。
   2. プレートをジップロックビニール袋に入れ、シールを締め付けます(二次封じ込めを提供します)。遠心分離機 2000 x gで 37 °C で 90 分です。
   3. 遠心分離機からプレートを取り出します。生物学的安全性では、キャビネットは慎重にビニール袋を取り外し、プレートの外側が媒体で汚染されていないことを確認します。
   4. 次いでプレートを専用の37°C_CO2インキュベーターに移します。4時間後、各ウェルから培地の1 mLを取り出し、予め温めた完全Tセル培地の1mLに置き換えます。CO₂インキュベーターのプレートを交換してください。
      注:変換された細胞からのすべてのメディアを感染性廃棄物として取り扱います。
4. 2回目の経度(3日目)
   1. 専用の生物学的安全キャビネットでは、蓋の上に置いて、加電細胞を含むプレートを傾斜させ、慎重に媒体のほとんどを取り除き(100〜200 μLを残して)、井戸の底部の細胞に接触しないようにします。
   2. 手順 2.7 で収集したウイルス含有培地を追加し、手順 5.3.2 ~ 5.3.4 を繰り返します。
      注:私たちの経験では、第3のトランスダクションは、めったに全体的な効率を向上しません。さらに、3回目のトランスダクションを使用すると、細胞の生存率が大幅に低下する可能性があります。細胞が0.5 x 10⁶/ウェルよりも高い濃度でめっきされた場合、T細胞は第2のトランスダクションステップに続く一晩インキュベーション後に合流に達してもよい。このイベントでは、3日目に4時間インキュベーション後に細胞を分割する。
5. 洗浄細胞(4日目)
   1. 各ウェルから1mLの培地を取り出し、残りの培地中の細胞を再転移させ、15mLチューブに移す。完全なT細胞培地の1 mLでウェルを洗浄し、各トランスダクションからプールされた細胞を含むチューブに追加します。
   2. 遠心分離機を350 x gで7分間、その後、完全なT細胞培地の2mLで再中断して2回洗浄し、ペレット化する。最後に培地の2mLで再中断し、細胞数を決定する。
      注: 1 x 10^{6 細胞}が最初に変換された場合、この段階での収率は ~3 x 10^{6 である}必要があります。
6. 転送
   1. 0.5-1 x 10⁶細胞のアリコートを2mLの完全T細胞培地に移し、新しい24ウェルプレートのウェルに移し、37°Cでインキュベートする。約48〜72時間のトランスダクション後の細胞はCAR発現分析および細胞選別の準備ができている。
      注:CAR-T 細胞の数は、通常、この段階で各 24 時間を倍増します。彼らを成長させないことは決して重要です。密度が 2 x 10⁶/mL より高い場合(または培地が明るい黄色になる場合)、すぐにセルを分割します。私たちの経験では、CAR-T細胞は、より大きな容器に移された場合よりも24ウェルプレートと12ウェルプレートでより堅牢に増殖します。

6. 蛍光活性化細胞選別(FACS)によるトランスプリケーション細胞の精製(5日目または6日目)

1. セルを収集します。
   1. 上下に複数回ピペッティングして細胞を再中断(泡立てを引き起こさない場合に注意)、15mLチューブに移し、遠心分離機を350 x gで5分間送り換えます。
   2. 1 x 10⁶細胞/mLでソートバッファー(ゲンタマイシンを含む無菌PBSで2%BSA)を再懸濁する。また、ステップ5.2から対照(未変換)CD8 T細胞を収穫する。
      注:2日目に1 x 10⁶細胞から、この時点で〜2 x 10^7のトランスプリケート細胞の収率が期待される。
2. 350 x gで5分間遠心分離してソートバッファーで細胞を1回洗い、ソートバッファーで1 x 10⁷セル/mLで再中断します。Foxp3^GFP補正制御用の小さなアリコート(ステップ6.4.1で使用する)を取り除き、残りを標識された抗マウスCD8(クローン53-6.7;抗体/5 x 10⁶細胞の0.2μg)で染色し、4°Cで20分間インキュベートします。
   1. 同様に、非トランス化されたCD8 T細胞のアリコートを染色し、抗CD8抗体を標識する蛍眼球に対する補償制御を提供する。
      注: これは細胞に有毒であるので、任意のバッファーにアジドナトリウムを追加することは避けてください。
3. 標識された細胞をソートバッファーで2回洗浄し、1 x 10⁷セル/mLでコールドソートバッファで再中断する。
4. セルを並べ替えます。
   1. CD8 GFP⁺陽性細胞をチルド済み完全なT細胞培地に並べ替える(図3B)。ポストソート分析のために小さなアリコートを取り、純度を決定します。
      注:ソートされた細胞の純度を最大化するためにタイトなゲートを使用する必要があります。100 μm のノズルを使用して、高いセルの生存率を確保します。選別されたセルが氷の上に保持される時間を最小限に抑えます。3時間以上氷の上に保持されているT細胞は、2時間未満で冷やされた細胞よりも回復にはるかに長い時間がかかります。したがって、3つの変換された細胞株をソートする必要がある場合は、2番目の行と3番目の行が0°Cで延長時間を費やすのではなく、最初の行がソートされている間に2番目の行を収集し、ラベルを付けます。CD28 や CD3 などの他の T セル マーカーの発現も監視できます (図 3C)が、ソートの目的には必須ではありません。
   2. (代替ソート戦略)バルク集団を染色する前に、トランスプリケートされたT細胞の小さな集団のCD8発現を分析する。純度が >99% の場合、バルク母集団は GFP 式のみに基づいて安全に並べ替えることができます。

7. 選別されたCAR-T細胞の拡張(5日目~10日目)

1. CAR-Tセル拡張
   1. 選別されたCAR-T細胞を1回洗浄し、2.5-5 x 10⁵セル/mLで予め温めた完全なT細胞培地に再び流し、24ウェルプレートに2mLアリコートをプレートします。
   2. 1~2日ごとにセルをカウントして分割します。通常、細胞数は10日まで毎日倍増し、生存率は95%を超えるままである。
      注:再刺激なしで、CAR-T細胞は10日目頃に増殖を停止し、最終的に死ぬ。したがって、T細胞機能アッセイおよび養子転移はそれに応じてスケジュールされるべきである。
2. 代替拡張戦略
   1. ソート後、200U/mLではなく100U/mLでrhIL-2を含む完全T細胞培地でCAR-T細胞を培養する。
      注:CAR-T細胞は、この培地でわずかに遅い速度で増殖する。しかし、彼らはしばしば再刺激なしで11日から13日まで増殖し続けます。したがって、この代替膨張戦略は、より多くの細胞を生成しないが、下流アッセイを実行するためのわずかに長い時間枠を提供する。

8. CAR T細胞の抗原特異性と機能性の検証

注:ペプチド/MHC複合体を標的とするCAR T細胞の結合特異性は、テトラマー染色7、23によって検証することができる。同様に、その機能性は、その認知リガンドによる刺激後のサイトカイン分泌または細胞傷害性を測定することによって確認することができる。エモリー大学のNIHテトラマーコアファシリティ(TCF)は、「テトラマー」および関連する染色プロトコルの推奨ソースです。

1. ペプチド-MHCテトラマー染色.
   1. 2 x 10⁵の培養CAR-T細胞の標識アリコートを100μLのソートバッファーで、蛍光標識抗原特異的および制御テトラマーの約0.6μgを2時間37°Cでインキュベートした。
   2. 350 x gで5分間遠心分離によって細胞をペレットし、その後、ソートバッファーと再遠心分離の0.5 mLで再中断することによって2回洗浄する。最後に、ソートバッファーの300μLで細胞を再中断し、フローサイトメトリーによって分析する(図4)。
      注:これらの研究では、通常、BV421標識 IA^g7-B:9-23(RE) (テスト) と IA^g7-HEL (対照) テトラマーを使用します。ただし、調査中の CAR に適した蛍動管/テトラマーの組み合わせは、代わりに使用できます。この場合、使用する各テトラマーに対して濃度と染色時間を最適化する必要があります。ソートされたCAR-T細胞と未ソートの両方のCAR-T細胞は、テトラマー染色に使用することができます。
2. リガンド刺激による特異性測定
   1. 適切なプレート結合または細胞リガンドを用いたサイトカインフリーT細胞培地の200μLで2x 10⁵を選別したCAR-T細胞をインキュベートする。
   2. 6-24時間後にELISAまたはメーカーのプロトコルを使用して細胞内染色によるサイトカイン産生を測定します。
      注:IA^g7-B:9-23 リダイレクトされたT細胞の研究のために、我々はIA^g7-B:R3または「空」IA g7^24、25を発現するM12C3マウスB細胞リンパ腫細胞で一晩細胞を培養する。次いで、上清を収集し、ELISA²⁶⁽図5)によって分泌されたマウスインターフェロンガンマ(IFN-γ)を測定する。

典型的には、このプロトコルを用いたトランスダクション効率は〜60〜90%である。図3に示す実験では、約ソート前に、CD8T細胞の70%がGFPを共発現した。彼らはまた、CD28とCD3(図3C)を共発表現しました。重要なことに、すべての「テスト」GFP+細胞もIA g7-B:R3テトラマーと共染色したが、対照テトラマーとは一致しない(図4)。同様に、並べ替えられたCAR-T細胞は、それぞれのコグネイトリガンドを発現する標的細胞との共培養後にのみ高レベルのIFN-γを分泌した(図5)。これは、トランスプリエテッド細胞が親抗体の標的に向けられたCD8エフェクターT細胞表現型を有することを確認する。

図1:CARレトロウイルス構造の概略図。CARは、適切なマウスモノクローナル抗体のFab断片に由来するターゲティングドメインと、マウスCD28、CD137およびCD247からのスペーサー/膜アンカー/シグナル伝達ドメインを含む。合成cDNAは、pMIG-IIレトロウイルス発現ベクターに挿入される。mAb287-CARの生成に使用される制限エンドヌクレアーゼ部位が示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:細胞分布に対する異なるめっき方法の効果(左)旋回モーションを使用してピペットされたセルは、偶数分布を示します。(右)細胞を井戸の中心に直接ピペットさせた。画像は350 x gで5分間回転した後に撮影されました。

図3:トランスメトリートT細胞のフローサイトメトリック解析細胞は、ステップ6.4に記載されているように、PE-Cy7共役抗CD8、AF647共役抗CD3、およびBV421共役抗CD28と共染色した。単一の実行可能セル上でゲートされたプロファイルが表示されます。(A) 染色されていない親のCD8 T細胞。(B) トランスプリケート細胞のPE-Cy7/GFPプロファイル。CAR発現細胞は、GFPレポーターによって識別される。(C)染色されたトランス化細胞をPE-Cy7/GFP二重陽性にゲートした。AF647/BV421 プロファイルが表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:未選分けCAR-T細胞のテトラマー染色。細胞は、ステップ8.1に記載されているようにBV421共役テトラマーで染色した。単一の実行可能セル上でゲートされたプロファイルが表示されます。(A) 試験IAg7-インスリンテトラマー。(B) 制御 I-Ag7-HEL テトラマー。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:CAR T細胞による抗原特異的サイトカイン分泌試験mAb287または対照mAb24.1 CARを発現するソートされたCD8 T細胞を、IA g7-B:R3、「空」IAg7、またはTFR-MBP-DTRL(mAb24.1のリガンド)を表すM12C3細胞と共培養した。24時間後、分泌されたIFN-γ ELISAをELISAにより定量した。両方のT細胞株の特異的刺激が観察された。データは3回の繰り返し実験の平均±SDを表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: CAR-T 生成プロトコルの概要。

MAb287およびそのデリバティブは、2014年に発行された米国特許によって保護されています。