疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

サマリー

タウは、細胞質に存在する神経タンパク質であり、そこで微小管を結合し、核の中で、アルツハイマー病関連遺伝子の変調を含む非伝統的な機能を発揮する。ここでは、細胞質タウからの干渉を排除しながら核タウの機能を調べる方法について述べる。

要約

タウは、ニューロンで発現される微小管結合タンパク質であり、その主な既知の機能は、細胞骨格安定性の維持に関連している。しかし、最近の証拠は、タウがDNA保護に関与する核を含む他の細胞内コンパートメントにも存在することを示し、rRNA転写において、レトロトランスポゾンの移動性および構造組織において核小体。我々は最近、核タウがVGluT1遺伝子の発現に関与していることを実証し、アルツハイマー病の初期段階におけるグルタミン酸放出の病理学的増加を説明できる分子機構を示唆している。最近まで、標的遺伝子の発現を調節する核タウの関与は、細胞質タウの寄与または他の効果の排除を妨げた技術的な制限のために比較的不確実であいまいであった核タウとは関係のない下流要因この不確実性を克服するために、核タウタンパク質によって特異的に変調された標的遺伝子の発現を研究する方法を開発しました。我々は、局在シグナルと細胞下分画の使用を結合するプロトコルを採用し、細胞質タウ分子からの干渉を排除することを可能にした。最も顕著なのは、プロトコルは簡単であり、他の細胞型および細胞状態におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能である古典的で信頼できる方法で構成されている。

概要

核内のタウタンパク質の機能は、核酸^{1、2、3、4、5、6}と密接に関連していることが示されているように、近年大きな関心を集めている。実際、最近のゲノムワイド研究では、タウが生体内⁷で原性およびインタージェニックDNA配列に結合することを実証した。ヌクレオラー組織における役割は、8、9、10、11が示唆されている。さらに、タウは酸化および高熱ストレス^{5、10、12、13}からのDNA保護に関与することが提案されているのに対し、変異タウは染色体不安定性およびアヌプロイディ^14、15、16に関連している。

これまで、核区画におけるタウの機能を研究する上での課題は、細胞質タウの寄与から核タウの具体的な寄与を解剖する難しさのためにほとんど未解決のままでした。さらに、核区画内のタウ分子に起因する機能は、これまで、核タウタンパク質の直接的な関与の明確な実証を欠いているため、相関に過ぎない。実際、レトロトランスポゾンの移動性またはrRNA転写またはDNA保護11、12、17、18、19におけるタウの関与は^、細胞質タウの寄与または核タウに関連しない他の下流因子の影響によっても説明され得る。

ここでは、核局在化(NLS)または核輸出信号(NES)でタグ付けされたタウコンストラクト0N4Rの使用と組み合わせて核コンパートメントを分離する古典的な手順を利用して、この問題を解決する方法を提供します。このアプローチは、細胞質コンパートメントからのタウ分子の波及による可能なアーティファクトに関連する複雑な問題を排除します。さらに、タウNLSおよびタウファミコン構築物は、それぞれ核コンパートメントからのタウ分子の濃縮または排除を誘導し、特定の機能における核タウ分子の関与に対する正および負の制御を提供する。このプロトコルは技術的に容易であり、タウ発現^20、21を再活性化する癌細胞などの他の細胞型におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能な古典的で信頼性の高い方法で構成されている。さらに、異なる区画に関連する生物学的機能を解剖するために、細胞質と核の両方に存在する他のタンパク質にも適用され得る。

プロトコル

1. 細胞培養

1. 培養SH-SY5Y細胞(ヒト神経芽細胞腫細胞株、CRL-2266)を完全培地(ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F12[DMEM/F-12]10%胎児ウシ血清[FBS]、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリンおよび100μ細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベーターで維持する。10cmプレートで細胞を成長させ、コンフルエントになると分割します。

2. 細胞分化

1. SH-SY5Y細胞を分化するには、めっき翌日に、10μMレチノイン酸(RA)を加えて培地を5日間完成させる。
2. 6日目は、培地を分化培地に置き換える:DMEM/F-12は50 ng/mL BDNF、2 mM Lグルタミンを添加した。FBS や抗生物質を追加しないでください。
3. 分化培地で細胞を3日間増殖させる。

3. キメラコンストラクトクローニング

1. タウシーケンス0N4R(383aa)の3'末端のフレーム内の制限酵素消化によるクローニングによりタウNLSコンストラクトを生成する3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAAAGGAAAAAAAAAAAAGaAGaAAAAAAGaA
   注:タウの3'終端の3xNLSは、マルチクローニングサイト(MCS)にXhoIおよびBamHI制限部位を利用する哺乳動物発現のためのpCMV-タウプラスミドに複製される。
2. タウ配列0N4R(383aa)の3'末端のフレーム内の制限酵素消化によるクローニングによりタウファネス構築物を生成する: 5'-AGTGAGCTGCAGAACTCTGAGGAGTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACAAA-3'。
   注:タウの3'終端のファミコンは、エコリおよびBamHI制限部位をMCSに利用する哺乳動物発現のためにpCMV-タウプラスミドにクローニングされる。
3. DH5α大腸菌株をステップ3.1または3.2のDNA100ngで変換し、LB-寒天プレート上のプレート細胞を100mg/mLアンピシリンで変換します。37°Cで一晩栽培しましょう。
4. 単一のコロニーを選択し、アンピシリンでLBの5 mLに細胞をスパイク。細胞を一晩攪拌中に37°Cで増殖させる。
5. DNAミニプレップ(材料テーブル)でプラスミドを抽出し、配列して構成を検証します。
6. DH5α大腸菌株を、LB-寒天プレート上の配列検証された構造およびプレート細胞をアンピシリンで変換します。37°Cで一晩栽培しましょう。
7. 単一のコロニーを選択し、アンピシリンでLBの5 mLに細胞をスパイク。細胞を攪拌中に37°Cで2時間増殖させる。
8. ステップ3.7の細胞をアンピシリンで200 mLのLBに入れます。37°Cで一晩栽培しましょう。
9. 細胞を3,500 x gで4°Cで10分間ペレットします。
10. DNAマキシプレップ(材料表)でプラスミドを抽出します。

4. 細胞トランスフェクション

1. ステップ1.1から種子400,000細胞を6ウェルプレートに、または8ウェルチャンバースライドで20,000細胞。プレート4サンプル:空ベクターでトランスフェクトされるコントロール細胞、タグなしタウでトランスフェクトされる細胞、タウNLSでトランスフェクトされる細胞およびタウファミコンでトランスフェクトされる細胞。
2. 製造業者の指示に従って、6ウェルプレートまたは200ngのDNAを使用して、各ウェルに対して400ngのDNAを播種した翌日。
   1. DNAとカチオン性脂質を250μL(6ウェルプレートの場合)または25μL(8ウェルチャンバースライドの場合)で、RTで5分間還元血清培地をインキュベートします。次に、それらを組み合わせてDNA脂質複合体を生成し、20分間インキュベートします。
   2. 培養培地を2mL(6ウェルプレートの場合)または250°L(8ウェルチャンバースライドの場合)に交換します。細胞にDNA脂質複合体を加え、一晩で37°Cでインキュベートする。
3. あるいは、カチオ系試薬ポリエチレニミン(PEI)を用したトランスフェクトDNA。
   1. 2μgのDNAと6μLのPEIを完全培養培地(6ウェルプレートのウェルそれぞれに)、または100μLの完全培養培地を用いた1μgのDNAと3μLのPEIを混合します(8ウェルチャンバースライドの各ウェルに対して)、渦とRTで10分間インキュベートします。
   2. 細胞にミックスを追加し、めっき量に達するために8ウェルチャンバースライドでウェルあたり6ウェルプレートまたは150°Lの完全培養培地あたり1.8 mLの完全培養培地を追加します。
4. トランスフェクションの翌日に培地を変更し、ステップ2.2の説明に従って分化媒体を追加します。

5. 免疫蛍光

1. 培養培地を取り出し、1x PBSで細胞をすすす。100%氷冷メタノールで細胞を3分間振とわずに固定します。固定液を取り外し、1x PBSで短時間洗浄します。
2. 室温(RT)で5分間1x PBSで0.1%非イオン性界面活性剤で透過する。簡単に、1x PBSで3回洗浄します。
3. ブロッキングバッファー(PBSでは0.1%トゥイーン20および1%BSA)を有する細胞を軌道シェーカーのRTで30分間インキュベートする。
4. 適切な一次抗体(例えば、マウスモノクローナル抗タウ13抗体)でインキュベートし、眼窩シェーカー上の4°Cで一晩ブロッキング緩衝液中で1:500希釈した。抗体溶液を取り出し、1x PBSで簡単に洗浄します。
5. フルオロフォアに共役した二次抗体(例えば、アレクサ・フルオ633に共役したヤギ抗マウス抗体)をRTで1時間ブロッキング緩衝液で希釈し、抗体溶液を1x PBSで短時間洗浄する。
6. 核を染色するには、DAPIで1:20,000を希釈して10分間ブロッキング緩衝液でインキュベートし、RTで10分間洗浄し、1x PBSで3回洗浄する。アンチフェード取り付け媒体を使用してスライドにカバースリップを取り付けます。

6. ウェスタンブロット

1. ステップ4.4から細胞ペレットを回収するには、培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄する。37°Cで4分間、500 μLのトリプシンをインキュベートします。完全なメディアと再サスペンドセルの等量を追加します。
2. チューブ内の細胞を収集し、5分間500 x gで遠心分離機を行います。遠心分離の終わりに慎重に上清を削除します。1 mL の PBS を追加し、5 分間 500 x gで遠心分離し、上清を慎重に取り除く。細胞ペレットを氷の上に保管してすぐに使用するか、-80°Cで凍結して長期保存します。
3. 総タンパク質抽出物の場合、細胞ペレットをリシスバッファー内の氷上で30分間インキュベートし(20 mM Tris-HCl pH 8、20 mM NaCl、10%グリセロール、1%オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール、分岐(材料表)、10mM EDTAを添加した。ペレットの豊富さに応じて、50 μLから100°Lのリシスバッファーを使用してください。
   1. 16,000 x gで抽出物を15分間遠心分離します。20μgのタンパク質を4x Laemmli緩衝液の5μLと混合してSDS-PAGE用のタンパク質サンプルを調製し、合計20μLの総体積で100°Cで5分間沸騰させます。
      注:試料は-20°Cで保存することができる。
4. 細胞内分画の場合、ステップ6.2の細胞を完全な培地で再サスペンドし、各サンプルにつき1x 10⁶細胞を収集する。500xgで10分間遠心分離機を行い、以下の工程で細胞ペレットを得た。
   1. 細胞内コンパートメントを分離するには、キット仕様に従って分画します。各画分を単離するには、ステップ6.4から細胞ペレットを対応する緩衝液でインキュベートし、遠心分離機を採取し、6.4.1.1-6.4.1.5で説明されているように次の緩衝液をペレットに添加する。細胞質抽出バッファー、膜抽出バッファー、核抽出バッファー、核抽出バッファーを5 mM CaCl₂および3 U/μLマイクロコッカルヌクレアーゼおよびサイト骨格抽出バッファーで補完します。
      注:すべてのバッファーは、プロテアーゼ阻害剤で補う必要があります。.セルペレットの体積に応じてバッファーの体積をスケールします。
      1. 細胞質画分を単離するには、プロテアーゼ阻害剤を4°Cで補充した氷冷細胞質抽出バッファーを100μLでインキュベートし、4分間500×gで500xgで500×500gで5分間穏やかに混合し、上清を予冷チューブに移す。
      2. ステップ6.4.1.1からプロテアーゼ阻害剤を補充した100μLの氷冷膜抽出バッファーをペレットに加え、4°Cで10分間穏やかな混合でインキュベートし、4分間4分間、上清を集めます。
      3. 可溶性核分率については、ステップ6.4.1.2からペレットにプロテアーゼ阻害剤を補充した核抽出バッファーを50μL添加し、渦を加える。4°Cで30分間インキュベートし、5分間4°Cで5,000 x gで遠心分離し、上清を回収する。
      4. 不溶性核分率の場合は、プロテアーゼ阻害剤を添加した核抽出バッファー50μLを_、CaCl2およびマイクロコッカルヌクレアーゼをステップ6.4.1.3からペレットに添加し、ボルテックスを添加する。37°Cで5分間インキュベートし、再び渦を入れ直します。RTで16,000 x gで遠心分離し、上清を集める。
      5. 細胞骨格分率については、ステップ6.4.1.4からペレットにプロテアーゼ阻害剤を補充した50μLの細胞骨格抽出バッファーを添加し、渦を踏む。RTで10分間インキュベートし、16,000 x gでチューブを5分間インキュベートし、上清を回収してペレットを廃棄します。
         注:キット プロトコルに示されているように、セルの体積に応じてバッファーボリュームをスケーリングします。インキュベーションおよび遠心分離時間および温度22、23、24、25、26、27、28、29の詳細については^、キットプロトコルを参照してください。あるいは、洗剤を用いて、イオン強度と遠心分離速度を上げることによって、細胞異性、膜結合、細胞骨格および核画分を分離する任意の標準的な方法³⁰を使用する。標準的な核抽出バッファーを利用して、可溶性核分率と不溶性核分率を分離します。試料は-20°Cで保存することができる。
   2. SDS-PAGEの場合は、ステップ6.4.1.1-6.4.1.5から得られた細胞内分率の20°Lに4x Laemmliバッファーの7μLを追加し、5分間100°Cで沸騰させます。
5. アクリルアミドゲルにサンプルをロードし、120Vの定電圧で電気泳動を行い、250mAで250mAでタンパク質を90分間転写します。
6. 適切なタンパク質ゲル電気泳動をチェックし、ポンソー染色溶液で膜を5分間インキュベートして、正常なブロッティングを行います。背景がきれいになるまで蒸留水で膜を洗いす。Tween 20(TBST)でトリス緩衝生理線をシェイカーで10分間洗い続けて汚れを取り除きます。
7. シェーカーのRTで1時間、ブロッキング溶液(TBSTで5%ミルク)で膜をインキュベートします。TBSTで3回5分間洗浄します。
8. ブロッキング溶液中の一次抗体(TBSTでは1%ミルク)で膜を4°Cで一晩ハイブリダイズする。TBSTで3回5分間洗浄します。
9. HRP共役二次抗体をHRP共役二次抗体と共役化し、RTで1時間のブロッキング溶液を行い、TBSTで5分間3回洗浄する。
10. 化学発光を用いてタンパク質バンドを検出します。ImageJ によってウェスタン ブロット バンドの強度を定量化します。ハウスキーピング遺伝子の産物にタンパク質発現を正規化する:核可溶性および不溶性画分のためのヒストンH2B、細胞質分率および総抽出物のためのGAPDH。

結果

細胞質タウタンパク質の寄与を避ける遺伝子発現における核タウの影響を解剖するために用いられる戦略を図1に示した。簡単に言えば、NLSまたはNESでタグ付けされたタウタンパク質は、それぞれ核コンパートメントに蓄積されるか、または核コンパートメントから除外されます。このアンバランスの機能効果は、VGluT1遺伝子の産物として測定される遺伝子発現の変化である。

プロトコルの説明に続いて、SH-SY5Y細胞をRAで5日間処理し、次いでBDNFで3日間処理し、有糸分裂後ニューロン様細胞を得た(図2)。RAおよびBDNFがない場合、未分化SH-SY5Y細胞は、ラウンダー形態を仮定し、細胞塊を形成する。予想通り、分化プロトコルを開始し、塊が巻き戻され、細胞は神経突起を広げます。分化の終わりに、細胞は分岐した神経突起のネットワークを介して均一に分布し、...

ディスカッション

核タウタンパク質が遺伝子発現に及ぼす影響を測定する方法について述べたい。このプロトコルを使用すると、細胞質タウの寄与は強く制限される。このプロトコルの重要なステップは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞の分化、細胞内分画および核コンパートメントにおけるタウタンパク質の局在化である。

まず、代表結果セクションに示すように、RAおよびBDNFを添加することによりSH-SY5Y細胞の分化は、培養中のニューロン様細胞の良好な調製を得るために重要である。種子化された細胞の密度は、密度が低いほど細胞増殖に影響を与える可能性があるため、特に重要である。さらに、細胞分画やウェスタンブロットのような多数の細胞を必要とする実験では、BDNF分化工程が末端分化を可能にする細胞増殖をブロックし、培養中の細胞数を制限することに注意することが重要である。代替差別化プロトコルは、BDNF の代わりに RA または NGF のみを使用します。しかしながら、RA後にBDNFを添加すると、より良い形態学的分化^32、33

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 633 ヤギ抗マウス IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
抗アクチン抗体	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	抗ウサギ WB 1:10,000
抗 GAPDH 抗体	フィッツジェラルド インダストリーズ インターナショナル	10R-G109a	抗マウス WB 1:10,000
抗 H2B 抗体	Abcam	ab1790	抗ウサギ WB 1:15,000
反Tau-13抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-mouse WB 1:1,000;IF 1:500
抗チューブリンα抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PA5-16891	抗マウス WB 1:5,000
抗 VGluT1 抗体	Sigma-Aldrich	AMAb91041	抗マウス WB 1:500
BCA Protein Assay Kit	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
ブロッティンググレードブロッカー	Biorad	1706404	無脂肪粉乳
BOVIN血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Dulbecco's Modified Eagleの 中低グルコース	ユーロクロン	ECM0060L
EDTA	シグマ-アルドリッチ	0390-100ml	pH = 8, 0.5 M
胎児ウシ血清	ユーロクロン	EC50182L
グリセロール	シグマ-アルドリッチ	G5516-500ml
ヤギ 抗マウス IgG-HPR	サンタクルス バイオテクノロジー	sc-2005	WB 1:1,000
ヤギ 抗ウサギ IgG-HPR	サンタクルス	バイオテクノロジーsc-2004	WB 1:1,000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Techチャンバースライド8ウェルガラススライド	nunc	177402
L-グルタミン	ユーロクロン	ECB3000D	100X
リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12566014	カチオン性脂質
メタノール	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM 還元血清中剤	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15140122	10,000 U/mL、100 mL
リン酸緩衝生理食塩水 (ダルベッコ A)	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche		4906837001 ホスファターゼ阻害剤
QIAGEN プラスミド マキシキット	Qiagen	12163	ステップ 3.10
レチノイン酸	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
培養細胞用細胞内タンパク質分画キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78840
サポートニトロセルロース膜	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833,920
TCS SP2 レーザー走査型共焦点顕微鏡	ライカ	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	非イオン性界面活性剤
トリプシン-EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック		15400054 0.50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD 退色防止封入剤	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems	プロメガ	A1330	ステップ3.5