円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング

Summary

円形RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'ポリホスファターゼ処理、ノーザンブロットを組み合わせることで、循環RT-PCRベースの戦略を提示する。このプロトコルには、不安定な5'三リン酸の影響を最小限に抑えるための正規化ステップが含まれており、トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次および処理された転写物を識別およびマッピングするのに適しています。

Abstract

植物ミトコンドリアでは、一部の定常転写物は転写開始(一次転写)に由来する5'三リン酸を有し、他のものは転写後に生成された5'モノリン酸(処理された転写物)を含む。2種類の転写物を区別するために、いくつかの戦略が開発され、それらのほとんどは5'三リン酸の存在/不在に依存しています。しかし、原発5'ターミニーニにおける三リン酸は不安定であり、2種類の転写物の明確な判別を妨げる。トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別してマッピングするために、cRT-PCR、RNA 5'ポリフォシュパターゼ処理、定量的な組み合わせにより、循環RT-PCR(cRT-PCR)ベースの戦略を開発しました。RT-PCR (RT-qPCR)、およびノーザン ブロット。改善として、この戦略は、不安定な5'三リン酸の影響を最小限に抑えるためのRNA正規化ステップを含む。

このプロトコルでは、濃縮されたミトコンドリアRNAは、RNA 5'ポリホスファターゼによって前処理され、5'トリフショファトを一リン酸に変換する。円形化および逆転転写後、5'ポリホスファターゼおよび非処理RNAに由来する2つのcDNは、処理された5'末端を有し、5'ポリホスファターゼに無感覚であるトウモロコシ26S成熟rRNAによって正規化される。正規化後、一次転写物と処理された転写物は、治療されたRNAおよび非処理されたRNAから得られたcRT-PCRおよびRT-qPCR産物を比較することによって判別される。トランスクリプトターミニは、cRT-PCR産物のクローニングとシーケンシングによって決定され、次いでノーザンブロットによって検証されます。

この戦略を用いることで、トウモロコシミトコンドリオンにおける最も定常状態の転写物が決定された。いくつかのミトコンドリア遺伝子の複雑な転写パターンのために、いくつかの定常転写は、北部のブロットで検出されたが、分化および/またはマッピングされなかった。この戦略が他の植物ミトコンドリアまたはプラスティドで定常状態の転写物を差別し、マッピングするのに適しているかどうかは分かりません。

Introduction

植物ミトコンドリアでは、多くの成熟した前駆体RNAが複数のアイソフォームとして蓄積され、定常状態の転写物は5'終端1、2、3の差に基づいて2つのグループに分けることができる。 ⁴.一次転写物は、転写開始に由来する5'三リン酸端を有する。対照的に、処理された転写物は、転写後処理によって生成される5'モノリン酸を持っています。2種類の転写物の判別とマッピングは、転写および転写終了の成熟の基礎となる分子メカニズムを解明するために重要である。

植物ミトコンドリオンの一次転写物と加工トランスクリプトを区別するために、4つの主要な戦略が開発されました。最初の戦略は、5'三リン酸を一リン酸に変換し、一次転写物をRNAリゲスによって円形にすることを可能にするタバコ酸ピロホスファターゼ(TAP)でミトコンドリアRNAを前処理することです。TAP処理および非処理RNAサンプルの転写物の豊富さは、次いで、cDNA端部(RACE)または円形RT-PCR(cRT-PCR)2、3、4の迅速な増幅によって比較される。

Protocol

1. プライマーデザイン

1. プライマー設計17の一般的な規則に基づいてPCRプライマー設計ソフトウェア(材料の表)を用いた逆転転写(RT)のための遺伝子特異的プライマーを設計する。
   注:RTプライマーはターゲットトランスクリプトに非常に特異的であり、一般的にコーディングシーケンスの5'部分(成熟したmRNAおよび前駆体RNA)、または予想される5'終端(18Sおよび26S rRNA)の下流から〜500〜600 ntに固定されています。
2. cRT-PCRによって円形転写物を増幅する発散プライマーのペアを設計します。
   注:対になった発散プライマーは、円形トランスクリプトの5'-3'接合部に隣接しており、その位置は分析されたターゲットトランスクリプト間で異なります(図S1)。 一部のトランスクリプトには長い UtR があります。たとえば、nad2-1 5' UTR およびrps4-1 3' UTR はそれぞれ 1,985 および 1,826/1,834 nt です。両方のプライマーがコーディング領域に固定されている場合、ターゲットトランスクリプトを増幅することは困難です。対照的に、一部の UtR は短いです。たとえば、nad2....

Results

ミトコンドリアRNA循環効率の推定

以前の研究では、合計およびミトコンドリアRNAの両方がアラビドプシスにおけるミトコンドリア転写ターミナのcRT-PCRマッピングに使用され(アラビドプシス・タリアナ)、および2種類のRNAは同様のマッピング^結果12を与えた。当初は、トウモロコシのミトコンドリア転写ターミニのcRT-PCRマッピングにも合計RNAを用いた。多くの試行の後、ターゲットのトランスクリプトを検出するのは難しいことがわかりました。改善として、トウモロコシの開発カーネルからミトコンドリアRNAを濃縮し、1ラウンドのPCRで循環標的転写物の増幅を可能にしました。

濃縮後の標的転写物の容易な増幅を説明するために、代.......

Discussion

以前の研究では、アラビドプシスの細胞懸濁培養物からの合計およびミトコンドリアRNAをcRT-PCRによるミトコンドリア転写テルミニーニのマッピングに使用し、同様の結果^が12を得た。しかし、他の多くの研究1、2、3、9においてミトコンドリア転写テルミニをマッピングするために濃縮されたミトコンドリアRNAのみが使用された。ミトコンドリアRNAの濃縮は、トウモロコシにおけるミトコンドリア転写ターミニのcRT-PCRマッピングの重要なステップであることがわかった。この濃縮後、循環ミトコンドリアRNAの比率が0.3%~3.7%から~30%(図3、図S2)に劇的に増加し、1ラウンドのPCRで円形標的転写物の増幅が.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酢酸アラ	ジン、中国	A112880	1x TAEバッファーの調製
Applied Biosystems 2720 サーマルサイクラー	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	4359659	PCR増幅用サーマルサイクラー
アスコルビン酸	Sigma-aldrich、米国	V900134	抽出バッファーの調製用
Biowest アガロース	バイオウエスト、スペイン	9012-36-6	PCRを分解するには製品とRNA
ウシ血清アルブミン	Sigma-aldrich, USA	A1933	抽出バッファーの調製用
ブロモフェノールブルー	Sigma-aldrich, USA	B8026	アガロースゲル電気泳動およびノーザンブロット用ローディングバッファーの調製
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	RNase
DIG Northernスターターキット	ロシュ, USA	12039672910	DIG-RNA標識およびノーザンブロット用。このキットには、DIGおよびT7 RNAポリメラーゼによるRNAの転写標識、ハイブリダイゼーション、化学発光検出用の試薬が含まれています。
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	抽出バッファーおよび1x TAEバッファーの調製用
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	洗浄バッファーの調製
用 ゲルドキュメンテーションシステム	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	To image the agarose gel
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	アガロースゲル電気泳動用ローディングバッファーの調製用
GoldView II (5,000倍)	Solarbio、.中国	G8142	DNA 染色
Hybond-N+、ナイロン膜	Amersham Biosciences、USA	RPN119	ノーザンブロット
用 Image Lab	Bio-Rad、USA	Image Lab 3.0	Image gel、および PCR 産物の豊富さを比較します。
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	抽出緩衝液の調製について
中国	ジン島	P112284	抽出緩衝液の調製について
L-システイン	Sigma-aldrich, USA	V900399	抽出緩衝液の調製について
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	無菌抽出およびろ過による洗浄バッファー
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	粉砕されたカーネル組織をろ過するには
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	ノーザンブロット用ランニングバッファーの調製用
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	For RNA concentration and purity assay
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	洗浄
バッファーpEASY-Bluntシンプルクローニングベクター	の調製 TransGen Biotech、中国	CB111	ゲル回収バンドのクローニング。これは、挿入部位の数bps上流にT7プロモーターを含んでいます。
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase	宝、日本	2690	最初の鎖cDNAを合成するには
PureLink RNA Mini kit	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	12183025	For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	5' 三リン酸を一リン酸
に変換するには RNase inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	RNAセルフライゲーションおよび5'ポリホスファターゼ処理反応の成分であり、RNaseの活性を阻害するために使用されます。
酢酸ナトリウム	Sigma-aldrich, USA	V900212	ノーザンブロット用ランニングバッファーの調製用
ナトリウム	Sigma-aldrich, USA	V900058	20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	For RNA circularization
Tetrasodiumピロリン酸	Sigma-aldrich, USA	221368	抽出バッファーの調製用
TIANgel midi 精製キット	Tiangen Biotech, China	DP209	アガロースゲルからDNA断片を精製する
Tris	Aladdin, China	T110601	1x TAEバッファーTRIzol試薬を調製する
	Invitrogen, USA	15596026	ミトコンディラルRNAを抽出する。
ユニバーサルDNA精製キット	Tiangen Biotech, China	DP214	制限酵素消化反応から直鎖状プラストミドを回収するため
キシレンシアノールFF	Sigma-aldrich, USA	X4126	アガロースゲル電気泳動用ローディングバッファーの調製用