直接気管内リポ多糖刺激によるマウスの急性肺損傷の誘導

Summary

ここでは、直接気管内リポ多糖類の含有によってマウスの急性肺損傷を誘発し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄液、および肺組織のFACS分析を行うステップバイステップの手順です。最小限の侵襲性、簡単な処理、良好な再現性、および疾患の重症度の滴定は、このアプローチの利点です。

Abstract

リポ多糖類(LPS)の気道投与は、小動物モデルにおける肺炎症および急性肺損傷(ALI)を研究する一般的な方法である。エアロゾル化LPSの吸入、鼻または気管内刺激など、様々なアプローチが記載されている。提示されたプロトコルは、直接気管内LPS浸透によってマウスにALIを誘導し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄(BAL)流体、および肺組織のFACS分析を行う詳細なステップバイステップ手順を説明する。食肉中の静下後、気管が露出し、LPSは22G静脈カテーテルを介して投与される。白血病細胞の侵入、炎症性サイトカインのアップレギュレーション、およびアルベオロ毛細血管バリアの破壊を伴う堅牢で再現可能な炎症反応は、使用されるLPS投与量に応じて、数時間以内に誘発される。血液サンプルの収集、BAL流体、および肺採取、ならびにFACS分析のための処理は、プロトコルで詳細に説明されています。無菌LPSの使用は、感染症における薬理学的介入を研究するのに適していないが、記載されたアプローチは、最小限の侵襲性、簡単な取り扱い、および機械的免疫学的な質問に答えるために良好な再現性を提供する。さらに、用量滴定だけでなく、代替LPS製剤またはマウス株の使用は、ALIの重症度または疾患症状の早期発症の異なる程度を示すことができる臨床効果の変調を可能にする。

Introduction

基本的な免疫研究には実験動物モデルが欠かせません。全細菌または微生物成分の投与は、局所的または全身的な炎症^を誘発する小動物モデルで頻繁に使用されている1.リポ多糖類(LPS、または細菌エンドトキシン)は、グラム陰性菌(例えば、腸内細菌科、シュードモナス属、またはレジオネラ属)の細胞壁成分および表面抗原である。熱安定および大きな分子(分子量1-4 x 10⁶ kDa)は、脂質部分(脂質A)、コア領域(オリゴ糖)、およびO多糖類(またはO抗原)から構成される。脂質Aは、その疎水性脂肪酸鎖で、分子を細菌膜に固定し、LPSの免疫活性および毒性を仲介する(細菌の分解時に)。LPS結合タンパク質(LBP)への結合に続いて、LPS:LBP複合体は、多くの細胞タイプの表面に位置するCD14/TLR4/MD2受容体複合体をリゲートし、NF-κB核転位およびその後のアップレギュレーションとの強い炎症反応を誘発するサイトカイン発現^{の 2}.

急性肺損傷(ALI)は、心不全3の不在における両側肺水腫を伴う急性低酸素呼吸不全として定義^される。LPSの気道投与は、肺炎症およびALI4、5、6、7を誘導する一般的な方法である。<....

Protocol

この動物プロトコルは、動物の世話のための地元の委員会(LANUV、レックリングハウゼン、ドイツ、プロトコルNo.84-02.04.2015)によって承認され、生きた動物の使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行われました(NIH出版物)。No.85-23,1996年改訂)。

1. ALI誘導

1. 約10-12週の年齢で成人C57BL/6マウスを使用してください。水と標準的なげっ歯類チョウへの無料アクセスで個別に換気ケージに動物を収容します。しかし、若い動物および他のマウス株でこのアプローチを行うことができる。
2. -20°Cで5mg/mLの濃度でアリコート中のLPS(エシェリヒア大腸菌O111:B4)を貯蔵する。気管内浸留の場合、無菌リン酸緩衝生理食べ物(PBS)でLPSを2,000 μg/mLの最終濃度に希釈する。
3. マウスの重量を量る。ケタミン[120 mg/kgマウス体重(BW)]およびキシラジン(16mg/kg BW)腹腔内(腹部の3分の1以下、パラジナード)を注入し、麻酔の発症まで待つ。
4. 触覚刺激を誘導して麻酔の深さを確認します。麻酔が不十分な場合は、ケタミン(30mg/kg BW)とキシラジン(4mg/kg BW)で注射を繰り返します。
5. 温度制御されたテーブルの上にマウスを置き、体温を37°Cに保ちます。
6. 麻酔下での角膜の乾燥を防ぐために無菌眼用....

Results

マウスにおけるALIを誘導する記載のアプローチは、サイトカイン発現、好中球顆粒球浸潤、および肺静脈毛細血管障害破壊24時間およびLPS浸潤後72時間を評価することによって検証された。PBS注入動物は、コントロールとして役立った。気管内LPS投与は、強い肺炎症反応を誘発した。肺組織におけるTNF-αの発現は有意にアップレギュレートされ、対照動物[RQ(TNF-α/18s);24時間:53.7(SD=11.6)、72 h:55.0(SD= 20.6);p< 0.05)と比較して持続的かつ50倍以上の増加に達した。組織および肺胞空間へのロイコサイトの侵入はALI¹³の発達のための特徴および特徴である。FACS分析では、肺間質に好中球顆粒球(NG)が有意に浸透し、絶対細胞数は24時間後に対比で約9倍に増加した[65,243 (SD = 15,855)] 対 7,358 (SD = 4,794), p < 0.05図 3B)。

Discussion

最低の侵襲性、簡単な処理およびよい再現性は小さいげっ歯類モデルのALIを誘発するために提示されたアプローチの主要な特徴である。動物モデルにおける全細菌の代わりにLPSを使用すると、利点があります。それは安定した、純粋な化合物であり、使用するまで凍結乾燥された形態で貯えることができる。これは、TLR4経路を介した自然免疫応答のための強力な刺激剤であり、その生物学的活性は容易に定量することができ、良好な再現性を有する疾患重症度の滴定を容易にする。さらに、LPSの使用は、ヒトの健康なボランティアで急性気管支炎を誘発する安全なモデルとして機能することが示されており、したがって、ベンチからベッド^サイド16への翻訳を可能にする。Rittirschらは、気管内LPS浸透のマウスモデルにおける特徴的なアルベオロ毛細血管漏出の用量および時間依存性の発達を実証した6.これは、用量滴定は、特定の所望の効果を達成することができます, これは、ALIの重症度または病気の症状の早期発症の異なる程度を示すことができます.しかしながら、明確な感染学的または薬理学的問題(例え.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml シリンジ	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300013
10 ml シリンジ	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	309110
Anti-CD115 (c-fms) APC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	17-1152-80
Anti-CD11b (M1/70) - FITC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) - eF450	Thermo Fisher,ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7	サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5)	BD Biosciences、フランクリンレイクス、ニュージャージー	552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5	サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7	Bio Legend、サンディエゴ、カリフォルニア州	127623
Buprenorphine hydrochloride	Indivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6マウス、メス、10 - 12週齢	Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µm)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	340487
Canula 23 gauge 1''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300800
Canula 26 gauge 1/2''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	303800
Cell strainer 70 & micro;m	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	352350
コラゲナーゼ Type I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	1148089
Deoxyribonuclease II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8764
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、無菌	シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州	、米国D8662
ダルベッコ '塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、滅菌済み	Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス、米国	D8537
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州	、米国 E7889
FACSチューブ、5 ml	Sarstedt、Nümbrecht, Germany	551579
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F2442
Forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11049-10
Isoflurane	Baxter, Unterschleißハイム、ドイツ
ケタミン塩酸塩	Serumwerk Bernburg、Bernburg、ドイツ
大腸菌からのリポ多糖類(LPS) O111:B4	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国	L2630
LIVE/DEAD 固定可能なデッドセルグリーンキット	サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	L23101
精製ラット抗マウスCD16 / CD32(マウスBD FC Block™)、クローン2.4G2	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	553141
赤血球溶解バッファー	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	00-4333-57
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	R8758
Scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	14060-09
アジ化ナトリウム (NaN3)	Sigma-Aldrich, St.米国ミズーリ州ルイ	S2002
春はさみ	Fine Science Tools, ハイデルベルク, ドイツ	15018-10
組織鉗子	Fine Science Tools, ハイデルベルク, ドイツ	11021-12
チューブ	エッペンドルフ, ハンブルク, ドイツ	30125150
静脈カテーテル, 22 ゲージ	B.Braun, メルズンゲン, ドイツ	4268091B
キシラジン塩酸塩	Serumwerk Bernburg、ベルンブルク、ドイツ