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方法論記事

直接気管内リポ多糖刺激によるマウスの急性肺損傷の誘導

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DOI:

10.3791/59999

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2019年7月6日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Hospital Bonn

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、直接気管内リポ多糖類の含有によってマウスの急性肺損傷を誘発し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄液、および肺組織のFACS分析を行うステップバイステップの手順です。最小限の侵襲性、簡単な処理、良好な再現性、および疾患の重症度の滴定は、このアプローチの利点です。

要約

リポ多糖類(LPS)の気道投与は、小動物モデルにおける肺炎症および急性肺損傷(ALI)を研究する一般的な方法である。エアロゾル化LPSの吸入、鼻または気管内刺激など、様々なアプローチが記載されている。提示されたプロトコルは、直接気管内LPS浸透によってマウスにALIを誘導し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄(BAL)流体、および肺組織のFACS分析を行う詳細なステップバイステップ手順を説明する。食肉中の静下後、気管が露出し、LPSは22G静脈カテーテルを介して投与される。白血病細胞の侵入、炎症性サイトカインのアップレギュレーション、およびアルベオロ毛細血管バリアの破壊を伴う堅牢で再現可能な炎症反応は、使用されるLPS投与量に応じて、数時間以内に誘発される。血液サンプルの収集、BAL流体、および肺採取、ならびにFACS分析のための処理は、プロトコルで詳細に説明されています。無菌LPSの使用は、感染症における薬理学的介入を研究するのに適していないが、記載されたアプローチは、最小限の侵襲性、簡単な取り扱い、および機械的免疫学的な質問に答えるために良好な再現性を提供する。さらに、用量滴定だけでなく、代替LPS製剤またはマウス株の使用は、ALIの重症度または疾患症状の早期発症の異なる程度を示すことができる臨床効果の変調を可能にする。

概要

基本的な免疫研究には実験動物モデルが欠かせません。全細菌または微生物成分の投与は、局所的または全身的な炎症を誘発する小動物モデルで頻繁に使用されている1.リポ多糖類(LPS、または細菌エンドトキシン)は、グラム陰性菌(例えば、腸内細菌科、シュードモナス属、またはレジオネラ属)の細胞壁成分および表面抗原である。熱安定および大きな分子(分子量1-4 x 106 kDa)は、脂質部分(脂質A)、コア領域(オリゴ糖)、およびO多糖類(またはO抗原)から構成される。脂質Aは、その疎水性脂肪酸鎖で、分子を細菌膜に固定し、LPSの免疫活性および毒性を仲介する(細菌の分解時に)。LPS結合タンパク質(LBP)への結合に続いて、LPS:LBP複合体は、多くの細胞タイプの表面に位置するCD14/TLR4/MD2受容体複合体をリゲートし、NF-κB核転位およびその後のアップレギュレーションとの強い炎症反応を誘発するサイトカイン発現の 2.

急性肺損傷(ALI)は、心不全3の不在における両側肺水腫を伴う急性低酸素呼吸不全として定義される。LPSの気道投与は、肺炎症およびALI4、5、6、7を誘導する一般的な方法である。無菌物質は感染症における薬理学的介入の研究には適していないが、機械的免疫学的な質問は十分な精度で答えられるかもしれない。気管へのLPSの注入は、LPS投与量3に応じて、白血病の侵入、炎症性サイトカインのアップレギュレーション、および数日以内にアルバオロ毛細血管障壁の破壊を伴う強い炎症反応を誘発する、 6,7.

提示されたプロトコルは、気管内LPSインスティレーションによってマウスにALIを誘導するための詳細なステップバイステップ手順を説明する。このモデルは、サイトカイン発現、好中球顆粒球侵襲、および前述の8.aveolarアルブミン漏出を評価することによって検証された。

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プロトコル

この動物プロトコルは、動物の世話のための地元の委員会(LANUV、レックリングハウゼン、ドイツ、プロトコルNo.84-02.04.2015)によって承認され、生きた動物の使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行われました(NIH出版物)。No.85-23,1996年改訂)。

1. ALI誘導

  1. 約10-12週の年齢で成人C57BL/6マウスを使用してください。水と標準的なげっ歯類チョウへの無料アクセスで個別に換気ケージに動物を収容します。しかし、若い動物および他のマウス株でこのアプローチを行うことができる。
  2. -20°Cで5mg/mLの濃度でアリコート中のLPS(エシェリヒア大腸菌O111:B4)を貯蔵する。気管内浸留の場合、無菌リン酸緩衝生理食べ物(PBS)でLPSを2,000 μg/mLの最終濃度に希釈する。
  3. マウスの重量を量る。ケタミン[120 mg/kgマウス体重(BW)]およびキシラジン(16mg/kg BW)腹腔内(腹部の3分の1以下、パラジナード)を注入し、麻酔の発症まで待つ。
  4. 触覚刺激を誘導して麻酔の深さを確認します。麻酔が不十分な場合は、ケタミン(30mg/kg BW)とキシラジン(4mg/kg BW)で注射を繰り返します。
  5. 温度制御されたテーブルの上にマウスを置き、体温を37°Cに保ちます。
  6. 麻酔下での角膜の乾燥を防ぐために無菌眼用潤滑剤を適用します。
  7. 前足がテーブルと密接に接触している間、テーブルの上に約5cmの位置に置かれた水平バーの頭部とフック切開部を持ち上げます。テーブルに対して 90° の角度で首を超延長します (図1)。鉗子で舌を保持し、挿管の容易な条件のために喉をまっすぐにする。
  8. 22ゲージ(G)静脈カテーテルを20mmの長さに切り、舌の根に沿って垂直方向にカテーテルを静かに挿入します。喉頭の上の皮膚に冷光源を置き、声帯を視覚化し、気管を目指します。喉頭の抵抗が発生した場合は、再び進む前に数ミリメートルカテーテルを引き込みます。
  9. 気管に約10mmのカテーテルを挿入します。これは右または左の主要な気管支に液体の一方的な注入をもたらすので、挿入が深すぎないことを確認してください。
  10. ピペットを用いてPBSで希釈したLPS(5μg/g BW)を注入する[注入体積はマウスの体重に依存する(例えば、20gの体重→LPS溶液の50μLを使用)。
    注:マウスは通常、気管への流体の適切な注入に咳や息切れで応答します。
  11. 注射器を接続し、完全な液体容積が肺に分布していることを保証するために50 mL空気のボーラスを追加します。カテーテルをゆっくりと取り外します。
  12. 気管からの流体の漏出を避けるために、マウスの上半身を30sの直立した位置に保ちます。
  13. シャム作動動物では、LPSの代わりに50 μLの無菌PBSを気管内に注入する。
  14. 塩酸ブプレノルフィン0.08mg/kg BWをALI誘導直後の首の上の緩い皮膚に皮下に注入し、その後12時間ごとに、最初の48時間の間に。
  15. マウスを温めるパッドの上に置いて完全な意識を取り戻すまで、体温を37°Cに保ちます。
  16. 食べ物と水への自由なアクセスと個別に換気ケージにマウスを転送します。マウスを定期的に監視します。体温と呼吸抑制の減少は、ALIの適切な誘導を示す。

2.血液採取、気管支藻胞洗浄、臓器収穫

注:安楽死のタイミングは、対処される科学的な問題に依存します。通常、LPSインスティレーション3、4、9、10に続いて12〜72時間行われる。ALIの重症度は、体温および呼吸困難症状11の定期的な観察によって臨床的に決定することができる。

  1. イソファルランであふれた部屋にマウスを置くことによって麻酔を誘発する。酸素の流れが1L/minの3vol%のイソフランを使用して、触覚刺激を誘導することによって深いナルコシスを確保する。麻酔の深さが不十分な場合は、最大5vol%までイソファランを増加させる。
  2. アトラント後頭脱臼による深部麻酔でマウスを犠牲にする。
  3. 操作テーブルにテープでマウスを固定し、すぐに70%のエタノールで腹部の毛皮を消毒します。はさみとピンセットで中央線で腹腔を慎重に開きます。脊椎柱と腹部大動脈に右の静脈カバ劣った(IVC)へのアクセスを達成するために腸の部分を取り除く。
  4. 腎臓静脈を見つけ、静脈の合流点のすぐ下のIVCに1 mLシリンジに接続された曲がった23 Gカヌラを挿入します。250 μLの血液を吸引し、0.5Mエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)溶液の20 μLで満たされた1.5 mLチューブに移します。EDTA混合を容易にするために穏やかに振り、氷の上にチューブを置きます。
  5. 気管支器洗浄(BAL)の場合は、無菌PBSの0.5 mLと空気の0.1 mLの3つの1 mL注射器をそれぞれ調調します。まもなく70%のエタノールで喉の毛皮を消毒し、慎重にはさみとピンセットで気管を露出させます。気管を動員し、縫合糸の周りにラップします。
  6. BALを実行する:マイクロハサミを使用して気管を穿刺し、20ミリメートルの長さにカット22 G静脈カテーテルを挿入し、縫合糸でカテーテルを固定し、無菌PBSと空気の0.5 mLを注入します。60 s.の後に液体を吸引し、追加の2つの注射器で手順を繰り返し、氷の上の15 mLチューブで全体の吸引を収集します。
  7. 慎重に肺を収穫するためにはさみとピンセットで胸郭を開きます。費用の余裕に沿って横隔膜を切り取り、2つの横切開で肋骨を切り取る。慎重に肺を穿刺しないようにしてください。胸骨を頭蓋に持ち上げ、それを修正または取り外します。
  8. 37 °C の暖かい PBS (カルシウムとマグネシウムなし) で 2 つの 10 mL シリンジを準備します。左心室に小さな切開を行います。26 Gカヌラで右心室を穿刺し、予め温められたPBSで肺循環を洗い流す。処置の間に肺が青ざめなさい。
  9. 肺の右葉を取り除き、2つの半分に切ります。液体窒素中でスナップフリーズし、続いて-80°Cで長期保存し、さらなる遺伝子発現とタンパク質分析を行います。
  10. 左肺全体を取り除き、はさみとツイザーでティッシュをミンチして48ウェルプレートに均質化します。消化バッファーの2mLで組織をインキュベート[RPMI 1640+10%胎児子牛血清(FCS)と0.1%NaN3、コラゲナーゼI(1mg/mL)、DNase II(7mg/mL))を37°Cで60分間、肺のパイプを慎重に配管してさらに均質化を行う。ダウン。

3. FACS分析のための組織調製

  1. 新鮮なFACSバッファーを準備する(表1):常にカルシウムおよびマグネシウムフリーのPBSを使用して、カチオン依存性細胞間接着を低減し、凝集を防ぎます。FCSのサプリメント (1%)アポトーシスから細胞を保護し、非特異的な染色を防ぎ、細胞がFACSチューブに付着するのを防ぎます。マクロファージのような粘着性および付着細胞で作業する場合に、カチオンベースの細胞間接着を防ぐためにEDTA(0.5 mM)を含めます。アジ化ナトリウム(0.1%)を添加すると、フルオロクロムの細菌汚染や光漂白を防ぎ、抗体の脱落をブロックします。
  2. 血液サンプル(ステップ2.4)を5 mL FACSチューブに移し、2mLの赤血球リシスバッファーで血液を穏やかに混合します。氷の上にチューブを置き、氷冷PBSの2 mLを追加することにより、2分後に反応を終了します。400 x gで5分間サンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。前述のプロトコル12に従って、後続のFACS染色のためのFACSバッファーと60 μLで細胞ペレットを再中断します。
    注:マウスの安楽死のタイミングは、全身性炎症の一部として白血病数に影響を与える。したがって、フローサイトメトリー分析に最適な染色結果を達成するために、このステップで細胞数を1 x 106細胞/60 μLに調整することをお勧めします。
  3. 遠心分離機BAL流体(ステップ2.6)400 x gで5分間。上清を吸引し、液体窒素中で凍結し、続いて-80°Cで長期保存し、さらなるタンパク質分析を行います。冷たいFACSバッファーの2 mLでBALセルペレットを再懸濁し、100 μmメッシュフィルターを使用して5 mL FACSチューブに懸濁液を移し、毛髪を抑制します。
  4. 繰り返しますが、400 x gでサンプルを 5 分間遠心分離します。前述のプロトコル12に従って、後続のFACS染色のためのFACSバッファーとプロセスの60 μLでペレットを再中断します。
    注:マウスの安楽死のタイミングは、炎症の一部としてBALの白血病数に影響を与える。したがって、フローサイトメトリー分析に最適な染色結果を達成するために、このステップで細胞数を1 x 106細胞/60 μLに調整することをお勧めします。
  5. 消化された左肺組織(ステップ2.10)を100μLメッシュフィルターを使用して5 mL FACSチューブに移し、塊を抽出し、2 mLの氷冷FACSバッファーを追加して消化プロセスを終了します。400 x gで5分間サンプルを遠心分離します。上清を廃棄し、前述のプロトコル12に従って後続のFACS染色のための60 μLのFACSバッファーとプロセスでペレットを再懸濁する。
    注:マウスの安楽死のタイミングは、炎症の一部として肺組織の白血病数に影響を与える。したがって、フローサイトメトリー分析に最適な染色結果を達成するために、細胞数を1 x 106細胞/60 μLに調整することをお勧めします。
  6. FACS分析では、CD16/CD32抗体を用いた細胞を4°Cで15分間インキュベートし、Fc受容体に対する免疫グロブリンの非特異的結合を遮断する。5 mL チューブで 60 μL の 1 x 106セルに 20 μL のブロッキング溶液を追加します。
  7. 一方、表2に記載されているように、FACSバッファーおよび抗体を用いてマスターミックスを調調べる。
  8. ブロッキング後は、細胞を洗浄しないでください。サンプルあたり20 μLの抗体マスターミックスを追加し、100 μLの最終体積を得ます。
  9. 各サンプルをFACSバッファーの1 mLで洗浄し、遠心分離機を400 x gで5分間洗浄します。上清を廃棄し、FACS バッファーでペレットを FACS 測定用の適切なセル濃度に再懸濁します。
    注:このプロトコルを用いたFACS分析において、1 x 106細胞/500μLの細胞数が最良の免疫表現型結果を達成することが示唆される。ただし、抗体を個別に誘導することをお勧めします。
  10. 必要に応じて、特定の市販キット8を使用して表面染色の前に生/死染色を追加します。
  11. 最後に、市販のフルオロクロム結合キャリブレーションビーズ(FACSバッファーの20μLで3 x 105ビーズ)を各サンプルに追加し、絶対細胞数12を決定します。血液、BAL、および組織細胞のゲーティング戦略を図2に示します。

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結果

マウスにおけるALIを誘導する記載のアプローチは、サイトカイン発現、好中球顆粒球浸潤、および肺静脈毛細血管障害破壊24時間およびLPS浸潤後72時間を評価することによって検証された。PBS注入動物は、コントロールとして役立った。気管内LPS投与は、強い肺炎症反応を誘発した。肺組織におけるTNF-αの発現は有意にアップレギュレートされ、対照動物[RQ(TNF-α/18s);24時間:53.7(SD=11.6)、72 h:55.0(SD= 20.6);p< 0.05)と比較して持続的かつ50倍以上の増加に達した。組織および肺胞空間へのロイコサイトの侵入はALI13の発達のための特徴および特徴である。FACS分析では、肺間質に好中球顆粒球(NG)が有意に浸透し、絶対細胞数は24時間後に対比で約9倍に増加した[65,243 (SD = 15,855)] 対 7,358 (SD = 4,794), p < 0.05図 3B)。

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ディスカッション

最低の侵襲性、簡単な処理およびよい再現性は小さいげっ歯類モデルのALIを誘発するために提示されたアプローチの主要な特徴である。動物モデルにおける全細菌の代わりにLPSを使用すると、利点があります。それは安定した、純粋な化合物であり、使用するまで凍結乾燥された形態で貯えることができる。これは、TLR4経路を介した自然免疫応答のための強力な刺激剤であり、その生物学的活性は容易に定量することができ、良好な再現性を有する疾患重症度の滴定を容易にする。さらに、LPSの使用は、ヒトの健康なボランティアで急性気管支炎を誘発する安全なモデルとして機能することが示されており、したがって、ベンチからベッドサイド16への翻訳を可能にする。Rittirschらは、気管内LPS浸透のマウスモデルにおける特徴的なアルベオロ毛細血管漏出の用量および時間依存性の発達を実証した6.これは、用量滴定は、特定の所望の効果を達成することができます, これは、ALIの重症度または病気の症状の早期発症の異なる程度を示すことができます.しかしながら、明確な感染学的または薬理学的問題(例え...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者らは、ヤン・クライナーとスザンヌ・シュルツに技術サポートを提供してくれたことに感謝したいと考えている。著者らは、ボン大学の医学部におけるフローサイトメトリーコア施設の優れたサポートを認めている。著者は外部組織から資金を受け取っていなかった。 結果セクションで示され、図 3に示されているデータの一部は、既に前のパブリケーション8に示されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 ml シリンジBD, Franklin Lakes, NJ, USA300013
10 ml シリンジBD, Franklin Lakes, NJ, USA309110
Anti-CD115 (c-fms) APCThermo Fisher, Waltham, MA, USA17-1152-80
Anti-CD11b (M1/70) - FITCThermo Fisher, Waltham, MA, USA11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) - eF450Thermo Fisher,ウォルサム、マサチューセッツ州、米国48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5)BD Biosciences、フランクリンレイクス、ニュージャージー552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7Bio Legend、サンディエゴ、カリフォルニア州127623
Buprenorphine hydrochlorideIndivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6マウス、メス、10 - 12週齢Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µm)BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA340487
Canula 23 gauge 1''BD, Franklin Lakes, NJ, USA300800
Canula 26 gauge 1/2''BD, Franklin Lakes, NJ, USA303800
Cell strainer 70 & micro;mBD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA352350
コラゲナーゼ Type ISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA1148089
Deoxyribonuclease IISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAD8764 
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、無菌シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、米国D8662
ダルベッコ '塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、滅菌済みSigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス、米国D8537
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国 E7889
FACSチューブ、5 mlSarstedt、Nümbrecht, Germany551579
Fetal calf serum (FCS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF2442
ForcepsFine Science Tools, Heidelberg, Germany11049-10
IsofluraneBaxter, Unterschleißハイム、ドイツ
ケタミン塩酸塩Serumwerk Bernburg、Bernburg、ドイツ
大腸菌からのリポ多糖類(LPS) O111:B4Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国L2630
LIVE/DEAD 固定可能なデッドセルグリーンキットサーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国L23101
精製ラット抗マウスCD16 / CD32(マウスBD FC Block™)、クローン2.4G2BD, Franklin Lakes, NJ, USA553141
赤血球溶解バッファーThermo Fisher, Waltham, MA, USA00-4333-57
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonateSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAR8758
ScissorsFine Science Tools, Heidelberg, Germany14060-09
アジ化ナトリウム (NaN3)Sigma-Aldrich, St.米国ミズーリ州ルイS2002
春はさみFine Science Tools, ハイデルベルク, ドイツ15018-10
組織鉗子Fine Science Tools, ハイデルベルク, ドイツ11021-12
チューブエッペンドルフ, ハンブルク, ドイツ30125150
静脈カテーテル, 22 ゲージB.Braun, メルズンゲン, ドイツ4268091B
キシラジン塩酸塩Serumwerk Bernburg、ベルンブルク、ドイツ
州、米国

参考文献

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