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方法論記事

円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング

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DOI:

10.3791/60019

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2019年7月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

この記事について

サマリー

円形RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'ポリホスファターゼ処理、ノーザンブロットを組み合わせることで、循環RT-PCRベースの戦略を提示する。このプロトコルには、不安定な5'三リン酸の影響を最小限に抑えるための正規化ステップが含まれており、トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次および処理された転写物を識別およびマッピングするのに適しています。

要約

植物ミトコンドリアでは、一部の定常転写物は転写開始(一次転写)に由来する5'三リン酸を有し、他のものは転写後に生成された5'モノリン酸(処理された転写物)を含む。2種類の転写物を区別するために、いくつかの戦略が開発され、それらのほとんどは5'三リン酸の存在/不在に依存しています。しかし、原発5'ターミニーニにおける三リン酸は不安定であり、2種類の転写物の明確な判別を妨げる。トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別してマッピングするために、cRT-PCR、RNA 5'ポリフォシュパターゼ処理、定量的な組み合わせにより、循環RT-PCR(cRT-PCR)ベースの戦略を開発しました。RT-PCR (RT-qPCR)、およびノーザン ブロット。改善として、この戦略は、不安定な5'三リン酸の影響を最小限に抑えるためのRNA正規化ステップを含む。

このプロトコルでは、濃縮されたミトコンドリアRNAは、RNA 5'ポリホスファターゼによって前処理され、5'トリフショファトを一リン酸に変換する。円形化および逆転転写後、5'ポリホスファターゼおよび非処理RNAに由来する2つのcDNは、処理された5'末端を有し、5'ポリホスファターゼに無感覚であるトウモロコシ26S成熟rRNAによって正規化される。正規化後、一次転写物と処理された転写物は、治療されたRNAおよび非処理されたRNAから得られたcRT-PCRおよびRT-qPCR産物を比較することによって判別される。トランスクリプトターミニは、cRT-PCR産物のクローニングとシーケンシングによって決定され、次いでノーザンブロットによって検証されます。

この戦略を用いることで、トウモロコシミトコンドリオンにおける最も定常状態の転写物が決定された。いくつかのミトコンドリア遺伝子の複雑な転写パターンのために、いくつかの定常転写は、北部のブロットで検出されたが、分化および/またはマッピングされなかった。この戦略が他の植物ミトコンドリアまたはプラスティドで定常状態の転写物を差別し、マッピングするのに適しているかどうかは分かりません。

概要

植物ミトコンドリアでは、多くの成熟した前駆体RNAが複数のアイソフォームとして蓄積され、定常状態の転写物は5'終端1、2、3の差に基づいて2つのグループに分けることができる。 4.一次転写物は、転写開始に由来する5'三リン酸端を有する。対照的に、処理された転写物は、転写後処理によって生成される5'モノリン酸を持っています。2種類の転写物の判別とマッピングは、転写および転写終了の成熟の基礎となる分子メカニズムを解明するために重要である。

植物ミトコンドリオンの一次転写物と加工トランスクリプトを区別するために、4つの主要な戦略が開発されました。最初の戦略は、5'三リン酸を一リン酸に変換し、一次転写物をRNAリゲスによって円形にすることを可能にするタバコ酸ピロホスファターゼ(TAP)でミトコンドリアRNAを前処理することです。TAP処理および非処理RNAサンプルの転写物の豊富さは、次いで、cDNA端部(RACE)または円形RT-PCR(cRT-PCR)2、3、4の迅速な増幅によって比較される。第2の戦略では、処理された転写物は、まずターミネータ5'-リン酸塩依存性エキノールクレアーゼ(TEX)を使用してミトコンドリアRNAから枯渇し、残された一次転写物はプライマー延長分析5、6によってマッピングされる。.第3の戦略は、グアニルトランスフェラーゼを使用して一次転写物をプレキャップし、その後、トリリン化された5'ターミニの位置は、リボヌクレアーゼまたはS1ヌクレアーゼ保護分析7、8と一緒にプライマー延長によって決定されます 、9.5'三リン酸の有無に応じて異なり、第4の戦略は、インビトロ転写、部位指向変異形成、およびプライマー拡張分析を組み合わせて、形成促進剤を特徴付け、転写を決定する開始サイト8,10,11.これらの戦略を使用することにより、多くの一次および処理された転写物は、植物ミトコンドリアで決定されている。

しかし、いくつかの研究は、一次転写物の5'三リン酸が不安定であり、それらは2、4、12、13の未知の理由で簡単に一リン酸塩に変換されたと報告している。この問題は、5'三リン酸の有無に応じて技術を使用して、2種類の転写物の明確な差別を妨げ、および植物の一次転写と処理された転写物を系統的に区別する以前の努力を妨げるミトコンドリアは失敗した 2,12.

このプロトコルでは、cRT-PCR、RNA 5'ポリホスファターゼ処理、RT-qPCR、およびノーザンブロットを組み合わせて、トウモロコシに安定に蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別する(Zeamays)ミトコンドリオン(図1)。cRT-PCRは、RNA分子の5'および3'四肢の同時マッピングを可能にし、通常、植物2、12、14、15における転写ターミニをマッピングするように適応される。RNA 5' ポリホスファターゼは、三リン酸化された5'テルミニから2つのリン酸塩を除去することができ、これはRNAリガーゼによる自己ライゲーションのために一次転写物を利用できるようにする。以前の研究では、トウモロコシの成熟した26S rRNAが5'終産を処理し、RNA 5'ポリホスファターゼ1、16に対して無感覚であったことが示された。原発5'ターミニニにおける不安定な三リン酸の影響を最小限に抑えるために、5'ポリホスホナーゼ処理および非処理RNAは成熟した26S rRNAによって正規化され、その後、一次および処理された転写物は、2つのRNAサンプルから得られたcRT-PCR産物。cRT-PCR マッピングと判引結果は、それぞれノーザン ブロットと RT-qPCR によって検証されます。最後に、代替プライマーは、cRT-PCRではなく、北部ブロットで検出されたそれらの転写物を増幅するために使用されます。このcRT-PCRベースの戦略を使用することにより、トウモロコシミトコンドリオンのほとんどの定常状態の転写物が区別され、マッピングされた1.

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プロトコル

1. プライマーデザイン

  1. プライマー設計17の一般的な規則に基づいてPCRプライマー設計ソフトウェア(材料の表)を用いた逆転転写(RT)のための遺伝子特異的プライマーを設計する。
    注:RTプライマーはターゲットトランスクリプトに非常に特異的であり、一般的にコーディングシーケンスの5'部分(成熟したmRNAおよび前駆体RNA)、または予想される5'終端(18Sおよび26S rRNA)の下流から〜500〜600 ntに固定されています。
  2. cRT-PCRによって円形転写物を増幅する発散プライマーのペアを設計します。
    注:対になった発散プライマーは、円形トランスクリプトの5'-3'接合部に隣接しており、その位置は分析されたターゲットトランスクリプト間で異なります(図S1)。 一部のトランスクリプトには長い UtR があります。たとえば、nad2-1 5' UTR およびrps4-1 3' UTR はそれぞれ 1,985 および 1,826/1,834 nt です。両方のプライマーがコーディング領域に固定されている場合、ターゲットトランスクリプトを増幅することは困難です。対照的に、一部の UtR は短いです。たとえば、nad2 -1 および nad4-1 の 3' A7 は 34/35 と 29-31 nt で、それぞれ1です。ペアリングされたプライマーがコーディングシーケンスから遠く離れている場合、PCRは失敗します。一般に、2組の発散プライマーはターゲットトランスクリプトごとに設計されていますが、トランスクリプトパターンが複雑でUtRが非常に長いペアをマッピングするには複数のペアが必要な場合があります。
  3. ノーザンブロット用のRNAプローブを調作成するために、収束プライマーのペアを設計します。
    注:対になったプライマーは標的遺伝子のコード領域に位置し、PCR産物のサイズは100~1,000bpの範囲でなければなりません。各フォワードプライマーは、得られるプローブ内のベクター配列を最小限に抑えるための制限酵素部位を含める必要があります。

2.トウモロコシ開発カーネルからの原油ミトコンドリオンの調製

  1. オートクレーブで害虫、モルタル、ガラス漏斗、チューブ、先端を殺菌し、オーブンで乾燥させます。
  2. 4 °Cまたは氷の上ですべての手順を実行し、すべての溶液を事前に冷却します。
  3. 抽出バッファー(EB)の100mLを調製し、0.3Mショ糖、5mMピロリン酸、10mMKH2PO4、2mM EDTA、1%[w/v]ポリビニルピロリドン40、1%[w/v]ウシ血清アルブミン、5mM L-システイン、および2mKOHでpH 7.3に調整し、濾過によって殺菌する。
  4. 0.3Mスクロース、1mM EGTA、および10mM MOPS(3-(N-モルフォリーノ)プロパンスルホン酸からなる100mLの洗浄バッファー(WB)を調製する。NaOHでpH 7.2に調整し、濾過で殺菌します。
    注:DEPC処理脱イオン化H2Oを用いてEBおよびWBを調製することが示唆される。
  5. 受粉(DAP)後11~20日で20gのカーネルを氷の上に置いた50mLチューブに集め、カーネルを予め冷却されたモルタルに移します。
    注:トウモロコシカーネルの20gにEBの100 mLの比率を使用してください。
  6. 各モルタルに10~20mLの冷たいEBを加え、カーネルを完全に粉砕します。
  7. EBを追加し、2層のフィルタークロス(材料の表)を通して地面組織をフィルタリングします。
  8. 濾液を8,000 x gで10分間遠心分離し、ペレットを捨てます。
  9. 上清を新しいチューブに移し、20,000 x gで10分間遠心分離します。
  10. 上清を注ぎ、6 mL WBでペレットを再中断します。
  11. サスペンションを5本の1.5mL RNaseフリーチューブに付け、14,000 x gで5分間遠心分離します。
  12. 上清を捨て、液体窒素中のミトコンドリアペレットを凍結し、-80°Cに保存する。

3. ミトコンドリアRNAの抽出

  1. 製造の指示に従って市販の試薬(材料の表)でミトコンドリアRNAを抽出します。
    注意:この試薬には、フェノールとグアニジンイソチオシアネートが含まれています。ヒュームフードで作業し、ラボコートと手袋を着用してください。
  2. DEPC処理脱イオン化H2Oで単離されたミトコンドリアRNAを溶解し、分光光度計(材料表)でRNA濃度と純度を推定する。
    注:一般に、〜250 μgミトコンドリアRNAは、15-DAPトウモロコシカーネルの20gから得られる。
  3. 1x TAEバッファー(40mMトリス、20mM酢酸、1mM EDTA)、1.5%アガロース(材料表)、および1x核染色染料(材料表)で構成された1つのアガロースゲルを調調します。
  4. 10xローディングバッファー(0.5%ブロムフェノールブルー、0.5%キシレンシアノールFF、および50%グリセロール)の適切な容積を追加し、1.5%アガロースゲルにミトコンドリアRNA/ローディングバッファー混合物をロードします。
  5. ゲルを1x TAEバッファーで20~25分間5~6V/cmで実行し、ゲルドキュメンテーションシステム(材料表)でゲルをイメージングしてミトコンドリアRNAの完全性を評価します。
    注:2つの異なるバンド(トウモロコシミトコンドリア26Sおよび18S rRNAの場合は〜3,510および〜1,970 nt)の存在は、無傷のミトコンドリアRNAに対して許容可能な標準である。可能な分解を排除するには、循環RNA調製の複数のステップの間にRNAの完全性を調べるべきである(図2)。

4. RNA 5'ポリホスファターゼ処理

  1. RNA 5' ポリホスファターゼ (表および材料)処理 (表1) をセットアップし、37 °C で 30~ 60 分間インキュベートします。
  2. 製造元の指示に従って、RNA精製キット(材料の表)で5'ポリホスファターゼ処理RNAを回収します。
  3. 手順 3.3 から 3.5 を繰り返します。

5. RNAの円形化

  1. 5'ポリホスファターゼ処理および非処理ミトコンドリアRNA(表2)の同量を用いて2つの円形化反応を調製し、12〜16時間16°Cで両方の反応をインキュベートする。
  2. ステップ 4.2 と同じキットを使用して、2 組のセルフ ライゲーション RNA を回復します。
    注:なお、ミトコンドリアRNAのほんの一部のみが自己ライゲーションされ、回収されたRNAは線形および円形転写物の混合物となることに留意すべきである。
  3. 手順 3.3 から 3.5 を繰り返します。

6. 逆転写

  1. 同じ量の円形5'ポリホスファターゼ処理および非処理RNA(200 ng)から2組のcDNを合成する。
  2. 26S-CRTと最大7つの他のRTプライマーの等しい比率を追加することにより、プライマー混合物を調製します。
    注:プライマー混合物の最終濃度は1μMでなければなりません。
  3. 表3に記載されている試薬を組み合わせて2つの前混合物を調製し、65°Cで5分間インキュベートし、氷の上で2分間冷やします。
  4. 2つのRT反応システム(表4)を組み立て、42°Cで50分間インキュベートします。
  5. 両方のRT反応を70°Cで5分間加熱し、氷の上で冷やします。

7. 正規化

  1. 5'ポリホスファターゼ処理または非処理RNAに由来する同じ体積のテンプレートcDNを添加して2つのPCR反応を調製し、円形26S rRNAの5'-3'接点を横切る発散プライマー(すなわち26S-CF1および-CR1)など(表5)。
  2. 表6に記載の条件下で、熱サイクラー(材料の表)で2つの反応を実行します。
  3. 1x TAEバッファー、1.0%アガロース、および1x核染色染料で構成された1つのアガロースゲルを準備します。
  4. 2 μL 10xローディングバッファー(0.5%ブロモフェノールブルー、0.5%キシレンシアノールFF、および50%グリセロール)を2つのPCR製品のそれぞれに加え、ゲルにロードします。
  5. 1x TAEバッファでゲルを5~6V/cmで30~40分間実行し、ステップ3.5と同じゲルドキュメンテーションシステムを使用して画像を作成します。
  6. コンピュータソフトウェア(材料表、図4A)を用いて2つのPCR製品の豊富さを比較し、必要に応じてテンプレートcDNAの量を変更して正規化を最適化します。

8. PCR増幅

  1. 正規化されたcDNの適切な体積と、標的転写物の5'-3'接合部に隣接する発散プライマーのペアを加えることによって、PCR反応のペアを調製する(表7)。
    注:標的転写物のPCR増幅に使用されるテンプレートcDNの量は、26S rRNA正規化結果によって決定される。
  2. 表8に記載のプログラムに従ってPCR反応を実行する。
  3. 手順 7.3 から 7.5 を繰り返します。
  4. ネストされた発散プライマーに変更し、手順 8.1 と 8.2 を繰り返して最初のラウンド PCR 結果を確認します。
  5. 手順 7.3 から 7.5 を繰り返します。
  6. ゲルDNA回収キット(材料の表)を使用して、2ラウンドのPCR増幅で繰り返すことができる顕著なバンドを回収する。

9. トランスクリプトターミニの決定

  1. 標準的な技術を使用して、ゲル精製PCR製品を鈍エンドベクター(材料の表)にクローンします。
  2. コロニーPCRを実行して、ターゲットインサートを含む正のクローンを選択し、それらを商業的に配列します。
    注:可変サイズのインサートを含む正のクローンは、植物ミトコンドリアの多くの定常状態転写物が不均一な5'および/または3'終端1、12を有するので、通常、単一の回収されたバンドから検出される。
  3. バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の基本的な局所アライメント検索ツール(BLAST)を使用して、シーケンシングデータをトウモロコシミトコンドリアゲノムと位置合わせします。微生物を選ぶ「トウモロコシ(タキド:4577)」と検索データベース「ヌクレオチドコレクション(nr/nt)」を選択します。
  4. 円形トランスクリプトの5'-3'ジャンクションを見つけ、5'と3'トランスクリプトターミニの位置を決定します。
  5. ターゲットトランスクリプトのサイズを計算します。

10. RNAゲルブロットハイブリダイゼーションによるcRT-PCRマッピング結果の検証

注:RNAゲルブロットハイブリダイゼーションは、ジゴキシゲニン(DIG)およびT7 RNAポリメラーゼを用いたRNAの転写標識用試薬を含む市販キット(材料表)を用いて行われ、ハイブリダイゼーションおよび免疫学的検出が行われる。詳細については、このキットで提供されるプロトコルを参照してください。手順全体に RNase フリー機器のみが使用されていることを確認します。

  1. RNAプローブを調作成するために使用されるDNA断片を増幅し、挿入部位の上流にT7プロモーター17bpを含むステップ9.1と同じベクターにクローンします。
  2. 適切な制限酵素を用いて構築物を線形化し、DNA精製キット(材料表)により線形プラスミドを回収し、DEPC処理脱イオン化H2Oに溶解する。
  3. 製造元の指示に従って、市販キット(材料の表)によってDIG-11-UTPを用いてRNAプローブにラベルを付けます。
  4. DEPC処理脱イオン化H2 O.をNaOHでpH 7.0に調整し、濾過により殺菌する10x MOPSバッファー(0.2M MOPS、50mM酢酸ナトリウム、および10mM EDTA)の500mLを調製します。
  5. 2~3体のロードバッファー(50%ホルムアミド、6.2%ホルムアルデヒド、1x MOPS、10%グリセロール、0.1%ブロモフェノールブルー)をステップ3.1~3.3で調製したミトコンドリアRNAに添加します。
  6. RNAサンプル/ローディングバッファー混合物を65°Cで10分間変性させ、氷上で1分間冷やします。
  7. 変性アガロースゲル(2%ホルムアルデヒド、1.2%アガロース、および1x MOPS)を調作し、RNAサンプル/ローディングバッファー混合物をゲル(ウェルあたり1-2 μgミトコンドリアRNA)にロードします。
  8. 約4時間3-4V/cmで1x MOPSでゲルを実行します。
  9. 20x SSCの2Lを調(3M NaCl、0.3Mク硝酸ナトリウム、pH 7.0)を調出します。一晩0.1%のDEPCでそれを処理し、オートクレーブで殺菌します。
  10. ゲルを20x SSC(毎回15分)で2回すすぎ、10~16時間20倍のSSCで毛細管転写によりナイロン膜(材料表)にゲルRNAを移します。
  11. 120°Cで30分間焼いて膜にRNAを固定します。
  12. 製造元の指示に従って、市販キット(材料の表)を使用してRNAハイブリダイゼーションと免疫学的検出を行います。

11. 一次と処理された5'の終わりの差別

  1. 一次および処理された5'終了を識別し、正規化された5'ポリホスファターゼ処理および非処理RNAから得られたcRT-PCR産物を比較することによって終了する。
    注:一次転写物に対して、5'ポリホスファターゼ処理RNAからのPCR産物の豊富さは、非処理対応物からのものよりもはるかに高い(図1、'遺伝子A'、および図4A)。しかし、処理された転写物に対しては、同等のレベルのPCR産物が、ミトコンドリアRNAの2組から増幅されるであろう(図1、'Gene B')。
  2. cRT-PCR マッピング結果に基づいて RT-qPCR プライマーを設計します。
  3. RT-qPCR による cRT-PCR 判別結果を確認します。
    注:5'ポリホスファターゼ処理および非処理RNAに由来する2つのcDNAサンプルは、26S成熟rRNAのRT-qPCR産物によって正規化される。

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結果

ミトコンドリアRNA循環効率の推定

以前の研究では、合計およびミトコンドリアRNAの両方がアラビドプシスにおけるミトコンドリア転写ターミナのcRT-PCRマッピングに使用され(アラビドプシス・タリアナ)、および2種類のRNAは同様のマッピング結果12を与えた。当初は、トウモロコシのミトコンドリア転写ターミニのcRT-PCRマッピングにも合計RNAを用いた。多くの試行の後、ターゲットのトランスクリプトを検出するのは難しいことがわかりました。改善として、トウモロコシの開発カーネルからミトコンドリアRNAを濃縮し、1ラウンドのPCRで循環標的転写物の増幅を可能にしました。

濃縮後の標的転写物の容易な増幅を説明するために、代...

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ディスカッション

以前の研究では、アラビドプシスの細胞懸濁培養物からの合計およびミトコンドリアRNAをcRT-PCRによるミトコンドリア転写テルミニーニのマッピングに使用し、同様の結果が12を得た。しかし、他の多くの研究1、2、3、9においてミトコンドリア転写テルミニをマッピングするために濃縮されたミトコンドリアRNAのみが使用された。ミトコンドリアRNAの濃縮は、トウモロコシにおけるミトコンドリア転写ターミニのcRT-PCRマッピングの重要なステップであることがわかった。この濃縮後、循環ミトコンドリアRNAの比率が0.3%~3.7%から~30%(図3、図S2)に劇的に増加し、1ラウンドのPCRで円形標的転写物の増幅が...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第31600250号、Y.Z.)、広州市科学技術プロジェクト(助成金第201804020015号、H.N.)、中国農業研究システム(助成金なし)によって支援されました。CARS-04-PS09,H.N.)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸アラジン、中国A1128801x TAEバッファーの調製
Applied Biosystems 2720 サーマルサイクラーサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国4359659PCR増幅用サーマルサイクラー
アスコルビン酸Sigma-aldrich、米国V900134抽出バッファーの調製用
Biowest アガロースバイオウエスト、スペイン9012-36-6PCRを分解するには製品とRNA
ウシ血清アルブミンSigma-aldrich, USAA1933抽出バッファーの調製用
ブロモフェノールブルーSigma-aldrich, USAB8026アガロースゲル電気泳動およびノーザンブロット用ローディングバッファーの調製
DEPCSigma-aldrich, USAV900882RNase
DIG Northernスターターキットロシュ, USA12039672910DIG-RNA標識およびノーザンブロット用。このキットには、DIGおよびT7 RNAポリメラーゼによるRNAの転写標識、ハイブリダイゼーション、化学発光検出用の試薬が含まれています。
EDTASigma-aldrich, USAV900106抽出バッファーおよび1x TAEバッファーの調製用
EGTASigma-aldrich, USAE3889洗浄バッファーの調製
用 ゲルドキュメンテーションシステムBio-Rad, USAGel Doc XR+To image the agarose gel
GlycerolSigma-aldrich, USAG5516アガロースゲル電気泳動用ローディングバッファーの調製用
GoldView II (5,000倍)Solarbio、.中国G8142DNA 染色
Hybond-N+、ナイロン膜Amersham Biosciences、USARPN119ノーザンブロット
用 Image LabBio-Rad、USAImage Lab 3.0Image gel、および PCR 産物の豊富さを比較します。
KH2PO4Sigma-aldrich, USAV900041抽出緩衝液の調製について
中国ジン島P112284抽出緩衝液の調製について
L-システインSigma-aldrich, USAV900399抽出緩衝液の調製について
MillexMillipore, USASLHP033RB無菌抽出およびろ過による洗浄バッファー
MiraclothCalbiochem, USA475855-1R粉砕されたカーネル組織をろ過するには
MOPSSigma-aldrich, USAV900306ノーザンブロット用ランニングバッファーの調製用
NanoDropThermo Fisher Scientific, USA2000CFor RNA concentration and purity assay
NaOHSigma-aldrich, USAV900797洗浄
バッファーpEASY-Bluntシンプルクローニングベクターの調製 TransGen Biotech、中国CB111ゲル回収バンドのクローニング。これは、挿入部位の数bps上流にT7プロモーターを含んでいます。
Phanta max super-fidelity DNA polymeraseVazyme, ChinaP505DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40Sigma-aldrich, USAV900008For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, USAPrimer Premier 6.24To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase宝、日本2690最初の鎖cDNAを合成するには
PureLink RNA Mini kitサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国12183025For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphataseEpicentre, USARP8092H5' 三リン酸を一リン酸
に変換するには RNase inhibitorNew England Biolabs, UKM0314RNAセルフライゲーションおよび5'ポリホスファターゼ処理反応の成分であり、RNaseの活性を阻害するために使用されます。
酢酸ナトリウムSigma-aldrich, USAV900212ノーザンブロット用ランニングバッファーの調製用
ナトリウムSigma-aldrich, USAV90005820x SSC
SsoFas evaGreen supermixesBio-Rad, USA1725202For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437For RNA circularization
Tetrasodiumピロリン酸Sigma-aldrich, USA221368抽出バッファーの調製用
TIANgel midi 精製キットTiangen Biotech, ChinaDP209アガロースゲルからDNA断片を精製する
TrisAladdin, ChinaT1106011x TAEバッファーTRIzol試薬を調製する
Invitrogen, USA15596026ミトコンディラルRNAを抽出する。
ユニバーサルDNA精製キットTiangen Biotech, ChinaDP214制限酵素消化反応から直鎖状プラストミドを回収するため
キシレンシアノールFFSigma-aldrich, USAX4126アガロースゲル電気泳動用ローディングバッファーの調製用
の不活性化 アラ 塩化

参考文献

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