タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Summary

このプロトコルは、市販のDNAゲル染色を有するミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、超分解能構造照明顕微鏡(SR-SIM)による生細胞のタイムラプスシリーズの取得、およびヌクロイド運動の自動追跡を記述する。

Abstract

ミトコンドリアヌクレオイドは、ミトコンドリアDNA分子によって形成されるコンパクトな粒子であり、タンパク質で被覆される。ミトコンドリアDNAは、tRNA、rRNA、およびいくつかの必須のミトコンドリアポリペプチドをコードする。ミトコンドリア核は、核分裂/融合および他の形態学的変化を受ける動的ミトコンドリアネットワーク内で分裂し、分布する。高解像度ライブ蛍光顕微鏡は、核酸の位置と動きを特徴付けるための簡単な技術です。この技術では、ヌクレオイドは、一般に、それらのタンパク質成分、すなわち転写因子a(TFAM)の蛍光タグを介して標識される。しかし、この戦略は、蛍光タンパク質タグ付き構築物の過剰発現を必要とし、アーティファクト(TFAMについて報告)を引き起こす可能性があり、多くの場合実現不可能である。有機DNA結合色素はこれらの欠点を有しない。しかし、彼らは常に核およびミトコンドリアDNAの染色を示し、したがってミトコンドリアヌクレオイドに特異性を欠いている。このような色素の物理化学的性質を考慮して、核酸ゲル染色(SYBR Gold)を選択し、生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの優先標識を達成した。色素の特性、特にDNAに結合する際の高輝度は、超解像構造照明画像の時系列を用いてミトコンドリア核体運動のその後の定量化を可能にする。

Introduction

円形の16.5kbp DNA分子はミトコンドリアの遺伝物質を構成し、ミトコンドリア酸化リン酸化複合体に必要な22のtRNA、2つのrRNA、および13のポリペプチドをコードする。ミトコンドリア転写因子a(TFAM)および他のいくつかのタンパク質に結合したミトコンドリアDNAは、ミトコンドリアヌクレオイド^{11、2、3、42,3,4}を形成する。ミトコンドリア核は、ミトコンドリアネットワーク^55、66の成分間で移動し、再分配し、その形態学的改変、分裂または融合は細胞周期相、応力、および他の要因に応じて(Pernas et^7.また、ミトコンドリアヌクレオイドの運動は、全身性エリテマトーデス病⁸に関与し、他の疾患に関与しうる。蛍光顕微鏡は、オルガネラの生細胞研究のための簡単な技術であるが、この技術は、ミトコンドリアヌクレオイドのサイズよりも大きい>200nmの解像度を有する(〜100 nm^{99、10、11、12)。10,11,12}この限界は、刺激放出枯渇(STED)および単一分子局在化顕微鏡(SMLM)13,14のようないわゆる「超解像」技術によって回避された。^13,14これまで、ミトコンドリアヌクレオイドおよび他のDNAは、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)15によって生細胞で画像化された。¹⁵mtDNAと相関する位置を有する微細なサブミトコンドリア構造は、生細胞¹⁶においてSTEDにより観察された。しかしながら、これらの超解像技術は高い照明強度を必要とし、生細胞¹⁷に光毒性作用を引き起こす。したがって、回折限界を超える解像度を有するミトコンドリアヌクレオイドのタイムラプスイメージングは困難である。これに対処するために、我々は超解像構造照明顕微鏡(SR-SIM)18¹⁸を使用した。SIM は、STED および SMLM¹⁹よりもはるかに低い照明電力線量を必要とします。さらに、STEDおよびSMLM技術とは対照的に、SIMは単純な多色三次元(3D)イメージングを可能にし、フルオロフォアまたはイメージングバッファ組成物¹⁹の特定の光物性を必要としない。

生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの標識に関する従来の戦略は、TFAM²⁰のようなミトコンドリアヌクレオイドタンパク質の蛍光タグ付けである。しかし、多くの場合、この戦略は適していません。さらに、蛍光タンパク質タグ付きTFAMの過剰発現は、深刻な人工物²¹を生成する。有機色素によるDNAの標識は、蛍光タンパク質(FP)ベースの戦略よりも優れた効果があります。有機色素はFPタグに関連する制約がない:それらは細胞または組織の任意のタイプに使用することができ、実験の任意の時点で適用することができる。ミトコンドリアヌクレオイドの生細胞イメージングは、いくつかのDNA結合色素で報告されている:DAPI²²22、SYBRグリーン^23、ヴィブラントDyeCycle^24、およびピコグリーン15、25、26。^15,25,26ヌクレオイド標識のためのほとんどのDNA結合色素の実質的な欠点は、それらが細胞内のすべてのDNAを染色することです。ミトコンドリアDNAのみに対する色素の標的化は非常に望ましい。そのためには、適切な物理化学的性質を有する色素を慎重に選択することが必要である。ローダミン123のような非局所陽性電荷を有する親油性染料は、その陰性膜電位を保持する生のミトコンドリアに蓄積することが知られている。さらに、ミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識に理想的な色素は、高い親和性を持つDNAを結合し、DNA結合時に明るい蛍光を発する必要があります。これらの要件を考慮すると、特定のシアニン(例えば、ピコグリーン)が有望であるが、核DNAはミトコンドリア^{DNA15、25、26,25,26}と同時にこれらの染料によって豊富に染色される。本プロトコルは、別のシアニン色素を有する生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、SYBR Gold(SG)、および時間経過超解像SIMビデオにおける核oidの追跡について説明する。また、SG染色された生細胞は、生細胞に適したあらゆる種類の反転蛍光顕微鏡(共焦点、紡績円盤、蛍光等)で、488nmの光源を備えて画像化することができます。

Protocol

注:ここで言及したすべての細胞株は、10%のウシ胎児血清(FBS)、グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸を添加した高グルコースダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)で培養した。5%CO2に設定したインキュベーターで37°Cまで温めることにより、ラベリングおよび画像化の日に使用されるすべての培地およびサプリメントを平衡化する。₂ラベリングを含むすべての細胞培養作業は、層流フードの下で無菌条件で行われます。

1. ライブセルラベリング

1. ラベリング手順の前日、4 x 10⁵ HeLa細胞を2mLの培地で35mmペトリ皿に#1.5ガラス底で培養する。マルチウェルチャンバースライドを使用できますが、ボリュームはウェルの体積に比例して調整する必要があります。細胞懸濁液を希釈して約50,000個の細胞/mLを持ち、35mmのペトリ皿に細胞懸濁液の2mLをシードします。
2. SYBRゴールド(SG)商用在庫ソリューションの次の希釈液を準備します: 1:5,000.ミトトラッカーディープレッド(遠赤色染色)またはミトトラッカーCMXRosレッド(赤い汚れ)(材料表;市販株希釈1:2,000)をフェノール赤自由培養培地で準備します。SGと同じピコグリーンの希釈液を準備します。
   注:ステップ 1.2 で説明されているソリューションは、2x ラベル付けソリューションです。蛍光色素を含むすべての溶液を光から可能な限り保護します。
3. 接着細胞を2 mL PBSで1回洗います。35mmペトリ皿に1mlのフェノール赤入り培養培地を加えます。8ウェルチャンバースライドの場合、総ウェル容量の1/2に等しいボリュームを使用します(例えば、総ウェル容量が250μLの場合は125 μLを追加します)。
4. ステップ1.2~35mmのペトリ皿で調製した2xラベリング溶液を1 mL加えます。8ウェルチャンバースライドの場合は、総ウェル容量の1/2に等しいボリュームを使用してください。5%CO2の下で37°Cで30分間細胞をインキュ₂ベートする。
   注:長いインキュベーションは核DNAの標識を引き起こすので、1時間以上SG標識溶液で細胞をインキュベートしないでください。
5. 蛍光染料を含む培地を慎重に吸引し、PBSで細胞を一度洗います。
6. フェノールを赤自由な細胞培養培地に添加し、細胞をイメージングまで37°Cの_CO2インキュベーターで暗闇の中に保管します。
7. インキュベーションユニットを搭載したSR-SIM顕微鏡上の細胞の画像(下記参照)。

2. SR-SIM画像取得

1. 顕微鏡ステージにステージトップインキュベーターを取り付ける。所望の温度と_CO2濃度(例えば、哺乳動物細胞の場合は37°Cおよび5%)を設定し、画像取得を開始する前に少なくとも1時間暖かく保ちます。
2. レーザーを含むSR-SIM顕微鏡のすべてのコンポーネントのスイッチを入れ、少なくとも1時間温めます。
3. 顕微鏡メーカーがSR-SIMに推奨する高倍率、高い開口(NA)浸漬目的(例えば、100x 1.46 NA油)を選択してください。
4. インキュベートされた顕微鏡の段階に(ステップ1.6から)ラベル付きの細胞とチャンバースライドまたは35 mm皿を取付ける。
5. 好ましくは眼で、サンプル上の関心領域を見つける。SR-SIMイメージングの品質を最適に達成するには、ガラスに適切に取り付けられているセルを選択します。
6. SR-SIM 画像を取得するには、バックスチンドハイエンド電子乗算電荷結合デバイス(EM-CCD)カメラを使用します。
7. 画像取得ソフトウェアを使用して、使用するカメラに推奨される高いEMゲイン(例えば、300)を設定します。
8. ヌクレオイド追跡用のタイムラプスシリーズを取得する前に、同じ視野の2色SR-SIM画像を取得します:ミトコンドリア染色用のチャネルとSG用のチャンネル。使用するミトコンドリア染色に適した第1のカラーチャンネルを設定する(例えば、遠赤色ミトコンドリア染色の場合、励起を633nm以上に設定し、650nmロングパス発光フィルタを設定する)。SG信号の場合、励起を488 nmに、500~550 nmのバンドパス放出フィルタを設定します。
9. ソフトウェアを使用して、488 nmと遠赤色の汚れラインの両方に可能な限り低いレーザーパワーを設定します。
   注:典型的な設定は、アフュースト光光チューナブルフィルタ(AOTF)によって調整された1%のレーザー出力電力です。
10. SIM顕微鏡がチャンネルをシーケンシャルに取得する場合(シングルカメラ設定)、遠赤色の汚れ検出チャネルをオフにします。
11. ソフトウェアの Z スタックボックスのチェックを外して Z スタックの取得をオフにして、単一焦点面の取得を設定します。
12. EM-CCD カメラの露出時間を最短に設定します。
13. グリッドの回転を 5 回ではなく 3 回転に設定します。
14. フレームレートを上げるには、ソフトウェアの取得タブで、カメラセンサーの中央領域からのみデータを読み取るようにカメラを設定します。
    注:たとえば、1,000 x 1,000 ピクセルのフルセンサーの領域を読み取りから 256 x 256 ピクセルのみを読み取るように切り替えると、カメラの露出時間を 50 ms から 13.4 ms に、フレーム全体の時間を 1.8 秒から 1.2 秒に短縮できます。カメラセンサーの中央部分のみが読み取られる場合、SR-SIMに通常使用される63倍または100倍の目標では、視野は非常に小さくなります。露光時間を短くすると、画像の信号対雑音比が低下します。
15. レーザーパワーとカメラの露出時間を最適化する:複数のレーザーパワー値(例えば、0.5%、1%、1.5%、2%)で標識された細胞のSR-SIM2次元(2D)画像を取得するそして、数回の暴露時間(例えば、13.4 ms、25 ms、50 ms)。
16. 生の SIM データセットを処理します (ステップ 3.1 を参照)。
17. SIM処理によって生成されるアーティファクトがほとんどまたはまったくないミトコンドリア(すなわち、核状の核状)に明るいスポットを持つSIM画像を得るレーザーパワーとカメラの露出時間を選択してください。ミトコンドリアの外側の領域を検査します(例えば、488 nmの固体レーザーの1%のパワーとEM-CCDカメラの25 ms露光)。
18. ステップ2.15-2.17で最適化された設定を使用して、タイムラプスシリーズの取得を開始します。

3. データ処理と分析

1. 適切なソフトウェアの構造化された照明モジュールを使用して生 SIM データセットを処理する (材料表): SIM 処理パラメータの[自動] チェックボックスを選択します。複数のファイルの自動処理を行う場合は、バッチ処理ツールを使用し、[バッチに現在を使用] を選択解除し、[バッチの実行] をクリックして、SIM 処理用に複数のファイルを選択します。
2. SIM 処理された時系列データセットを、Imaris ファイル コンバータ ソフトウェア (つまり、Imaris ソフトウェアのバージョンに対応するバージョン) を使用してims形式に変換します。
3. リネージュ (またはトラック) モジュールのライセンスを持つソフトウェア (バージョン 8.4.1 以降) で変換されたファイルを開きます。
4. [新しいスポットの追加] アイコンをクリックして、[スポット] の作成ウィザードを開始します。作成用のウィザードが起動します。
5. ウィザードの [作成] タブを選択します。
6. ウィザードの最初の手順で、[スポットの追跡(時間の経過) をクリックし、ウィザードの 2 番目の手順に進みます。
7. 推定 XY 直径を 0.1 ~0.15 μm に設定し、[背景減算]をクリックして、3 番目のステップに進みます。
8. ヒストグラムの垂直線をドラッグしてフィルターの「品質」のしきい値を調整し、大部分の核OIDが「斑点」として検出される一方で、アーティファクトは検出されません(つまり、検出されたスポットは画像上に重ね合わせてボールとしてマークされます)。これが各フレームに当てはまるかどうかを確認し、必要に応じてしきい値を再調整します。4 番目に進み、ウィザードの 5 番目の手順に進みます。
9. 自己回帰モーションアルゴリズムを選択します。最大距離を 0.5 μm に設定し、[最大ギャップ サイズ]を 0 に設定します。
10. 時系列の各フレームを確認し、誤ったトラックが描画されているか、トラック間にギャップが生じたかどうかを確認します(現在の設定でウィザードによって構築されたトラックは、瞬時に画像上に線としてマークされます)。必要に応じて「最大距離」を調整します。ウィザードの 6 番目の手順に進みます。[トラック期間] フィルターを選択し、しきい値を 3 ~ 5 s に設定します。
11. 現在検出されているスポットまたはトラックが最適でない場合は、(ウィザード ウィンドウの下部にある) ナビゲーション ボタンを使用して、スポットまたはトラックの作成に必要なパラメーターを微調整するウィザードの前の手順に戻ります。
12. 微調整されたパラメーターにより、ソフトウェアがすべてのスポットを検出してトラックを正しく作成できる場合は、ウィザードの緑色の矢印ナビゲーションボタンをクリックしてトラックの作成を確認します。
13. [統計] アイコン ウィンドウをクリックして、トラックの統計情報を抽出します。必要な統計パラメーター ([統計] の下の[詳細]タブと[平均値] タブ) を選択し、数値化と視覚化のためにフロッピー ドライブアイコンをクリックして値を csv ファイルとしてエクスポートします。
    注:最大トラック速度、平均トラック速度、トラック長、およびトラック変位は重要なパラメータの例です。
14. 画像データセットを表示または公開する必要がある場合は、[スナップショット]または[アニメーション]ツールを使用して、オプションでオーバーレイされたトラックを使用して、タイムラプスシリーズを表すスナップショットやビデオファイルを作成します。

4. 共焦点画像の取得

1. 顕微鏡ステージにステージトップインキュベーターを設置し、所望の温度と_CO2濃度(哺乳類細胞の場合は37°Cおよび5%)を設定し、画像取得を開始する前に少なくとも1時間暖かく保ちます。
2. レーザーを含む共焦点レーザー走査顕微鏡のすべてのコンポーネントのスイッチを入れ、少なくとも1時間温めます。
3. ナイキストの基準に従って、目的の中から高の倍率および空間サンプリングを選択します。
4. SG チャネルの場合、励起を 488 nm に、検出範囲を 500 ~ 550 nm に設定します。ミトコンドリア染色チャネルの場合、赤色色素の場合は561 nmおよび570〜630 nmの発光、遠赤色色素では633 nmの励起および>650 nmの放出に設定します。
5. PMT検出器のゲイン700mVで信号の取得を可能にする、可能な限り低いレーザーパワー(通常は1%以下)を設定します。
6. 「SGチャネル」でミトコンドリア核OIDが検出され、ミトコンドリアが「赤」または「遠赤色」チャネルで検出される細胞の2色共焦点画像を取得する。

Results

SGを用いて生細胞ラベリングを特徴づけ
まず、種々の希釈液における色素とのインキュベーション時の細胞内のSGの分布は、共焦点顕微鏡によって特徴付けられた。SGまたはpicoGreenの高濃度でインキュベーションした後、両方の染料は主に核を標識し、細胞質にパンクチット染色を示した(図1)、同様に別の正に帯電したシアニン色素(すなわち、ピコグリーン⁾¹⁵に関する公表されたデータと同様である。しかし、1:10,000希釈時にSGとのインキュベーションを行った際、核内にかすかな染色が現れ、細胞質では明るいスポットのパターンを観察した(図1)。一方、ピコグリーン染料を希釈してインキュベーションを1:10,000で、主に核染色を行った。SG信号は、同じ濃度でピコグリーンのそれよりもはるかに明るかった。データは、SGが他の同様のDNA結合色素よりもミトコンドリアDNAをイメージング...

Discussion

プロトコルにはいくつかの重要な要素があります:ミトコンドリアDNAの優先標識を達成するために、インキュベーション中のDNA結合色素の濃度は非常に低く(例えば、典型的な商業ストックの1:10,000希釈)、およびインキュベーション時間は30分であるべきです。インキュベーション時間は1時間を超えてはならない SYBR ゴールド染料を使用する必要があります。他のDNA結合色素は、低濃度で標識すると強いシグナルを生成するほど明るくない。

我々のプロトコルの限界は、色素が透過性のステップの間にミトコンドリアヌクレオイドから洗い流されるということです。したがって、記載された手順は、従来の免疫蛍光プロトコルには適していない。この場合、固定細胞内のヌクレオイドは、DNAまたはミトコンドリア転写因子(TFAM)に対する抗体などの他の技術で効率的に標識することができる。

DNA結合性有機色素を用いたミトコンドリアヌクレオイドの直接標識は、蛍光タンパク質標識よりも利点があります:任意のタイプの細胞は、蛍光タンパク質タグ付き構築物の一時的または安定し...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elyra PS1	Carl Zeiss		マルチモーダル超解像顕微鏡 超解像構造化照明顕微鏡用モジュール(SR-SIM)
高グルコースDMEM	GIBCO/ThermoFisher	31966021
同上35 mm皿、ガラス底	Ibidi Gmbh	81158
同上8ウェルマイクロスライド、ガラス底	Ibidi Gmbh	80827
Imaris 8.4.1	Bitplane/Oxford Instruments		画像処理および視覚化ソフトウェア パッケージ
iXon 885	Andor Technologies		EMCCD カメラ 裏面照射型センサー付き
LSM880 Airyscan	カールツァイス		レーザー走査型共焦点顕微鏡 アレイ検出器付き
Mitotracker CMXRos Red	ThermoFischer	M7512	赤 生細胞 ミトコンドリア染色
Mitotracker ディープレッド FM	ThermoFischer	M22426	遠赤色の生細胞 ミトコンドリア染色
picoGreen	ThermoFischer	P7581	細胞透過性 DNA染色
プラン アポクロマート 100x/1.46 オイル対物レンズ	カールツァイス
SYBR ゴールド	サーモフィッシャー	S11494	細胞透過型 DNA染色
ゼンブラック 2012 ソフトウェア	カールツァイス		画像取得および処理ソフトウェア