方法論記事

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

DOI：

10.3791/59989

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2019年10月13日

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1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Chemistry, High Point University, 3Biotechnology Program and the Department of Molecular Biomedical Sciences, North Carolina State University

この記事について

サマリー

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この方法は、細胞接着の初期ダイナミクスを定量化し、アンカレッジ依存性細胞をフィブロネクチンに広めるのに有用である。さらに、このアッセイは、細胞拡散および/または細胞接着関連細胞内シグナル伝達経路に対する改変された酸化還元恒常性の影響を調製するために使用することができる。

要約

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細胞外マトリックス(ECM)への細胞の接着と広がりは、組織の発達および成人組織の恒常性のために不可欠な細胞プロセスである。興味深いことに、酸化ストレスはこれらのプロセスを変え、転移性癌などの疾患の病態生理学に寄与する。したがって、レドックス状態の摂動中に細胞がECM上でどのように付着し、広がるかを理解することは、正常および疾患状態に関する洞察を提供することができる。以下に説明するステップワイズプロトコルは、免疫蛍光ベースのアッセイを利用して、インビトロでのフィブロネクチン(FN)上の不死化線維芽細胞の細胞接着および広がりを特異的に定量する。簡単に言えば、アンカレッジ依存細胞は懸濁液中に保持され、酸化ストレスを誘発するためにATMキナーゼ阻害剤Ku55933に曝露される。その後、細胞をFNコーティング面にめっきし、所定の期間付着させた。付着したままの細胞は、接着の蛍光ベースの抗体マーカー(例えば、パクシリン)および広がり(例えば、F-アクチン)で固定され、標識される。データの取得と分析は、エピ蛍光顕微鏡や自由に入手可能なフィジーソフトウェアを含む一般的に利用可能な実験装置を使用して行われます。この手順は非常に汎用性が高く、様々な細胞株、ECMタンパク質、または阻害剤に対して改変して、幅広い生物学的疑問を調べることができます。

概要

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細胞マトリックス接着(すなわち、焦点接着)は、細胞の接着および広がりを媒通する大きく、動的な多分子タンパク質複合体である。これらのプロセスは、組織の発達、維持、および生理機能に不可欠です。焦点接着は、インテグリンなどの膜結合受容体と、細胞骨格アクチンを細胞外マトリックス(ECM)1にリンクする足場タンパク質で構成される。これらの複合体は、様々なシグナル伝達伝達経路の活性化を通じて細胞外環境に存在する生理学的手がかりに応答することができる。したがって、焦点接着は、指向性移行、細胞周期調節、分化、および生存1、2を含む多くの細胞プロセスに細胞外機械的手掛かりを伝播するシグナル伝達センターとして機能する。焦点接着を調節し、相互作用するシグナル伝達分子の1つのグループは、小さなGTPasesのRhoファミリーのメンバーを含みます。Rho GTPasesは、その特定の時空間活性化3を介して細胞移動および接着力力学を調節する主要なタンパク質である。当然のことながら、Rhoタンパク質機能の調節不全は、転移、血管新生、および他の人の病理学の数に関与している。特に興味深いのは、細胞還元状態が細胞移動および接着の調節において主な役割を果たす。活性酸素種(ROS)の増加などの酸化還元恒常性の変化は、Rhoタンパク質活性、ならびに接着性を調節することが実証されており、多くの細胞型およびヒト疾患4、5、6 、7、8.例えば、DNA損傷修復セリン/スレオニンキナーゼA-T変異(ATM)の変異によって引き起こされる神経障害運動失調性毛症-毛器形成症(A-T)に苦しむ個人は、転移性癌9のリスクが高い。 10.これらの患者および細胞株におけるATMキナーゼ活性の喪失は、遺伝的変異または化学阻害のいずれかを通じて、ペントースリン酸経路の機能不全による高レベルの酸化ストレスをもたらす7,11、 12.さらに、研究室からの最近の研究は、細胞骨格ダイナミクス(すなわち接着および広がり)をインビトロ5で活性化した直接的な結果として、A-TにおけるROSの病態生理学的役割を強調している。最終的に、Rhoファミリー活性化によって引き起こされる細胞骨格ダイナミクスのこれらの変化は、A-T患者5、13に記載された転移癌のリスクの増加につながる可能性がある。したがって、酸化ストレス中の細胞マトリックス相互作用の相互作用を理解することは、接着と広がりの調節に関する洞察を提供することができる。これらの研究はまた、これらのシグナル伝達プロセスにおけるRhoファミリーGTPasesの可能な役割に関するさらなる調査の段階を設定することができます。

ここに記載されているのは、ATMキナーゼ活性の阻害によって引き起こされる酸化ストレス中の接着アセンブリおよび広がりの初期細胞ダイナミクスを研究するためのプロトコルである。このアッセイは、ECMタンパク質フィブロネクチン(FN)へのアンカレッジ依存性細胞の接着の十分に特徴付けられたメカニズムに基づいている。懸濁液中で維持された細胞がFN上にメッキされると、いくつかのRho GTPasesは、アクチン細胞骨格リモデリング3、14の制御を調整する。形態学的変化は、細胞が円形と円形から平坦化および膨張にシフトするにつれて観察される。これらの観察と一致することは、ECMとの多数のマトリックス接着の開発である。これらの変化は、細胞が付着して15、16に広がるにつれて、最初の1時間の間にRac1を用いたRhoAの二葉性活性化に起因する。

細胞の拡散と同様に接着形態やダイナミクスを調べるために、様々な方法が利用されている。しかし、これらの方法は、高度な長期ライブイメージング全内部反射蛍光(TIRF)または共焦点顕微鏡システムに依存しています。したがって、ユーザーは、特殊な機器やソフトウェアへのアクセス権を持っている必要があります。さらに、これらのバイオイメージングシステムに必要なセットアップ時間は、特に複数の阻害剤または治療条件を同時にテストする場合に、早期接着イベントの捕捉を困難にします。

本明細通り、詳細な方法は、接着アセンブリおよびインビトロで広がるパラメータを評価する、簡単で経済的でありながら定量的な方法を提供する。このプロトコルは、エピ蛍光顕微鏡やCCDカメラなどの一般的に利用可能な実験装置を使用して行われます。このアッセイは、以前に実証されたATMキナーゼ活性の化学阻害によって引き起こされる酸化ストレスの期間後にFN被覆表面にアンカレッジ依存細胞を適用することを含む5。メッキに続いて、細胞は、指定された時間の長さのために付着し、付着することが可能です。未接続の細胞は洗い流され、付着した細胞は固定され、接着のマーカー(例えば、パクシリン)および広がる(例えば、F-アクチン)2、5に蛍光ベースの抗体で標識される。これらのタンパク質を視覚化し、エピ蛍光顕微鏡を使用して記録します。その後のデータ分析は、自由に利用可能なフィジーソフトウェアを使用して実行されます。さらに、この方法は、異なるECMタンパク質、様々な酸化剤/細胞培養条件による治療、または様々なアンカレッジ依存性細胞株を含む幅広い条件下で接着力を調べ、幅広い範囲に対応することができます。生物学的な質問。

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プロトコル

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1. 準備

注:以下に説明するプロトコルは、REF52細胞およびATM+/+またはATM-/----ヒト線維芽細胞での使用のために最適化されています。その他のセルの種類については、以下の「ノートおよびトラブルシューティング」のセクションで説明されているように、さらに最適化が必要になる場合があります。














      4. figure-protocol-1





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結果

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実験セットアップの一般的なスキーマ

図1は、REF52細胞の血清飢餓から始まり、後天蛍光画像の計算解析で終わる細胞接着および拡散プロトコルの一般的なスキーマを表す。プロトコルの主要な手順は、タイムラインに示されています。なお、プロトコルのステップ2は、FNコーティングされたカバーリップの調製について説明し、これはステップ3と同時に行われるべきである:血清飢餓REF52細胞を懸濁液に入れる前に(図1A)。蛍光顕微鏡検査用試料の固定前の治療群および細胞接着期間を示す模擬標識24ウェルプレートの一例(図1B)。

焦点接着定量のための免疫蛍光画像処理

REF52細胞を90分間懸濁して保持し、FN上でメッキし、さらに15分間付着させた。抗パキシリン抗体による固定および染色後、細胞の蛍光8ビットグレースケール画像を...

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ディスカッション

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ここで説明するプロトコルは、細胞拡散中の動的細胞骨格リモデリングのための多数のアンカレッジ依存性細胞型を迅速にスクリーニングする汎用性と経済的な方法である。特に、この方法は、細胞がFNに付着した場合の酸化ストレス時の応力繊維および焦点接着形成を定量的に調べる(図1A)。さらに、これらの細胞型は、細胞の付着および15、16、22の間に役割を文書化しているので、小さなGTPasesのRhoファミリーのメンバーに対する調節的役割を示唆する可能性がある。しかし、GTP結合、活性Rhoファミリータンパク質の関与の可能性を同定するには、追加の生化学的技術が必要となる。

提示されたプロトコルは、F-アクチンおよびパクシリンの免疫蛍光検出を利用して、ATMキナーゼ阻害によって誘発された酸化ストレス後のFN上の細胞接着および拡散を特異的に調べる(

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開示事項

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著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

謝辞

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著者たちは、スコット・R・ハットン博士とメーガン・S・ブラックレッジ博士に原稿の批判的なレビューに感謝しています。この研究は、ハイポイント大学の研究とスポンサープログラム(MCS)とノースカロライナ州立大学のバイオテクノロジープログラム(MCS)によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシン-EDTA (1x)Gibco by Life Technologies25300-054細胞解離
10 cm2 ディッシュCell Treat229620滅菌、組織培養処理
15 mL コニカルチューブFisher Scientific05-539-5滅菌
1X リン酸緩衝生理食塩水Corning Cellgro21-031-CVPBS、滅菌、Mg2+ および Ca2+ フリー
24ウェル細胞培養処理プレートFisher Scientific07-200-740滅菌済み、組織培養処理
4°C;C冷蔵庫フィッシャーサイエンティフィック
マウス IgG 抗パキシリン一次抗体 (クローン 165)BD Transduction Laboratories610620焦点接着のマーカー
アスピレーターArgosEV310
バイオセーフティキャビネットNuairNU-477-400クラスII、タイプA、シリーズ5
脱脂ウシ血清アルブミン(脂肪酸フリー) パウダーフィッシャーScientificBP9704-100dlBSA
ジメチルスルホキシドFisher ScientificBP231-100有機溶媒 Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High GlucoseFisher Scientific11965092REF52 base cell culture medium
胎児ウシ血清Fisher Scientific16000044認定, 細胞培養培地サプリメント
フィジー国立衛生研究所http://fiji.sc/画像解析プログラム
フィルターシリンジフィッシャーサイエンティフィック6900-25020.2 & マイクロ;M、滅菌
ガラスカバースリップ(12-Cir-1.5)Fisher Scientific12-545-81オートクレーブ、ホイルで
ヤギ抗マウスIgG二次抗体を滅菌 Alexa Fluor 488InvitrogenA11001蛍光二次抗体、光感受性
ヤギ血清Gibco by Life Technologies16210-064用ブロッキング溶液の成分
フィッシャーサイエンティフィック22-600-107細胞計数用
ヒト血漿フィブロネクチンギブコ ライフテクノロジーズ33016-015FN
IX73 蛍光倒立顕微鏡蛍光、細胞形態、計数、解離を視覚化するオリンパスの
Ku55933シグマ・アルドリッチSML1109-25MGATMキナーゼ阻害剤、活性酸素の誘導剤種
L-グルタミンフィッシャーサイエンティフィック25-030-081細胞培養液サプリメント
モノクロ CMOS 16 ビットカメラオプティモス
パラホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148-500GPFA、免疫蛍光用固定剤
ペニシリン-ストレプトマイシンフィッシャーサイエンティフィ15-140-122P/S、培地用抗生物質溶液
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)InvitrogenA12381marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPIInvitrogenP36941cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cellsGraham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat controlコーニングインコーポレイテッドPC-420D
シリンジBD バイオサイエンス30965360 mL シリンジ
組織培養インキュベーターNuair
Triton X-100フィッシャーサイエンティフィBP151-500細胞膜を透過するために使用される洗剤
トリパンブルーソリューションフィッシャーサイエンティフィック15-250-061細胞計数用
トリプシン中和液 (1x)ズR-002-100のGibco
ウォーターバスフィッシャーサイエンティフィFSGPD02ック
免疫蛍光血球計算盤顕微鏡ック ック ライフテクノロジー TNSは、胎児のウシ血清チューブ回転子フィッシャーサイエンティフィック11-676-341の代りにトリプシンを中和します

参考文献

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  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958(2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579(2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025(2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393(2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231(2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).

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